復方癸甲氯銨溶液的消毒效果評價

王文惠 ， 高 琛 ， 崔亮亮 ， 王 彬 ， 李貴玉 ， 張繼甫 ，趙紅瓊 ， 王金泉 ， 李 康 ， 郝智慧

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 ， 新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心 ，北京 海淀 100193 ； 3. 成都科宏達科技有限公司 ， 四川 成都 611435 ； 4.青島農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)用生物制藥實驗室 ，山東 青島 266109)

隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的不斷提高，飼養(yǎng)密度不斷加大，動物傳染性疾病的傳播速度加快，各種動物疫病層出不窮[1]。預防和控制畜禽傳染病流行的重要措施之一即為使用消毒劑對畜禽及其周圍環(huán)境進行消毒[2]。季銨鹽類消毒劑是一類使用廣泛的消毒劑，包括單鏈季銨鹽和雙鏈季銨鹽兩類[3]，其中雙鏈季銨鹽消毒劑比單鏈季銨鹽的抗菌活性高[4]，且雙鏈季銨鹽具有殺菌作用快速、使用濃度低、毒副作用輕的特點[5]。將雙鏈季銨鹽和單鏈季銨鹽組成復方消毒劑可提高殺菌效率、降低毒性、擴大殺菌譜、拓展產(chǎn)品的適用范圍[6]。由于消毒劑的使用越來越廣泛，生產(chǎn)上需要客觀測定消毒劑的消毒效果，為臨床應用提供較可靠的依據(jù)[7]。復方癸甲氯銨溶液為單雙鏈季銨鹽復方消毒劑，至今未見有關該產(chǎn)品消毒效果的評價研究，本試驗根據(jù)相關技術規(guī)范，通過定性殺菌試驗、定量殺菌試驗、使用液穩(wěn)定性試驗和金屬腐蝕性試驗對復方癸甲氯銨溶液進行消毒殺菌效果評價，旨在為該復方消毒劑的臨床應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 消毒劑 受試品：復方癸甲氯銨溶液，含苯扎氯銨(含量規(guī)格：95%，批號：1807050101)和癸甲氯銨(含量規(guī)格：70%，批號：1808155104)，淡藍色透明液體，檸檬香氣，實驗室自制。對照品：癸甲溴銨溶液，規(guī)格：100 mL∶10 g，批號：190608。

1.2 試驗指標菌 大腸埃希菌CICC 10899(等同于大腸埃希菌8099)、金黃色葡萄球菌CICC 21601(等同于ATCC 6538)，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，均購自北京奧博星生物技術有限公司；中和劑(含0.5%卵磷脂和3%吐溫-80的PBS溶液)，自制；有機干擾物(30 g/L牛血清白蛋白溶液)，自制；牛血清白蛋白(第五組份)，購自北京奧博拓達科技有限公司。

1.4 主要儀器 潔凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；高壓滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海恒一科學儀器有限公司；數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇市科興儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.5 菌懸液制備 在無菌條件下打開大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌凍干菌種管，加入適量營養(yǎng)肉湯混勻，將200 μL懸液加到含5.0 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的離心管中，37 ℃培養(yǎng)[8]。用接種環(huán)蘸取第1代菌液，接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)。挑取第2代培養(yǎng)物的單個菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，為第3代培養(yǎng)物。吸取PBS溶液加入到斜面試管中洗下菌苔，移入另一離心管中混勻細菌懸液。用比濁測定法粗測細菌懸液的菌液濃度，然后用PBS溶液稀釋至試驗所需要的濃度。

1.6 中和劑鑒定試驗 以大腸埃希菌作為試驗菌，配制菌懸液，使其含菌量約為107CFU/mL并進行活菌計數(shù)。中和劑為含0.5%卵磷脂和3%吐溫-80的PBS溶液，作用于試驗菌10 min，(20±1) ℃水浴中待用。試驗分為6個組：(1)復方消毒劑+菌懸液；(2)復方消毒劑+菌懸液+4.5 mL中和劑；(3)4.5 mL中和劑+菌懸液；(4)復方消毒劑+4.5 mL中和劑+菌懸液；(5)菌懸液+稀釋液；(6)稀釋液+中和劑+營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。操作過程按照《消毒技術規(guī)范》中定量殺菌試驗[8]進行，試驗重復3次。

1.7 定性殺菌試驗 在13支離心管中各加入2.5 mL無菌蒸餾水，取2.5 mL復方癸甲氯銨溶液最高使用濃度(原液稀釋50倍)的稀釋液，加入第1管中混勻，倍比稀釋至第11管，第12管不加消毒劑作為陰性對照，第13管只加入復方癸甲氯銨溶液最高使用濃度(原液稀釋50倍)的稀釋液作為陽性對照。用PBS溶液將制備好的菌懸液稀釋至5×105～5×106CFU/mL并進行活菌計數(shù)，第1～12管每管內(nèi)加入2.5 mL菌懸液混勻后開始計時，分別作用5、10、15、30 min和60 min后，從第1～13管中分別取出0.5 mL加入含4.5 mL中和劑的離心管中，混勻后中和10 min，再從中分別取出0.5 mL加入含4.5 mL普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的離心管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細菌生長[9]。

1.8 定量殺菌試驗 用無菌硬水分別將復方癸甲氯銨溶液和對照消毒劑配制成含等濃度季銨鹽物質(zhì)的消毒使用液(配制濃度為待測濃度的1.25倍)。被試樣品為復方癸甲氯銨溶液和對照消毒劑，對照樣品為PBS溶液。用PBS溶液將制備好的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌菌懸液稀釋至106～107CFU/mL，活菌計數(shù)后進行定量殺菌試驗[8]，取無菌離心管加入0.5 mL試驗用菌懸液和0.5 mL有機干擾物混勻，分別吸取被試樣品和對照樣品4.0 mL注入其中，作用2.5、5.0 min和7.5 min后吸取0.5 mL，加入到4.5 mL滅菌的中和劑中作用10.0 min，傾注融化的營養(yǎng)瓊脂混勻，進行活菌計數(shù)，根據(jù)各組活菌數(shù)(CFU/mL)按公式(1)計算殺菌率。

殺菌率/%=[(對照樣品平均菌落數(shù)-被試樣品平均菌落數(shù))/對照樣品平均菌落數(shù)]×100%。

(1)

將各組的活菌數(shù)(CFU/mL)換算為對數(shù)值(N)，然后按公式(2)計算殺滅對數(shù)值[8]。

殺滅對數(shù)值 (KL)=對照樣品平均活菌濃度的對數(shù)值(No)-被試樣品平均活菌濃度對數(shù)值(Nx)。

(2)

1.9 使用液穩(wěn)定性試驗 將復方癸甲氯銨溶液用自來水稀釋至使用濃度(1∶200)。每種濃度分別設置加蓋組和敞口組。將稀釋好的復方癸甲氯銨溶液200 mL分別裝入4個500 mL的塑料杯中，室內(nèi)溫度為19～22 ℃。分別于第0、1、2天和第3天取出適量溶液測定pH并進行消毒效果檢測，其中試驗菌為大腸埃希菌，具體方法同定量殺菌試驗[8]。

1.10 金屬腐蝕性試驗 將碳鋼、不銹鋼、銅和鋁制成直徑為24.0 mm、厚度為1.0 mm的圓片，中間做一直徑為2.0 mm的小孔，使圓片的表面積總值約為9.80 cm2。將圓片在洗滌劑中浸泡10 min后清洗；用120號粒度水砂紙磨去氧化層，再用自來水沖凈。測量圓片的孔徑、厚度、直徑，用無水乙醇浸泡脫脂。置于50 ℃恒溫箱干燥中1 h，稱重后浸泡于200 mL復方癸甲氯銨溶液最高使用濃度(原液稀釋50倍)的稀釋液中，蒸餾水為對照組。連續(xù)浸泡72 h后取出圓片，用自來水和毛刷清洗干凈，濾紙吸干，置50 ℃恒溫干燥箱中1 h后稱重，按公式(3)計算腐蝕速率 (R)[8]，腐蝕性分級標準見表1。

表1 腐蝕性分級標準Table 1 Corrosion classification standards

(3)

式中R表示金屬腐蝕速率，mm/a；S表示金屬片總表面積，cm2；t表示時間，h；d表示金屬材料密度，kg/m3；m表示試驗前金屬片重量，g；mt表示試驗后金屬片重量，g；mk表示化學清除去除腐蝕產(chǎn)物金屬片失重值，g；試驗中若未進行化學清除處理，計算時在公式中刪去mk。

2 結果

2.1 中和劑鑒定 結果如表2所示，用含0.5%卵磷脂和3%吐溫-80的PBS溶液作為中和劑，可以有效中和復方癸甲氯銨溶液對大腸埃希菌的殘留作用，且中和劑及其中和產(chǎn)物對試驗菌的生長和培養(yǎng)基無影響。

表2 中和劑鑒定試驗結果Table 2 Neutralizer identification test results

2.2 定性殺菌試驗 復方癸甲氯銨溶液對大腸埃希菌的最低有效殺菌濃度為1∶12 800，該濃度下殺菌最快有效時間為10 min；對金黃色葡萄球菌的最低有效殺菌濃度為1∶25 600，該濃度下殺菌最快有效時間為10 min，見表3。

表3 定性殺菌試驗結果Table 3 Qualitative sterilization test results

2.3 定量殺菌試驗 復方癸甲氯銨溶液和對照消毒劑癸甲溴銨溶液對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌分別作用2.5、5.0 min和7.5 min，結果見表4、表5。復方癸甲溴銨溶液作用2.5 min可有效殺滅大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，平均殺滅對數(shù)值均≥5；癸甲溴銨溶液作用7.5 min以內(nèi)無法完全殺滅大腸埃希菌，作用2.5 min可有效殺滅金黃色葡萄球菌，平均殺滅對數(shù)值均≥5。

表4 定量殺滅大腸埃希菌的殺菌率及殺滅對數(shù)值Table 4 Bactericidal rate and logarithm value of killing Escherichia coli quantitatively

表5 定量殺滅金黃色葡萄球菌的殺菌率及殺滅對數(shù)值Table 5 Bactericidal rate and logarithm value of killing Staphylococcus aureus quantitatively

2.4 使用液穩(wěn)定性試驗 復方癸甲氯銨溶液在使用濃度下，在第0～3天隨時間的延長pH有下降趨勢，但消毒效果穩(wěn)定，可滿足殺菌要求,見表6、表7。

表6 使用液穩(wěn)定性試驗平均殺菌率結果Table 6 Average sterilization rate results of the working liquid stability test (%)

表7 使用液穩(wěn)定性試驗pH結果Table 7 pH results of the working liquid stability test

2.5 金屬腐蝕性試驗 復方癸甲氯銨溶液對金屬腐蝕性的測定試驗結果見表8。復方癸甲氯銨溶液原液稀釋50倍后，在72 h時測定碳鋼、銅、鋁和不銹鋼的腐蝕速率分別為0.077 9、0.012 7、0.000 6 mm/a和0.001 5 mm/a。結果表明復方癸甲氯銨溶液對不銹鋼和鋁基本無腐蝕性，對碳鋼和銅有輕度腐蝕性。

表8 金屬腐蝕性試驗結果Table 8 Metal corrosion test results

3 討論

近年來動物傳染病已經(jīng)嚴重影響了畜牧業(yè)發(fā)展，一些重大動物疫病不僅給我國畜牧業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，甚至會危及人類的生命安全。因此在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中建立有效的消毒防疫體系至關重要[10]。為了控制疾病、獲取最佳效益，養(yǎng)殖企業(yè)需要制定合理的消毒方案[11]。

本試驗制備的復方癸甲氯銨溶液由苯扎氯銨和癸甲氯銨復方組成，苯扎氯銨和癸甲氯銨分別是常見的單、雙鏈季銨鹽類陽離子表面活性劑，具有良好的殺菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，一種季銨鹽通過與其他不同季銨鹽混合或復配有利于提高殺菌效果[12]。針對這種特性，本試驗分別采用懸液定性殺菌試驗和懸液定量殺菌試驗對復方癸甲氯銨溶液的消毒殺菌效果進行評價，結果顯示該消毒劑對革蘭陰性和革蘭陽性代表菌均具有很好的殺菌活性，在較低濃度條件下即能夠快速殺滅細菌；同時，較對照消毒劑癸甲溴銨溶液，復方癸甲氯銨溶液的殺菌效果更好。研究證明，將2種或2種以上陽離子表面活性劑進行合理配伍，可克服單方使用的限制條件，提高殺菌效果，且性能穩(wěn)定[13]。本試驗通過使用液穩(wěn)定性試驗證明，復方癸甲氯銨溶液在使用濃度下放置0～3 d，pH有下降趨勢，但消毒效果穩(wěn)定，可滿足殺菌要求；通過金屬腐蝕性試驗證明，該溶液對不銹鋼和鋁無腐蝕性，對碳鋼和銅有輕度腐蝕性。本試驗結果表明，復方癸甲氯銨溶液具有良好的殺菌效果且使用性能穩(wěn)定，為該溶液的實際應用提供數(shù)據(jù)支持。