賴氨酰氧化酶樣蛋白3在人類惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的研究進展

李 彬，朱 泓，黃照能，余 敏，熊 偉

賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)家族蛋白是一組銅依賴性胺氧化酶，由5個結(jié)構(gòu)相似的成員組成：LOX和賴氨酰氧化酶樣蛋白(lysyl oxidase like,LOXL)1～4[1]。LOX家族蛋白可作用于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中的膠原蛋白和彈性蛋白，通過催化賴氨酸和羥賴氨酸殘基氧化成肽基醛，使它們之間產(chǎn)生交聯(lián)，有助于維持ECM的剛性和穩(wěn)定性。LOX家族各成員的C端區(qū)域保守，包含銅離子結(jié)合位點，賴氨酸酪氨?；?lysine tyrosylquinone,LTQ)殘基和細胞因子受體樣(cytokine receptor-like,CRL)結(jié)構(gòu)域為酶的催化區(qū)域；但其N端區(qū)域則是可變的。LOX家族可根據(jù)不同的N端序列分為兩個亞家族：第一個亞家族由LOX和LOXL1組成，在肽酶的作用下可被水解，從而形成活性蛋白質(zhì)和N-末端前肽。第二個亞家族由LOXL2、LOXL3和LOXL4組成，蛋白質(zhì)N端富含一段含有4個富含半胱氨酸的清道夫受體(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)結(jié)構(gòu)域[2-4]。LOXL3和LOXL2之間的氨基酸序列相似度較高，同源性為69%，而LOXL3與其它成員LOX、LOXL1和LOXL4之間的同源性約為50%[5-6]。LOXL3是LOX蛋白家族中研究相對較少的成員，其銅依賴性胺氧化酶活性最初是基于家族中其它蛋白質(zhì)成員的同源性而發(fā)現(xiàn)的。本文主要從LOXL3蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其人類惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用進行綜述，以期為惡性腫瘤的臨床診斷、治療和篩選預后標志物提供理論基礎和參考依據(jù)。

1 LOXL3基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

2001年人類 LOXL3基因(ENSG00000115318)分別由3個獨立的研究小組通過搜索人類表達序列標簽(expressed sequence tag,EST)數(shù)據(jù)庫中，與人類LOX編碼基因[6]或小鼠Lor基因的同源基因而被鑒定出來[7]。以上研究中分離的cDNA預測了一種蛋白質(zhì)，與已經(jīng)確定的人類LOX、LOXL1和LOXL2蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)域。

LOXL3基因定位于2p13.3，由23 462個核苷酸組成，包含14個外顯子，全長cDNA為3 121 bp(圖1A)。LOXL3基因的5’-側(cè)翼區(qū)域位于外顯子1，啟動子區(qū)域沒有典型的TATA或CAAT盒，但呈現(xiàn)STAT3、STAT6、SRF MIBP/RFX1、SP1、NF1、NRSF、CRE結(jié)合蛋白1、PAX6配對結(jié)構(gòu)域、IRF相關(guān)蛋白、GATA結(jié)合因子1、NF-κB、GAGA盒、c-Rel位點和AP-2等轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點[8]。LOXL3基因編碼最長的全長轉(zhuǎn)錄本的開放閱讀框編碼1個含753個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量為8.03×104。蛋白質(zhì)C端包含催化結(jié)構(gòu)域，具有蛋白質(zhì)構(gòu)象和催化活性所需的銅離子結(jié)合基序，LTQ和CRL結(jié)構(gòu)域[6-7,9]，該催化域在其它LOX蛋白中高度保守，特別是由外顯子10、11和12編碼的區(qū)域。與LOX基因外顯子2到外顯子9相對應的蛋白質(zhì)N-末端區(qū)域包含4個SRCR結(jié)構(gòu)域，以及位于氨基酸殘基25和26之間的一個細胞外信號肽切割位點[6]。根據(jù)其預測的結(jié)構(gòu)，LOXL3可以通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP1)在ECM中對位點GDD(氨基酸殘基446～448位點)進行切割[7]，其加工過程與LOX和LOXL1相似[10]。切割后的相對分子質(zhì)量為3.5×104，包含306個氨基酸殘基[2,7,10]。此外，LOXL3蛋白可以發(fā)生糖基化修飾。研究表明，LOXL3蛋白在信號肽序列切割位點之后出現(xiàn)了3個推測的O-糖基化位點(Ser-26、Ser-28和Ser-30)和5個N-糖基化位點(圖1B)，這在其他類似LOX的成員中未發(fā)現(xiàn)[6]。因此，上述位點的糖基化修飾都可以解釋檢測到的分泌蛋白質(zhì)大小的差異。重組LOXL3蛋白是在纖維肉瘤(HT-1080)的濃縮培養(yǎng)基中回收的，其相對分子質(zhì)量為9.7×104，比預期的分子量大一些，這可能是由于蛋白質(zhì)的糖基化修飾導致的[6]。此外，LOXL3蛋白也可以通過由兩簇堿性氨基酸組成的雙核定位信號序列(氨基酸殘基293～311)而轉(zhuǎn)位到細胞核，在LOXL3蛋白N-末端區(qū)域中也發(fā)現(xiàn)了與信號肽重疊的假定核輸出信號序列[11-12]。

圖1 LOXL3 基因及其編碼的蛋白質(zhì)變體的結(jié)構(gòu)示意圖：A.人類LOXL3基因的三個轉(zhuǎn)錄本變體的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)；B.人類LOXL3蛋白變體結(jié)構(gòu)

在人類EST數(shù)據(jù)庫中搜索LOXL3基因表達序列同源物的過程中，還發(fā)現(xiàn)兩種LOXL3基因的轉(zhuǎn)錄本變體，分別為LOXL3-sv1和LOXL3-sv2[8,13]。LOXL3-sv1是最短的轉(zhuǎn)錄本，缺少外顯子1、2、3和5；外顯子4的5′側(cè)翼區(qū)域包含額外的80 bp作為替代啟動子，外顯子14的3′末端側(cè)翼區(qū)域包含額外的561 bp序列。與全長LOXL3基因相比，LOXL3-sv1啟動子有1個TATA盒以及不同轉(zhuǎn)錄因子，如p53、GATA結(jié)合因子3、STAT5、Pit1、Ras反應元件結(jié)合蛋白1、神經(jīng)生長素1和3、AP-1、PAX2/5/8、YY1和NUDR的潛在結(jié)合位點。該轉(zhuǎn)錄本變體的翻譯起始于外顯子6，編碼1個由392個氨基酸組成的多肽，相對分子質(zhì)量為4.4×104。盡管缺少前3個SRCR結(jié)構(gòu)域，LOXL3-sv1編碼的蛋白質(zhì)仍然保存C末端和銅離子依賴性胺氧化酶的活性。與LOXL3類似，LOXL3-sv1也可能是BMP-1的靶點，并且有2個推測的N-糖基化位點[8]。最近被鑒定的LOXL3-sv2轉(zhuǎn)錄本變體含有12個外顯子，缺失與LOXL3基因外顯子4和5相對應的序列，導致其編碼的蛋白質(zhì)缺失第2個SRCR結(jié)構(gòu)域。LOXL3-sv2變體編碼含有608個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為6.74×104，具有推測的O-糖基化和N-糖基化位點以及BMP-1裂解位點[13]。盡管LOXL3-sv2變體維持SRCR3結(jié)構(gòu)域，但N端的雙核定位信號序列發(fā)生缺失。

2 LOXL3蛋白的組織表達和亞細胞定位

2.1 LOXL3蛋白的組織表達對人體的各種正常組織進行Northern印跡分析，結(jié)果表明：與LOXL3 cDNA序列長度一致的3.1～3.2 kb的條帶，被鑒定為LOXL3 mRNA[6-7]。LOXL3轉(zhuǎn)錄本在心臟、脾臟、子宮、髓質(zhì)、脊髓和卵巢中的表達水平最高[6-7]。使用基因型組織表達(genotype-tissue expression,GTEx)數(shù)據(jù)庫中的正常人類組織RNA表達數(shù)據(jù)集中分析LOXL3基因的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，與文獻報道Northern印跡分析的結(jié)果一致，LOXL3基因在心臟、脾臟和子宮中呈高表達[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，LOXL3蛋白在肺、主動脈和冠狀動脈中高表達，在角膜層、角膜小梁網(wǎng)、眼緣和結(jié)膜中也有表達[17]。此外，還有研究表明，LOXL3-svl轉(zhuǎn)錄本在肝臟、胰腺、脾臟和胸腺中高表達[8]，LOXL3-sv2轉(zhuǎn)錄本在脾臟、睪丸、卵巢、胎盤和小腸中高表達[13]。這些LOXL3轉(zhuǎn)錄本變體，在人體正常組織中差異表達的生理意義仍有待闡明。

2.2 LOXL3蛋白的亞細胞定位LOXL3蛋白定位于細胞質(zhì)和ECM，最初被描述為纖維肉瘤HT-1080細胞分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)[6]。有研究表明，LOXL3也可以由心肌細胞分泌，并在ECM的膠原交聯(lián)中發(fā)揮作用[8]。此外，在小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)LOXL3蛋白對肌腱連接處ECM纖維連接蛋白具有氧化作用[18]。在過表達LOXL3的HeLa細胞、黑色素瘤細胞和Madin-Darby犬腎細胞的核周細胞質(zhì)中定位觀察LOXL3蛋白的表達[19-20]。在HeLa細胞和小鼠脾細胞中也報道核內(nèi)定位的LOXL3蛋白。此外，在胃癌細胞中也描述LOX蛋白的細胞質(zhì)和細胞核定位[21]。采用酵母雙雜交和免疫共沉淀實驗鑒定LOXL3與人類端粒酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)之間具有相互作用，進一步證實LOXL3蛋白的核定位[22]。LOXL3蛋白變體的亞細胞定位仍然需要深入研究。目前，只有一項研究報道LOXL3-sv1亞型在細胞質(zhì)和ECM的定位[8]，還未有關(guān)于LOXL3-sv2蛋白亞細胞定位的報道。

3 LOXL3蛋白的胺氧化酶活性

在LOXL3蛋白的第4個SRCR結(jié)構(gòu)域(圖1B)有1個BMP-1切割位點[7]，該加工過程發(fā)生在ECM，切割后產(chǎn)生一種具有催化活性的胺氧化酶，其蛋白質(zhì)C末端的預測相對分子質(zhì)量為3.5×104。然而，Western blot分析結(jié)果表明，從結(jié)腸組織中切割出的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為4.0×104，可能是由于蛋白質(zhì)翻譯后修飾，如蛋白質(zhì)糖基化所致。研究表明，LOXL3蛋白或其變體對不同類型的膠原蛋白(I、II、III、IV、VI、VIII和X型)以及彈性蛋白均顯示胺氧化酶活性(圖2)[8]。LOXL3對膠原VIII具有更高的活性，LOXL3-sv1對膠原I、IV和X具有更高的活性[8]，LOXL3-sv2對I型膠原的胺氧化酶具有更高的活性[13]。研究表明，LOXL3的胺氧化酶活性能夠被一種有效且不可逆的胺氧化酶抑制劑β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,β-APN)抑制，β-APN抑制細胞基質(zhì)中蛋白質(zhì)交聯(lián)的形成[8,13]。

圖2 LOXL3蛋白的胺氧化酶活性

4 LOXL3蛋白在人類惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機制

LOXL3蛋白可以與轉(zhuǎn)錄因子SNAIL在核周區(qū)發(fā)生相互作用，阻止SNAIL降解和核輸出；而SNAIL可抑制E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄，誘導上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程。LOXL3在抑制E-cadherin(CDH1基因編碼產(chǎn)物)表達中發(fā)揮作用，LOXL3蛋白與核周膜SNAIL的相互作用協(xié)同下調(diào)CDH1基因的表達，提示LOXL3蛋白參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移(圖3A)。此外，SNAIL蛋白Ser-11位點的PKD1調(diào)節(jié)，PKD1促進LOXL3的上調(diào)及其與SNAIL的相互作用(圖3A)。SNAIL蛋白Ser-11位點的磷酸化導致與組蛋白脫乙?；?和2(HDAC1和HDAC2)以及LOXL3結(jié)合。SNAIL蛋白磷酸化與HDAC1和HDAC2形成的復合物在細胞核中穩(wěn)定，并促進腫瘤增殖標志物的上調(diào)，如Cyclin D1和AJUBA(圖3A)。有研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤中LOXL3參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。LOXL3的上調(diào)與黑色素細胞轉(zhuǎn)化中的致癌BRAF途徑有關(guān)[22]。此外，黑色素瘤中的LOXL3基因表達上調(diào)與LOXL3啟動子的低甲基化有關(guān)。LOXL3基因沉默促進黑色素瘤細胞的DNA損傷反應，雙鏈斷裂的積累，導致G2/M期細胞的有絲分裂異常和細胞凋亡逃逸(圖3B)。LOXL3與維持基因組完整性和有絲分裂相關(guān)的不同蛋白質(zhì)結(jié)合，如BRCA2、RAD51、SMC1A、MSH2、SMC3和NUMA1[22]。以上這些研究結(jié)果提示，LOXL3蛋白在黑色素細胞惡性轉(zhuǎn)化和黑色素瘤存活和進展過程中，具有維持基因組穩(wěn)定性和有絲分裂完成的作用，進而發(fā)揮促癌活性。

在隊列研究中，Kasashima等[21]通過免疫組化法評估597例原發(fā)性胃癌組織中LOXL1、LOXL2和LOXL3蛋白的表達。結(jié)果表明：LOXL3蛋白主要表達于細胞核，LOX蛋白家族3個成員的陽性均與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預后不良密切相關(guān)。此外，TGF-β在胃癌細胞中誘導LOXL3上調(diào)[23]，表明LOXL3是TGF-β信號通路的下游靶分子，參與細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過程(圖3C)。

圖3 LOXL3蛋白在人類惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用機制

LOXL3在原發(fā)性乳腺癌和胸腔積液中均有表達。最近的一項研究中，Jeong等[24]使用免疫組化法檢測291例乳腺癌中LOX、LOXL1、LOXL2和LOXL3蛋白的表達；結(jié)果表明：LOXL3蛋白僅在13.4%的乳腺癌病例中呈陽性，并與腫瘤內(nèi)和瘤周炎癥、ER、PR和分子亞型具有相關(guān)性。LOXL3在其它各種類型的腫瘤中也有表達，如骨髓增生性腫瘤[25-26]和卵巢癌(原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤、腹膜和胸腔積液)[27]。卵巢癌患者的血漿中也檢測到LOXL3肽段[24]。此外，在結(jié)直腸癌患者的循環(huán)腫瘤細胞中檢測到LOXL3蛋白的表達，其表達量與治療反應和預后相關(guān)[28-29]。最近，Laurentino等[30]研究表明，膠質(zhì)母細胞瘤是LOXL3表達水平最高的惡性腫瘤，侵襲性是膠質(zhì)母細胞瘤患者復發(fā)和預后不良的主要因素，通過siRNA下調(diào)LOXL3基因的表達，可能有助于阻止U87MG細胞的黏附和侵襲。

5 總結(jié)與展望

近年對LOXL3蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，除了銅離子依賴性胺氧化酶的典型功能外，LOXL3蛋白還發(fā)揮著多種不同的作用。值得注意的是，LOXL3在胚胎發(fā)育和包括膠原蛋白病、纖維化和癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，這突出體現(xiàn)了LOXL3作為潛在治療靶點的重要性[31]。目前，LOX家族的非選擇性抑制劑β-APN已被研發(fā)，但由于LOX家族蛋白各成員之間的結(jié)構(gòu)相似性以及對其晶體結(jié)構(gòu)缺乏精確了解，使開發(fā)特異性的LOX抑制劑成為新的挑戰(zhàn)。最近，關(guān)于LOXL2/LOXL3雙重抑制劑的報道為獲得用于治療目的特定LOXL3抑制劑奠定了基礎[32]。為了全面理解LOXL3蛋白在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，需要解決以下幾個問題。(1)大部分的研究是針對腫瘤細胞系中LOXL3基因的下游靶點進行剖析，但LOXL3如何被上游基因進行表達調(diào)控及其降解過程仍不清楚。(2)LOXL3-sv1和LOXL3-sv2蛋白在惡性腫瘤中的亞細胞定位及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機制亟待深入分析。(3)為了更深入地明確LOXL3基因在腫瘤發(fā)生和進展中的作用，應建立基因敲入小鼠和基因敲除小鼠等工程小鼠模型，充分開展實驗動物模型的體內(nèi)研究。(4)需要進一步開發(fā)LOXL3單克隆抗體，同時對LOXL3蛋白的小分子抑制劑進行高通量篩選，以發(fā)現(xiàn)針對LOXL3基因高表達的人類惡性腫瘤的特異性抑制劑。