基于ISSR標記和數(shù)量性狀的火龍果種質(zhì)材料遺傳多樣性分析

陳明賢

(泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 晉江 362212)

廣義的火龍果是仙人掌科植物，分屬量天尺屬(Hylocereus)、曇花屬(Epiphyllum)和蛇鞭柱屬(Selenicereus)，原產(chǎn)南美洲，是我國華南熱區(qū)近年新興果樹，產(chǎn)區(qū)主要分布于海南、廣西、廣東及貴州等省(區(qū))，具有速生快長、適應(yīng)性強、產(chǎn)量高等特點?；瘕埞贩N多、資源豐富，目前對其種質(zhì)材料(含品種、品系、株系、品種資源，下同)的分類主要依據(jù)果皮和果肉顏色分為紅皮白肉、紅皮粉紅肉、紅皮紅肉、紅皮紫肉、黃皮白肉、橙皮紅肉等多種類型，現(xiàn)國內(nèi)栽培主要為紅皮白肉及紅皮紅肉類型，少量為黃皮白肉類型[1—3]。目前，國內(nèi)對火龍果的研究集中在栽培[4]、果實營養(yǎng)成分分析[5—6]、采后儲藏保鮮[7]、葉面肥對果實食用及儲藏品質(zhì)的影響[8]、產(chǎn)品開發(fā)[9]以及種質(zhì)資源調(diào)查、收集與鑒定等領(lǐng)域[10—11]。有關(guān)火龍果種質(zhì)資源分子標記研究的報道主要涉及 ISSR[12]、SSR[13]、RAPD[14]、AFLP[15]等，在表型性狀研究上，已有研究表明火龍果花、果實表型性狀、農(nóng)藝性狀及品質(zhì)性狀均具有豐富的遺傳多樣性[16—17]。

ISSR分子標記技術(shù)已十分成熟并廣泛應(yīng)用于果樹種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析等方面研究[18]。在遺傳多樣性分析上，雖然分子標記技術(shù)擁有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的特點及優(yōu)勢，但表型性狀便于田間觀察，且各性狀均是遺傳基因與環(huán)境互作的直接結(jié)果，也是育種工作的最終目標，因而通過表型性狀的差異化選擇，仍是育種工作的主要手段。將二者合理地結(jié)合起來，對實際育種工作有更大的促進作用。

本研究采用分子標記技術(shù)和數(shù)量性狀相結(jié)合的方法，對收集保存在泉州國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)果蔬園內(nèi)的25份火龍果種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，以期更全面地反映收集地種質(zhì)材料的遺傳背景和性狀表現(xiàn)，為下一步選育種工作提供理論支持與技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

供試火龍果種質(zhì)材料為泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所近年收集保存，種植于泉州國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)果蔬園火龍果引種圃，共25份(表1)。所有種質(zhì)均進行統(tǒng)一田間管理，于2019年12月剪取健壯嫩莖，以莖尖作為ISSR分子標記試驗材料，液氮處理后保存于-80 ℃冰箱，備用。

表1 供試火龍果種質(zhì)材料信息Table 1 Germplasm information of tested pitaya

1.1.2 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度計(TU-1810)，臺式高速冷凍離心機(BECKMAN Avanti30、Eppendoff 5804R)，梯度PCR儀(Tgradient-Biometra)，DYCP-32A電泳儀(北京六一)，凝膠成像系統(tǒng)(Syngene Gene Genius)，ATAGO-PAL糖度測量儀等。

2×TaqPCR Master Mix(TIANGEN 公司)；DL2000 DNA Ladder (北京索萊寶科技有限公司)；Trans 2K Plus DNA Maker (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。ISSR引物為前期篩選出的對火龍果有高特異性的7條引物：UBC807、UBC808、UBC810、UBC811、UBC853、UBC873、UBC880，由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及質(zhì)量檢驗

采用多糖多酚植物基因組 DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取火龍果基因組DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗質(zhì)量。

1.2.2 ISSR-PCR擴增體系及程序

ISSR-PCR 體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL、10 μmol·L-1引物 1 μL、10 ng·μL-1DNA 模板 1 μL，用無菌水補齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，(Tm-5) ℃ (根據(jù)引物而定)退火45 s，72 ℃延伸90 s，共37個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以5 V·cm-1電壓電泳60 min。電泳后用凝膠成像觀察結(jié)果，拍照保存。

1.2.3 數(shù)量性狀觀測

主要觀測火龍果植株及果實的 20個數(shù)量性狀(表2)，數(shù)據(jù)測量參照廣西壯族自治區(qū)地方標準DB45/T 1761-2018《火龍果種質(zhì)資源描述規(guī)范》的方法，莖蔓數(shù)據(jù)測量選取1～2年生無病害健康莖蔓于2020年4～6月進行，果實性狀于8～9月測量，每性狀測量10個數(shù)據(jù)。

表2 測試火龍果的數(shù)量性狀Table 2 Quantitative characteristics of pitaya for testing

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)凝膠中條帶遷移的位置和有無進行統(tǒng)計，計算多態(tài)性條帶比例，用Ntsyspc2.1進行UPGMA聚類分析。對供試品種數(shù)量性狀的最大值、最小值、均值、標準偏差(SD)、種內(nèi)變異系數(shù)和種間變異系數(shù)進行統(tǒng)計分析，用SPSS 22.0軟件對不同品種進行單因素方差分析。對原始數(shù)據(jù)標準化處理后，根據(jù)平方Euclidean距離，按Ward法進行系統(tǒng)聚類分析，構(gòu)建樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物多態(tài)性分析

用7條ISSR引物分別對25份火龍果種質(zhì)材料進行多態(tài)性檢測，擴增出多個位點且條帶清晰，不同種質(zhì)各有特異性條帶(圖1、表3)。7條引物共檢測到 97個位點，引物的擴增位點數(shù)為 12～16，平均每條引物擴增13.8個位點，其中擴增位點最多的是UBC810和UBC880，最少的是UBC873。擴增的多態(tài)性位點數(shù)為93個，多態(tài)性比例為95.88%，其中引物UBC808、UBC810、UBC811、UBC873擴增的多態(tài)性比例達100%，UBC880最低，僅87.50%。

圖1 引物UBC873的擴增結(jié)果Fig. 1 The amplified result by the primer UBC873

表3 ISSR引物及擴增產(chǎn)物多態(tài)性Table 3 ISSR primers and the polymorphism of the amplified products

2.2 基于ISSR分子標記的火龍果種質(zhì)UPGMA聚類分析

UPGMA聚類分析表明，25份火龍果種質(zhì)材料的相似系數(shù)在0.41～0.86之間，在遺傳相似系數(shù)為0.54處，可將25份火龍果種質(zhì)材料分為6大類(圖2)。第Ⅰ大類有17份種質(zhì)，包括黑白雙色水晶、桂紅龍1號、臺紅3號、南寧蜜龍、晉紅、越南紅肉、紫龍、美龍2號、紅玫瑰5號、紅冠、湛江10號、柬埔寨紅肉、臺紅2號、長紅、海紅、臺紅1號、黑龍，均為紅皮紅肉品系；比較遺傳相似系數(shù)可發(fā)現(xiàn)，柬埔寨紅肉與臺紅2號、臺紅3號與南寧蜜龍、紅冠與湛江10號等3組相似系數(shù)最為接近，再比對擴增的圖譜，7條引物擴增出的條帶具有高相似度，說明其基因組差異小，且聚類分析結(jié)果可靠。第Ⅱ大類有3份種質(zhì)，包括晉白、海白、蜜紅龍。第Ⅲ大類有2份種質(zhì)，包括赤龍和紅繡球。紅仙蜜、黃龍變種、白巨龍各自為一類。

圖2 基于UPGMA法的25個火龍果種質(zhì)聚類分析Fig. 2 Dendrogram of 25 pitaya germplasms by UPGMA method

2.3 火龍果主要數(shù)量性狀的變異情況

對 25份火龍果種質(zhì)的主要數(shù)量性狀進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，火龍果各數(shù)量性狀的種內(nèi)變異系數(shù)在 7.25%～27.51%之間，超過 20%的有棱厚度(C2)、單果重(C6)、果萼(鱗片)厚度(C9)、果萼(鱗片)數(shù)量(C10)、果臍深度(C14)和種子數(shù)量(C18)等6個；低于10%的有可食率(C17)、可溶性固形物(C19、C20)等3個。種間變異幅度在12.35%～51.66%之間，變異系數(shù)較大，變異豐富。變異系數(shù)最大的為棱厚度51.66%，可溶性固形物的變異系數(shù)最小，中部和邊緣變異系數(shù)相近(表4)。種內(nèi)變異幅度大，則種間的變異幅度相應(yīng)的也較大。

表4 火龍果種質(zhì)資源數(shù)量性狀變異情況Table 4 Variations of quantitative characteristics among pitaya

2.4 基于數(shù)量性狀的火龍果種質(zhì)聚類分析

用Ward法聚類分析，在歐式距離為5處，可將25份種質(zhì)聚為6個組群(圖3)。第Ⅰ組群包括美龍2號、紅玫瑰5號、南寧蜜龍、紅冠、湛江10號、臺紅2號、臺紅3號、海紅、晉紅、柬埔寨紅肉和紫龍等11個品種，均為紅皮紅肉品系，整體品質(zhì)表現(xiàn)較好；第Ⅱ組群包括晉白、海白、蜜紅龍、桂紅龍1號、白巨龍和越南紅肉6個品種，紅皮白肉品系均在該組群；第Ⅲ組群包括長紅、臺紅1號、黑白雙色水晶等3個品種；第Ⅳ組群包括紅仙蜜、赤龍和紅繡球3個品種，均為紅皮白肉品系，突出表現(xiàn)是刺座數(shù)量密集，刺長且多，品質(zhì)表現(xiàn)一般；黃龍變種和黑龍各為一組，黃龍變種鱗片多且密，可食率低下，黑龍單果重量小、莖厚，兩品種品質(zhì)較差。

圖3 基于數(shù)量性狀的25份火龍果種質(zhì)聚類圖Fig. 3 Cluster diagram of 25 pitaya germplasms based on quantitative traits

2.5 不同聚類方法分析比較

對圖2和圖3的聚類結(jié)果進行比對，兩種聚類方法得出的結(jié)果有部分相似，兩者均能把性狀表現(xiàn)比較一致的品種聚為同一群組，如晉白與海白、赤龍與紅繡球、紅冠與湛江10號等，分子標記聚類的第Ⅰ組群，包括數(shù)量性狀聚類的Ⅰ組群，均為紅皮紅肉品系。性狀表現(xiàn)差異較大的品種也能單獨區(qū)分，如黃龍變種和黑龍。但兩種聚類方法也存在較大差異。單從果肉顏色看，兩種聚類方法均無法明確地區(qū)分紅肉類型和白肉類型，通過數(shù)量性狀聚類，雖然能將3個白肉類型的聚為一類，晉白與海白的歐式距離更近，與白巨龍較遠，但同一組群中也包含了部分紅肉類型品種；通過分子標記聚類可以看出，存在與數(shù)量性狀聚類分析大體一致的結(jié)果。另外，在分子水平上遺傳距離較近且聚為同一組群的品種，如柬埔寨紅肉與臺紅2號、臺紅3號與南寧蜜龍，用數(shù)量性狀聚類分析時，卻無法聚為同一群組。整體上看兩種聚類方法得出的結(jié)果存在較大差異，在實際使用中要根據(jù)不同育種目的結(jié)合兩種分析結(jié)果進行選擇。

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源鑒定是育種工作的基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用ISSR分子標記和數(shù)量性狀變異分析兩種方法，均驗證了火龍果不同種質(zhì)遺傳背景的較大差異。7個ISSR引物平均擴增檢測出13.8個位點，多態(tài)性比例達95.88%，為高度多態(tài)性，與前人研究基本一致[12]。性狀變異是植物品種形成的前提，變異系數(shù)一方面反映了某一性狀的可塑性，同時也反映了該性狀的穩(wěn)定程度。本研究種質(zhì)間各數(shù)量性狀的變異系數(shù)在12.35%～51.66%之間，顯示出豐富的遺傳多樣性，與黃鳳珠等[16]在火龍果花表型性狀多樣性的研究結(jié)果一致?；瘕埞仓隉o葉片，靠攀援生長的莖蔓完成光合作用，莖蔓一般呈三棱形至五棱形，可形成氣生根，棱邊有刺座，沿棱邊排列，刺座上有短刺，刺座也是芽點。不同品種莖蔓表現(xiàn)差異較大。火龍果自然變異豐富，不少栽培品種的選育來自自然條件下的芽變選種，經(jīng)過長期自然變異和人工選擇，形成極為豐富的數(shù)量性狀變異。火龍果果實呈圓形至長橢圓形，部分不規(guī)則，因品種不同而異。果皮上著生的鱗片因品種不同而形態(tài)各異，數(shù)量也有較大變異。在所觀測數(shù)量性狀中，棱的厚度、單果重、鱗片長度變異系數(shù)超過40%，說明其穩(wěn)定性較差，易受外界環(huán)境影響。極高的變異系數(shù)也間接說明火龍果雖然育種研究時間短，商業(yè)化品種少，但種質(zhì)資源卻極為豐富。

聚類分析的實際應(yīng)用，除了追溯物種起源外，在育種中主要為親本選擇提供重要參考，避免選擇親緣關(guān)系較近的種質(zhì)作為雜交配組，以提高育種效率。根據(jù)ISSR分子標記和數(shù)量性狀的聚類分析，雖然有部分相似，但整體結(jié)果并不一致，這與其他作物的研究結(jié)果一致[19]，說明表型雖受基因組控制，但其表達也受環(huán)境因素影響。本研究將分子標記和表型性狀相結(jié)合，兼顧分子水平與環(huán)境影響的結(jié)果，能為育種工作中親本的精準選擇提供依據(jù)。