基于CSE/H2S通路探討蔥白提取物干預大鼠動脈粥樣硬化的作用及機制

雷 杰 段剛峰 董 瑩 陳忠輝 夏 雯

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) 是一種慢性炎癥性血管疾病，病變涉及大、中動脈，其特征在于血管脂質積累、炎癥及免疫系統(tǒng)活化、氧化應激、內皮細胞活化、動脈平滑肌細胞增殖、巨噬細胞活化和泡沫細胞形成等導致內皮功能障礙。動脈粥樣硬化相關炎癥是由促炎性細胞因子、炎性信號通路和黏附分子介導。目前，胱硫醚γ裂解酶(cystathionine γ lyase，CSE)被證實可通過內源性合成硫化氫(hydrogen sulfide，HS)來減少血管內膜炎癥和抑制黏附分子表達以發(fā)揮保護血管的作用，故CSE/HS途徑是預防動脈粥樣硬化的重要治療靶標。

蔥白提取物是從雙子葉百合科植物分蔥(allium fisturosum L var．eaespitosum makio)的近根部的鱗莖中提取的活性成分。前期實驗發(fā)現(xiàn)，蔥白提取物能調節(jié)大鼠血脂水平、抑制血管內膜脂質沉著、調節(jié)免疫、抑制炎性細胞因子分泌，發(fā)揮抗AS的作用。但蔥白提取物抗AS的具體機制目前尚未完全清楚。為此，本實驗建立大鼠動脈粥樣硬化模型，用蔥白提取物進行干預，觀察、比較血脂、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)、基質金屬蛋白酶(MMP7、MMP9)、CSE的水平，探討蔥白提取物抗AS的作用機制。

材料與方法

1.實驗動物：健康純種SD大鼠40只，3～4月齡，體質量為200±20g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證編號：HNASLKJ20100330。

2.實驗藥品：蔥白提取物由雙子葉百合科植物分蔥的新鮮鱗莖經(jīng)冷凍干燥和超臨界CO萃取得到，干燥蔥白超臨界萃取的總得率在1.85%左右，相當于每54g干燥蔥白粉可萃取得到1g蔥白提取物，主要含有含硫化合物、甾體、皂苷、不飽和脂肪酸等化合物，濃度為25%。辛伐他汀(舒降之)片由杭州默沙東制藥有限公司提供。

3.實驗試劑：血脂檢測試劑盒均購自長春匯力生物技術有限公司；ELISA Kit購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Trizol購自美國Ambion公司(貨號：15596-026)；RNase H、5×HiScript Buffer購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(貨號:R101-01/02)；dNTP、Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA marker購自北京天根生化科技有限公司(貨號分別為CD117、ET105-01、MD114-02)；Random Primer(N6)購自日本TaKaRa公司(貨號:3801)；內參對照(GAPDH)購自杭州賢至生物有限公司(貨號：AB-P-R001)；一抗：基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)購自武漢三鷹生物技術有限公司(貨號:10374-2-AP);基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion,VCAM-1)購自美國Affinity公司(貨號分別為AF0220、DF6082);細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion,ICAM-1)購自英國Abcam公司(貨號:Ab179707)；CSE購自武漢愛博泰克生物科技有限公司(貨號：A11727)；HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司(貨號：BA1054)。

4.實驗儀器：JT-12J電腦生物組織脫水機購自武漢俊杰電子有限公司；RM 2016輪轉式切片機購自德國Leica公司；BX53型生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；JK-6生物組織攤烤片機購自武漢俊杰電子有限公司；全自動生化分析儀購自美國Rayto公司；離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自日本ASONE 公司；FlexStation 3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices 公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；電轉儀購自北京六一儀器廠。

5.動物分組、造模及給藥：將實驗動物編號，隨機分為正常組、模型組、蔥白提取物組、辛伐他汀組，每組10只。參照郭延松等的方法制備動脈粥樣硬化模型，第5周開始，按照《人和動物及各類動物間藥物劑量的換算方法》，以成人每日服用劑量換算為大鼠用藥量，蔥白提取物組大鼠給予蔥白提取物600mg/kg灌胃，給藥體積10ml/kg，辛伐他汀組給予辛伐他汀混懸液600mg/kg灌胃，給藥體積10ml/kg。正常組、模型組均給予等容積0.9%氯化鈉溶液10ml/kg灌胃，連續(xù)8周。

6.標本采集：第12周，各組大鼠禁食過夜，從腹腔注射戊巴比妥麻醉后，腹主動脈取血，繼之插管入升主動脈。先用0.9%氯化鈉溶液沖洗，解剖后取下整段主動脈，部分灌注含1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1mol/L磷酸緩沖液備用，部分主動脈置于-80℃冰箱備用。

7.主動脈病理學觀察：取大鼠主動脈制備病理切片，進行Masson染色。

8.檢測血脂水平：全自動生化分析儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)水平； ELISA法檢測血清載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)水平。

9.RT-PCR檢測大鼠主動脈ICAM-1、VCAM-1、CSE及心肌CSE mRNA表達水平：Trizol法提取大鼠主動脈組織RNA。再依次加入Oligo (dT) 18(10μmol/L) 2μg、dNTP (2.5mmol/L) 4μg、5×Hiscript Buffer 4μg、Hiscript Reverse Transcriptase 1μg、Ribonuclease Inhibitor 0.5μg、RNA 4μl，最后用ddHO滴定至20μl，分別于25℃孵育5min，50℃孵育15min，85℃孵育5min，4℃孵育10min。實時熒光定量PCR檢測，將cDNA稀釋8倍，以Rat GAPDH為內參，經(jīng)過95℃預變性10min，再循環(huán)重復95℃變性15s、60℃退火延伸60s共40次，最后60℃ 60s、95℃ 15s溶解曲線采集。用QPCR算法(相對定量，2-法)進行相對表達量計算。所用引物序列詳見表1。

10.Western blot法檢測主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、CSE表達水平：制備蛋白樣品，測定蛋白濃度，計算蛋白上樣量,5×蛋白上樣緩沖液加熱使蛋白變性，制備電泳膠進行電泳分離，根據(jù)marker切下目的條帶進行電轉移(轉膜條件：MMP7：200mA 70min，MMP9、ICAM-1、VCAM-1：200mA 120min后300mA 15min，CSE、GAPDH：200mA 90min)，用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)封閉2h，用封閉液稀釋一抗(稀釋比例詳見表2)，4℃孵育過夜，洗去多余一抗，再加入稀釋的HRP標記羊抗兔二抗(1∶50000)，室溫搖床孵育2h，洗去多余二抗，顯色曝光，曬干膠片，用BandScan分析膠片灰度值，以兔多抗GAPDH作為內參。

結 果

1.主動脈Masson染色:正常組主動脈管壁厚度均勻，內膜光滑，膠原纖維和平滑肌細胞排列整齊。模型組管壁厚度不均勻，血管內膜增生，膠原纖維呈藍色染色，血管平滑肌細胞呈紅色染色，膠原染色不均，排列紊亂迂曲。與模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組管壁膠原纖維染色均勻，排列較為整齊，血管內膜增生較輕(圖1)。

2.血脂水平：與正常組比較，模型組TC、TG、LDL-C、ApoB水平均明顯升高(<0.05)，HDL-C水平明顯降低(<0.05)。與模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組TC、TG、LDL-C、ApoB水平均明顯降低(<0.05)，HDL-C水平明顯升高(<0.05),詳見表3。

3.大鼠主動脈ICAM-1、VCAM-1、CSE及心肌CSE基因mRNA表達水平：與正常組比較，模型組大鼠主動脈ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA表達均上調，主動脈及心肌CSE mRNA表達均下調。與模型組比較，蔥白提取物組與辛伐他汀組主動脈ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA表達均下調，主動脈及心肌CSE mRNA表達均上調(表4)。

4.主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、CSE表達水平：與正常組比較，模型組大鼠主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1表達均上調，CSE表達下調。與模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1表達均下調，CSE表達上調(表5、圖2)。

討 論

動脈粥樣硬化病變過程歷經(jīng)脂質條紋、纖維斑塊、粥樣斑塊，斑塊穩(wěn)定性降低、斑塊破裂甚至血栓形成。目前大量研究證實，血脂水平異常對AS進展有預測意義。LDL-C會導致動脈粥樣硬化，而HDL-C則能對抗損傷反應這一病理過程。前期實驗已證實蔥白提取物具有調節(jié)AS大鼠血脂水平的作用。本實驗結果也支持蔥白提取物具有改善內膜增生、降低血清TC、TG、LDL-C、ApoB及升高HDL-C含量的作用。

細胞黏附分子是AS的炎性成分中的重要元素，有助于單核細胞和淋巴細胞的活化及募集。ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族成員，ICAM-1可通過促進內皮細胞激活、增加血管壁內的炎性反應而促進動脈粥樣硬化斑塊形成。ICAM-1、VCAM-1與AS的嚴重程度呈正相關，被證實為AS病理變化及斑塊進展的潛在機制。本實驗結果提示，蔥白提取物能夠抑制ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA及ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達，從而發(fā)揮抗AS作用。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)參與了AS病變重構，能夠引起血管細胞外基質的局灶性破壞，細胞外基質的破壞和無休止的單核-吞噬細胞堆積可以加速斑塊破裂。MMP7由巨噬細胞表達，能促使斑塊核心擴張、纖維帽稀疏、血管平滑肌細胞凋亡，是AS進展的有害因素。MMP9主要來源于單核-吞噬細胞，可降解AS斑塊纖維帽，參與不穩(wěn)定斑塊形成。本實驗證實，蔥白提取物可抑制MMP7、MMP9的表達，發(fā)揮穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

CSE是脈管系統(tǒng)中主要的HS產生酶。HS已被證明可以多方面抑制AS的進展，如抑制氧化應激、抑制炎性反應、抑制細胞凋亡與一氧化氮相互作用等。本實驗證實，蔥白提取物可以提高主動脈及心肌CSE的表達水平。有研究證實，外源性補充HS，可使MMP7、MMP9表達顯著升高，同時能明顯抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導的ICAM-1、VCAM-1表達。

綜上所述，本研究證實蔥白提取物能夠調節(jié)血脂、抑制黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)和基質金屬蛋白酶(MMP7、MMP9)表達而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，其機制可能與促進CSE表達、調節(jié)CSE/HS通路相關。