正交實驗法提取茶葉中咖啡因的工藝研究

王船英，桑 蕾，邾枝花，許玉芳

(安徽醫(yī)學高等?？茖W校，安徽 合肥 230601)

咖啡因(1,3,7-三甲基-2,6-二氧嘌呤)為白色粉末或白色針尖狀晶體，易溶于熱水、乙醇、三氯甲烷，熔點為234～238℃，178℃時升華?？Х纫蚴且环N生物堿，廣泛存在于咖啡豆、可可和茶葉中?？Х纫蚴且环N重要的醫(yī)藥原料，可以消除疲勞，減弱酒精、嗎啡、煙堿等物質(zhì)的毒害，促進血液循環(huán)，預防高血壓和心肌梗塞，具有抗氧化、抗衰老等作用[1-3]，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱、偏頭痛等疾病[4]。

從茶葉中提取咖啡因的提取方法包括水提法、有機溶劑提取法、超聲輔助提取法、超臨界CO2提取法等。這些提取方法各有優(yōu)缺點。水提法溶劑成本低、綠色環(huán)保、但濃縮時間長、提取率低。有機溶劑提取法，通常以甲醇、乙醇、丙酮或三氯甲烷作為溶劑提取咖啡因。乙醇作為提取溶劑，其提取率高，且濃縮蒸餾出來的乙醇可以回收使用，綠色、安全。甲醇、丙酮、三氯甲烷這些有機溶劑易揮發(fā)，毒性大，考慮到綠色環(huán)保、安全的原則，一般不會使用這些有機溶劑。直接升華法、超聲輔助法和超臨界CO2提取法，提取率高，節(jié)能環(huán)保，但在學生實驗中運用不多[5]。現(xiàn)結(jié)合實驗室條件和其他各方面因素，綜合考慮，選擇以乙醇為提取劑進行提取實驗，首先進行單因素考察，再根據(jù)單因素考察的結(jié)果設計正交實驗，優(yōu)化提取工藝。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

市售綠茶、紅茶、白茶。

乙醇(分析純)、氧化鈣(分析純)、沸石、咖啡因?qū)φ掌?購于成都麥德生科技有限公司)、甲醇(色譜純)、純化水。

索氏提取器、蛇形冷凝管、蒸餾裝置、電加熱套、酒精燈、漏斗、蒸發(fā)皿、玻璃棒、濾紙、紗布袋、0.45 μm有機濾膜、電子天平(上海越平)、高效液相色譜儀(Waters 1525-2489)、色譜柱(C18，5 μm×4.6 mm×250 mm，大連依利特公司)、顯微熔點測定儀(北京科學儀器有限公司，XT4B型)。

1.2 實驗方法

取適量茶葉置于研缽中，研磨成粉末。稱取10 g碎茶葉末置于濾紙?zhí)淄仓?，以乙醇為提取劑，用索氏提取裝置連續(xù)提取60 min，然后蒸餾，濃縮提取液，倒入蒸發(fā)皿中，加入氧化鈣后進行焙炒至干。用扎好小孔的濾紙扣在蒸發(fā)皿上，倒扣上玻璃漏斗，漏斗頸處放一團脫脂棉，酒精燈加熱，升華至有棕色煙霧產(chǎn)生，得咖啡因晶體。稱量后計算咖啡因產(chǎn)量。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素設計

2.1.1 茶葉種類

茶葉的種類有很多，常見的有綠茶、紅茶、白茶等。本實驗選用市售綠茶、紅茶、白茶。按1.2實驗方法，分別稱取10 g綠茶、紅茶、白茶，平行進行3次實驗，以95%乙醇為提取劑，連續(xù)提取60 min，升華時間5 min。升華出咖啡因晶體質(zhì)量如表1所示。通過實驗數(shù)據(jù)可以看出，其他實驗條件相同時，從紅茶中提取出的咖啡因質(zhì)量高于綠茶，白茶中咖啡因產(chǎn)量最低。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)

咖啡因易溶于乙醇，故選取乙醇為提取劑。稱取10 g綠茶，按1.2實驗方法，分別采用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇為提取劑各平行實驗3次，提取時間60 min，升華時間5 min。最終得到咖啡因晶體質(zhì)量如表2所示。可以看出，三種體積分數(shù)的乙醇提取出的咖啡因晶體質(zhì)量差別較大，其中95%乙醇作為提取劑，提取出的晶體質(zhì)量最大。

表2 不同濃度乙醇提取出咖啡因晶體的質(zhì)量

2.1.3 提取時間

按1.2實驗方法，稱取10 g綠茶，以95%乙醇為提取劑，分別提取60 min、90 min、120 min、150 min，平行實驗3次，每次升華時間5 min。得到咖啡因晶體質(zhì)量見表3?？梢钥闯?，提取時間對咖啡因產(chǎn)率影響較大，提取時間越長，咖啡因產(chǎn)率越高。提取150 min的咖啡因產(chǎn)量最高，相較于提取120 min的產(chǎn)量，增幅不明顯。

表3 不同提取時間提取出晶體的質(zhì)量

2.1.4 茶葉包材質(zhì)

按1.2實驗方法，取綠茶10 g，分別置于無紡布袋中、濾紙?zhí)淄仓泻图啿即?，?5%乙醇為提取劑，連續(xù)提取60 min，平行實驗3次。考察茶葉包材質(zhì)對實驗結(jié)果的影響。通過表4中實驗結(jié)果可以看出，幾次實驗后，咖啡因產(chǎn)量差別不大。因此，可以判定茶葉包材質(zhì)對咖啡因產(chǎn)量影響不大，該因素可以忽略。

表4 不同茶葉包材質(zhì)提取出晶體的質(zhì)量

2.1.5 升華時間

稱取綠茶10 g，置于濾紙?zhí)淄仓?，?5%乙醇為提取劑，連續(xù)提取60 min后濃縮，加入氧化鈣后焙炒至干燥。干燥粉狀物分別升華5 min、8 min、10 min、12 min，得到咖啡因質(zhì)量如表5所示。通過該實驗可以看出，升華時間對晶體的質(zhì)量有影響，升華10 min，咖啡因質(zhì)量最高，升華12 min時咖啡因質(zhì)量略有下降。

表5 不同升華時間提取出晶體的質(zhì)量

2.2 正交實驗設計

2.2.1 正交實驗影響因素確立及水平的選擇

通過單因素各項考察結(jié)果可以看出，茶葉種類A、乙醇體積分數(shù)B、提取時間C、升華時間D對茶葉中咖啡因提取的影響較大，選取這4個因素為考察因素，以咖啡因晶體質(zhì)量為評價指標，設計L9(34)4因素3水平正交實驗，優(yōu)化茶葉中提取咖啡因的工藝。影響因素及水平見表6。

表6 因素水平一覽表

2.2.2 正交實驗結(jié)果

表7中R為各因素的極差，反映了各因素影響實驗結(jié)果的主次關系。R越大，說明該因素對實驗指標的影響越大，該因素也就越重要[6]。由極差分析結(jié)果可以看出，4個因素對咖啡因提取產(chǎn)量的影響大小程度依次為A>C>B>D。從表7可得出，正交實驗范圍內(nèi)的較優(yōu)的提取條件為A2C3B3D3，即選取紅茶為原料，提取劑為95%乙醇，提取120 min，升華時間10 min，咖啡因產(chǎn)量最高。

表7 正交實驗結(jié)果

2.3 樣品熔點測定

提取出的晶體外觀為白色針尖狀，如圖1所示。取適量晶體，利用熔點測定儀對其熔點進行測定，測得該晶體樣品熔點為234.5℃，與《中華人民共和國藥典》中對于咖啡因的熔點記錄相符[7]。該樣品熔程短，純度高。

圖1 咖啡因晶體

2.4 高效液相色譜分析

將咖啡因?qū)φ掌泛吞崛〕龅目Х纫驑悠?，分別精密稱取5 mg，用甲醇將其溶解、定容至50 mL容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的溶液。分別取5 mL對照品溶液和樣品溶液，經(jīng)0.45μm的有機濾膜濾過，備用。再取濾過溶液分別進行高效液相色譜分析。色譜條件：流動相為甲醇 ∶純化水(體積比40 ∶60)；流速為1 mL/min；檢測波長為 271 nm；進樣量20 μL。圖2為咖啡因?qū)φ掌芬合嗌V圖，圖3為實驗提取出的咖啡因樣品液相色譜圖。樣品溶液與咖啡因?qū)φ掌啡芤撼龇灞Ａ魰r間相同，可以確定該樣品為咖啡因。

圖2 咖啡因?qū)φ掌稨PLC圖譜

圖3 提取出的咖啡因樣品HPLC圖譜

3 結(jié)論

以普通市售茶葉為原料，采用索氏提取器連續(xù)提取，利用正交實驗方法，得出了最優(yōu)的工藝條件：選用紅茶為原料，用95%乙醇作提取劑，連續(xù)提取120 min，提取液經(jīng)蒸餾濃縮后焙炒至干，升華10 min，平行實驗3次，獲取升華出的咖啡因晶體分別為76.49 mg、75.18 mg、79.22 mg，平均產(chǎn)量為76.96 mg。3次實驗提取率高且具有重復性，說明該工藝條件合理、優(yōu)越。