不同毒力副豬嗜血桿菌生物被膜形成能力及特性

趙瑞利 ， 曾 君 ， 于恩遠(yuǎn) ， 榮睿璠 ， 王心如 ， 李 穎 ， 張東超 ， 武瑋卓 ， 張 清 ， 孫英峰

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 天津 西青 300392 ；2. 天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 天津 北辰 300402)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPS)是一種革蘭陰性短小桿菌，生長時(shí)嚴(yán)格需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或V因子，有15個(gè)以上血清分型[1]。臨床引起以多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的豬格氏病(Glasser's disease)，呈世界性分布。Ni 等于2020 年綜合分析了5 個(gè)國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫中關(guān)于 HPS 血清流行病學(xué)及病原流行病學(xué)的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，2005—2019年HPS在我國豬群中的綜合平均陽性率約為27.8%， 2011—2015年綜合平均陽性率高達(dá)41.0%[2]。豬格氏病無季節(jié)性，且全年齡段的豬均易感，呈地方流行性，我國以5 型(26.6%)、4 型(22.4%)、7 型(9.1%)、13 型(6.3%)、12 型(5.6%)和未分型(8.4%) HPS菌株為優(yōu)勢流行血清型[3]。

細(xì)菌生物被膜(Biofilm)是細(xì)菌及其分泌的糖、蛋白質(zhì)和核酸等多種基質(zhì)組成的細(xì)菌群落，是造成病原細(xì)菌抵御不良生存環(huán)境、持續(xù)性感染、毒力和耐藥性的重要原因之一[4]。細(xì)菌生物被膜基質(zhì)由復(fù)雜的胞外聚合物(Extracellular polymer substances，EPS)構(gòu)成，包括胞外多糖、蛋白質(zhì)、胞外DNA (eDNA)和胞外 RNA (eRNA)。黏附素CdrA和凝集素LecB等主要的結(jié)構(gòu)蛋白通過影響多糖的定位和聚集，從而增加了生物被膜結(jié)構(gòu)支架的強(qiáng)度，能固定生物被膜中的微生物群落，維持一系列高度復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化[5]。胞外聚合物在生物被膜結(jié)構(gòu)和功能方面均發(fā)揮重要作用，包括表面黏附、空間和化學(xué)異質(zhì)性、生物被膜毒力構(gòu)成，可減弱抗菌劑的影響并促進(jìn)細(xì)胞間相互作用，從而增強(qiáng)生物被膜中細(xì)胞的代謝能力和耐藥性[6]。

本試驗(yàn)以不同毒力HPS的生物被膜形成能力差異為切入點(diǎn)，探究生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程、被膜基因含量與表型的相關(guān)性、胞外多糖含量、對宿主細(xì)胞黏附性和耐藥情況分析，為深入研究不同毒力HPS與生物被膜形成能力和相關(guān)特性研究，以及臨床副豬嗜血桿菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞 副豬嗜血桿菌血清型4型(HPS-4)、5型(HPS-5)地方分離株，由吉林大學(xué)惠贈(zèng)；副豬嗜血桿菌血清型7型(HPS-7)、未分型(HPS-NT)菌株和豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)，由天津農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胎牛血清、氧化型輔酶Ⅰ、結(jié)晶紫染液、磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙抗溶液，均購自北京索萊寶科技有限公司；巧克力平板培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；脫纖綿羊血，購自天津晟佰昊生物技術(shù)有限公司；Taq酶和PCR反應(yīng)溶液，均購自高良生物醫(yī)藥科技(北京)有限公司；抗菌藥藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；三氯乙酸、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基，均購自賽默飛世爾科技有限公司。本試驗(yàn)所用引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，信息見表1。

表1 本試驗(yàn)所用引物信息[7-8]Table 1 Primers used in this study

1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；顯微鏡，尼康映像儀器銷售(中國)有限公司；普通PCR儀、iMax酶標(biāo)儀和凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌分離與鑒定 將病料接種于巧克力平板，置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h。挑取疑似HPS的單菌落涂布于TSA固體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h[9]，革蘭染色、鏡檢。

1.4.2 HPS血清型的鑒定 挑取分離純化后的單菌落洗脫于含100 μL無菌水(60 ℃預(yù)熱)的EP管中懸浮，渦旋后沸水浴10 min，凍融1次后，10 000 r/min離心2 min，取上清液為PCR模板[10]。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：模板5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶 0.5μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 13 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性 30 s，退火溫度(根據(jù)引物Tm值確定)退火30 s， 72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

1.4.3 藥敏試驗(yàn) 利用K-B 紙片擴(kuò)散法檢測不同血清型分離菌株對常見14種抗菌藥的敏感性。將純化后的HPS培養(yǎng)至對數(shù)中期，菌液均勻涂布于TSA固體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，將藥敏紙片平整地貼在平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h，測定抑菌圈直徑并參照參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.4 結(jié)晶紫法檢測HPS生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程 將對數(shù)培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌用TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清和0.1%NAD)稀釋至OD值為0.02，每孔菌液200 μL，每種血清型24個(gè)重復(fù)，37 ℃進(jìn)行生物被膜形成培養(yǎng)。分別在第12、24、36、48、60、72、84小時(shí)和第96小時(shí)取不同血清型培養(yǎng)物3個(gè)重復(fù)吸除菌液，用磷酸鹽緩沖液200 μL洗2次，風(fēng)干；甲醇200 μL固定15 min，風(fēng)干；0.1%結(jié)晶紫溶液200 μL染色10 min，風(fēng)干；95%乙醇200 μL溶解色素后，酶標(biāo)儀檢測630 nm吸光度值。取各血清型OD630nm平均值繪制生物被膜形成曲線[12]。

1.4.5 HPS胞外多糖含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥葡萄糖1 g溶解于1 L超純水中，使其終濃度為1 mg/mL。取干凈的玻璃試管按表2配置溶液，在不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加6%苯酚溶液1 mL，然后快速加濃硫酸5 mL，在90～95 ℃水浴20 min 并冷卻，紫外分光光度計(jì)測量490 nm吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

表2 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制所用溶液Table 2 Reagents used for drawing the standard curve of glucose solution (mL)

樣品測定采用苯酚-硫酸法，操作方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線制定，挑取純化的單菌落于TSB液體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清和 0.1% NAD)中，37 ℃、180 r/min搖床振蕩過夜培養(yǎng)，取菌液2.5 mL于50 mL液體培養(yǎng)基再次于37 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng) 18～24 h。取若干菌液置于水浴鍋95 ℃作用5 min ，去除酶活性，10 000 r/min 離心20 min，取上清液；加4%(w/v)的三氯乙酸振蕩20 min后靜置40 min，12 000 r/min 離心30 min ，取上清液；將收集的上清液中加入3倍體積的95%乙醇，4 ℃過夜；12 000 r/min離心15 min，去上清液，沉淀用錫箔紙封口扎小孔，冷凍干燥24 h，得到細(xì)菌胞外多糖。稱取干燥的不同毒力副豬嗜血桿菌胞外多糖1 mg溶于1 mL超純水中，加入6%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL上下輕柔顛倒混勻使之充分反應(yīng)，90～95 ℃水浴20 min，靜置至室溫后用紫外分光光度計(jì)檢測490 nm吸光度值，設(shè)3次重復(fù)取平均值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線一次方程計(jì)算胞外多糖含量[14]。

1.4.6 被膜基因數(shù)量的檢測 采用PCR方法檢測被膜基因，PCR模板制作、PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增程序參考1.4.2，PCR引物信息見表1。

1.4.7 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 將5×105個(gè)PK-15接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的濕式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞生長到100% 融合后，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，感染約1×107CFU的HPS。培養(yǎng)板在37 ℃孵育最多2 h，以允許細(xì)菌黏附。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌5次以消除未黏附細(xì)菌，然后加入0.25%胰蛋白酶100 μL在37 ℃孵育10 min。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞從每個(gè)孔底重新懸浮。將貼壁細(xì)菌的細(xì)胞懸液稀釋10倍，平鋪于TSA固體培養(yǎng)基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)上37 ℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算黏附率[15-16]。

黏附率/%=(黏附細(xì)胞細(xì)菌數(shù)/添加細(xì)菌數(shù))×100%

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 21.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與鑒定 純化的HPS培養(yǎng)20 h后在固體培養(yǎng)基上呈表面光滑、無色透明的小菌落(圖1)，為革蘭陰性短桿菌(圖2)。

圖1 副豬嗜血桿菌的TSA瓊脂平板培養(yǎng)Fig.1 TSA AGAR plate culture ofHaemophilus parasuis

圖2 副豬嗜血桿菌革蘭染色 (1 000×)Fig.2 Gram staining of Haemophilus parasuis (1 000×)

2.2 HPS血清型的鑒定 通過HPS 16S rRNA 和各血清型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為821 bp的16S rRNA、320 bp的血清型4型wciP基因、450 bp的血清型5型wcwK基因、490 bp的血清型7型funQ基因的特異性條帶(圖3和圖4)，與預(yù)期的片段大小相符。

圖3 副豬嗜血桿菌血清型4、5、7的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of Haemophilus parasuis serotypes 4, 5 and 7M：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1、3、5: 陽性對照; 2: wciP基因片段; 4: wcwK基因片段; 6: funQ基因片段M： DL-2 000 DNA Marker; 1,3,5: Positive control; 2: wciP gene fragment; 4: wcwK gene fragment; 6: funQ gene fragment

圖4 副豬嗜血桿菌未分型菌株血清型的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of the unclassified Haemophilus parasuis strainsM：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: funB基因片段; 2: wzx基因片段; 3: glyC基因片段; 4: wciP基因片段; 5: wcwK基因片段; 6: gltI基因片段; 7: funQ基因片段; 8: scdA基因片段; 9: funV基因片段; 10: funX基因片段; 11: amtA基因片段; 12: gltP基因片段; 13: funAB基因片段; 14: funI基因片段; 15: 陽性對照M：DL-2 000 DNA Marker; 1: funB gene fragment; 2: wzx gene fragment; 3: glyC gene fragment; 4: wciP gene fragment; 5: wcwK gene fragment; 6: gltI gene fragment; 7: funQ gene fragment; 8: scdA gene fragment; 9: funV gene fragment; 10: funX gene fragment; 11: amtA gene fragment; 12: gltP gene fragment; 13: funAB gene fragment; 14: funI gene fragment; 15: Positive control

2.3 藥敏試驗(yàn) 由表3可知，HPS-4僅對四環(huán)素、頭孢噻肟、林可霉素、多西環(huán)素耐藥，其余均敏感或中等耐藥；HPS-7僅對林可霉素耐藥；HPS-5對測試抗生素均敏感；HPS-NT僅對多西環(huán)素敏感，耐藥性強(qiáng)且主要集中在β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物。

表3 不同毒力副豬嗜血桿菌的藥敏試驗(yàn)Table 3 Drug sensitivity testing of Haemophilus parasuis of varying virulence

2.4 生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程 不同毒力HPS生物被膜形成曲線結(jié)果見圖5，各血清型HPS在培養(yǎng)36 h后生物被膜含量開始明顯增多，特別是微菌落形成階段(48～60 h)和生物被膜成熟階段(60～72 h)增加顯著，并且第60小時(shí)和第72小時(shí)之間生物被膜含量呈極顯著差異(P<0.01)。在72 h時(shí)生物被膜形成量達(dá)到峰值，隨后減少，生物被膜逐漸消散。在生物被膜形成過程中，強(qiáng)毒菌株(HPS-5)的生物被膜形成量在36 h后始終多于中等毒力菌株(HPS-4)、無毒型菌株(HPS-7)和未分型菌株(HPS-NT)。但在細(xì)菌初始黏附階段(0～24 h)、生物被膜黏附階段(24～48 h)，無毒型菌株(HPS-7)生物被膜形成量多于中等毒力菌株(HPS-4)。在生物被膜散播期(72～96 h)，不同毒力HPS生物被膜量均減少，并且第72小時(shí)和第84小時(shí)之間生物被膜含量減少呈極顯著差異(P<0.01)，第84小時(shí)后四者差異不顯著(P>0.05)。

圖5 不同毒力副豬嗜血桿菌的生物被膜形成Fig.5 Biofilm formation of Haemophilus parasuis of varying virulence** ：P<0.01，差異極顯著** ：P<0.01，extremely significant difference

2.5 胞外多糖含量測定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果見圖6，線性回歸方程：y=0.609 3x-0.011 4，R2=0.998 8表明線性關(guān)系良好。不同毒力HPS胞外多糖含量測定結(jié)果表明：中等毒力菌株(HPS-4)胞外多糖含量最多，為0.929 6，強(qiáng)毒株(HPS-5)胞外多糖含量最少，為0.854 1，但差異不顯著(P>0.05)。

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of glucose

2.6 生物被膜相關(guān)基因檢測 通過PCR檢測生物被膜相關(guān)基因，擴(kuò)增得到675 bp的CRP基因、650 bp的LuxS基因、100 bp的LpxM基因、1 400 bp的qseC基因的特異性條帶(圖7和圖8)，與預(yù)期片段大小相符。中等毒力菌株(HPS-4)被膜基因CRP、LpxM呈陽性；強(qiáng)毒株(HPS-5)被膜基因LpxM、LuxS、qseC呈陽性；無毒型菌株(HPS-7)被膜基因LpxM呈陽性；未分型菌株(HPS-NT)被膜基因LpxM、CRP呈陽性。

圖7 副豬嗜血桿菌血清型4、5、7被膜基因的PCR檢測Fig.7 PCR detection of envelope genes of Haemophilus parasuis serotypes 4, 5 and 7M：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 陽性對照; 2～5: HPS-4 CRP、LuxS、LpxM、qseC基因片段; 6～9: HPS-5 CRP、LuxS、LpxM、qseC基因片段; 10～13: HPS-7 CRP、LuxS、LpxM、qseC基因片段M：DL-2 000 DNA Marker; 1: Positive control; 2-5: CRP、LuxS、LpxM、qseC gene fragment of HPS-4; 6-9: CRP、LuxS、LpxM、qseC gene fragment of HPS-5; 10-13: CRP、LuxS、LpxM、qseC gene fragment of HPS-7

圖8 未分型副豬嗜血桿菌被膜基因的PCR檢測Fig.8 PCR detection of envelope genes of unclassified Haemophilus parasuis M：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 陽性對照; 2: LuxS基因片段; 3: qseC基因片段; 4: LpxM基因片段; 5: CRP基因片段M：DL-2 000 DNA Marker; 1: Positive control; 2: LuxS gene fragment; 3: qseC gene fragment; 4: LpxM gene fragment; 5: CRP gene fragment

2.7 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 各血清型HPS黏附PK-15細(xì)胞后菌落計(jì)數(shù)和黏附率見圖9，中等毒力菌株(HPS-4)菌落計(jì)數(shù)為2.63×106CFU/mL，細(xì)胞黏附率為26.3%；強(qiáng)毒菌株(HPS-5)菌落計(jì)數(shù)為3.00×106CFU/mL，細(xì)胞黏附率為30.0%；無毒型菌株(HPS-7)菌落計(jì)數(shù)為2.39×106CFU/mL，細(xì)胞黏附率為23.6%；未分型菌株(HPS-NT)菌落計(jì)數(shù)為2.20×106CFU/mL，細(xì)胞黏附率為22.0%。結(jié)果表明，強(qiáng)毒和中等毒力HPS對宿主細(xì)胞黏附能力更強(qiáng)。副豬嗜血桿菌黏附細(xì)胞的能力與該細(xì)菌毒力呈正相關(guān)。

圖9 不同血清型HPS對PK-15黏附率Fig.9 Adhesion rates of different HPS serotypes to PK-15

3 討論

細(xì)菌生物被膜(Bacterial biofilm，BF)是指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[4]。生物被膜對細(xì)菌黏附、定殖和侵襲宿主細(xì)胞過程中至關(guān)重要，臨床約 80%的慢性感染性疾病與細(xì)菌生物被膜有關(guān)[17]。不同細(xì)菌生物被膜形成能力與其毒力是否呈正相關(guān)結(jié)論不一致[18-19]，本試驗(yàn)HPS-5強(qiáng)毒株生物被膜形成能力最強(qiáng)。本試驗(yàn)中強(qiáng)毒菌株(HPS-5)對宿主細(xì)胞黏附率為30.0%，中等毒力菌株(HPS-4)為26.3%，無毒型菌株(HPS-7)為23.6%,未分型菌株(HPS-NT)為22.0%，結(jié)果表明，毒力越強(qiáng)對宿主細(xì)胞黏附能力越強(qiáng)，更有利于細(xì)菌定植。生物被膜形成是一個(gè)復(fù)雜而有規(guī)律的動(dòng)態(tài)過程，包括細(xì)菌起始黏附期、生物被膜黏附期、生長期、成熟期和播散期5個(gè)階段[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同毒力副豬嗜血桿菌在培養(yǎng)36 h后生物被膜含量開始明顯增多，并且第60小時(shí)和第72小時(shí)之間生物被膜含量呈極顯著差異(P<0.01)。在生物被膜散播期(72～96 h)不同毒力HPS生物被膜量均減少，并且第72小時(shí)和第84小時(shí)之間生物被膜含量減少呈極顯著差異(P<0.01)，第84小時(shí)后四者差異不顯著(P>0.05)。由此推測，由于起始黏附、黏附階段是可逆的，抗菌藥物在黏附階段對細(xì)菌的抑制效果相對較好，播散期后可適當(dāng)延長用藥期或聯(lián)合用藥加強(qiáng)清除生物被膜。

微菌落形成是起始吸附階段進(jìn)入生物被膜成熟階段經(jīng)歷的過渡期，胞外多糖是這一過程中必不可少的物質(zhì)，其含量多少與生物被膜形成量和黏附、侵入黏膜上皮細(xì)胞有關(guān)[21]。成熟生物被膜中形成的胞外多糖可使用酶或其他抑菌劑降解，破壞基質(zhì)的物理完整性，促進(jìn)生物被膜的破壞和清除[22]。使用糖苷水解酶 PslG 靶向分解胞外聚合物中的胞外多糖，在體外可破壞銅綠假單胞菌的成熟生物被膜[23]。胞外多糖降解酶可作為常規(guī)抗菌劑的輔助劑，增強(qiáng)藥物滲透性和微生物殺滅活性[24]。本試驗(yàn)中中等毒力菌株(HPS-4)胞外多糖含量最多，強(qiáng)毒株(HPS-5)胞外多糖含量最少，但兩者差異不顯著(P>0.05)，與預(yù)期生物被膜形成能力越強(qiáng)胞外多糖含量越高不符，可能與細(xì)菌生物被膜的形成不僅受到外界因素的影響，同時(shí)也受細(xì)菌自身基因的調(diào)控有關(guān)[25]。本試驗(yàn)中中等毒力菌株(HPS-4)有2個(gè)被膜基因呈陽性；強(qiáng)毒株(HPS-5)有3個(gè)被膜基因呈陽性；無毒型菌株(HPS-7)有1個(gè)被膜基因呈陽性；未分型菌株(HPS-NT)有2個(gè)被膜基因呈陽性，結(jié)合基因數(shù)量和被膜形成量以及毒力來看，生物被膜形成量與被膜基因數(shù)量相關(guān)，但與文獻(xiàn)報(bào)道弱毒株比強(qiáng)毒株生物被膜形成量多這一觀點(diǎn)不相符，可能與研究菌株來源不同有關(guān)，因?yàn)樯锉荒ば纬墒羌?xì)菌適應(yīng)環(huán)境保護(hù)機(jī)制，不同區(qū)域HPS生長環(huán)境不同，形成生物被膜的能力就有所區(qū)別。

生物被膜的形成降低了細(xì)菌對抗菌藥的敏感性，與游離菌相比，其耐藥性提高10～1 000倍，微菌落進(jìn)一步發(fā)展并分泌胞外基質(zhì)，形成具有不同三維結(jié)構(gòu)的成熟生物被膜，這個(gè)階段內(nèi)的生物被膜對藥物、紫外線等抗性最強(qiáng)[26]，是引起臨床上細(xì)菌性疾病難以治療的主要原因之一。HPS-4對常見14種抗菌藥耐藥率為28.6%， 而HPS-5的敏感性為100%，這可能是不同地區(qū)豬場用藥情況不同導(dǎo)致的。其中，中等毒力菌株(HPS-4)來源于吉林省，耐抗生素種類較多，集中于廣譜殺菌、抑菌藥，為避免耐藥性的產(chǎn)生和水平傳播，應(yīng)及時(shí)調(diào)整更換抗菌藥或用抗菌肽等生物活性物質(zhì)替抗。