甜菜立枯病病原菌的分離和鑒定

劉丹陽(yáng)，崔汝菲，耿 貴，王宇光

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜是莧科屬，2年生草本植物，于世界范圍內(nèi)廣泛種植，有較高的經(jīng)濟(jì)適用價(jià)值[1]。甜菜塊根中的糖分含量極高，僅次于甘蔗，是中國(guó)第二大糖料作物，其加工品也深受廣大民眾喜愛(ài)[2]。隨著集約化生產(chǎn)的進(jìn)行，追求經(jīng)濟(jì)效益最大化的同時(shí)，部分農(nóng)作物也表現(xiàn)出土傳病害現(xiàn)象，造成了不同程度的經(jīng)濟(jì)損失，甜菜就是典型的土傳病害作物之一[3]。甜菜的土傳主要病害有立枯病、褐斑病、根腐病等，其中甜菜立枯病又稱黑腳病，是甜菜苗期重要的病害之一。導(dǎo)致甜菜立枯病的原因，多為甜菜的生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到植物病原菌的侵染，甜菜根莖從而受到損傷，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。甜菜立枯病的侵染越重，保苗率就越低[5]。在中國(guó)各大甜菜產(chǎn)區(qū)均有立枯病頻發(fā)，一般發(fā)病率為20%～40%，嚴(yán)重可達(dá)60%～80%，甚至毀種[6]。病菌單獨(dú)或復(fù)合侵染可導(dǎo)致立枯病的發(fā)生，使得植株養(yǎng)分和水分流失，導(dǎo)致作物減產(chǎn)，同時(shí)莖部纖維受損引起植株倒伏[7]。王文君等[8]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜幼苗受到立枯病菌侵害時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)明顯較弱，真葉出土?xí)r間慢，莖基部出現(xiàn)黃褐色病斑等病癥。咸洪泉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，由于種植地區(qū)的不同，氣候環(huán)境等因素影響，導(dǎo)致甜菜苗期立枯病的病原菌不同，常見(jiàn)種類主要有：蛇眼病菌(Phoma betae)、鐮孢菌(Fusarium solani)、摔倒病菌(Pythium debaryanum)、絲核菌(Rhizoctonia solani)、苗腐病菌(Aphanomyces cochlioides)。也有研究表示，栽培甜菜上的土傳真菌鐮孢菌可引起甜菜鐮刀菌黃化和立枯病，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[10]。然而，土壤傳播病原體鐮孢菌(Fusarium solani)年復(fù)一年地存在于土壤中，早已成為植株病害的致命殺手[11]。鐮孢菌的主要種類有腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、木賊鐮孢菌(F.equseti)、尖孢鐮孢菌 (F.oxysporum)和層 出 鐮孢菌(F.proliferatum)等[12]。導(dǎo)致植物立枯病的病原菌有很多種，為找到于甜菜致病的病原菌種類，從而需進(jìn)行此次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)甜菜病害的發(fā)生、分析、防治等國(guó)內(nèi)外有許多報(bào)道，但缺乏對(duì)甜菜立枯病病原菌種類的了解，可能會(huì)對(duì)病因判斷失誤，不能及時(shí)控制病害，造成經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過(guò)對(duì)黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜生長(zhǎng)時(shí)期的病害調(diào)查以及植株病原菌分析，對(duì)致病性進(jìn)行初步研究，以期為哈爾濱市呼蘭區(qū)甜菜的立枯病防治工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

甜菜立枯病樣品于2021年采自黑龍江哈爾濱市黑龍江大學(xué)試驗(yàn)室，甜菜品種為KWS1176，將種子置于甜菜重茬二年的實(shí)驗(yàn)土中種植。采用組塊分離法，將甜菜幼苗病根剪成1 cm長(zhǎng)接入PDA平板，于28℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后，挑取少量菌絲在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和致病性確定菌株，命名為L(zhǎng)1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌絲于光學(xué)顯微鏡下鏡檢。參考許志[13]的方法觀察病原菌形態(tài)特征，并對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，初步明確菌株的分類地位。

1.2.2 致病性測(cè)定 首先，將甜菜種子種于培養(yǎng)盆中，每盆均勻播種20粒，重復(fù)3盆，準(zhǔn)備每盆接種病原菌3處。然后，將培養(yǎng)好的菌株L1用打孔器制成8 mm菌餅，接種在培養(yǎng)盆內(nèi)甜菜生長(zhǎng)點(diǎn)的周圍，以不接種病原菌為對(duì)照。并觀察記錄甜菜生長(zhǎng)和發(fā)病情況。同時(shí)，將發(fā)病部位組織進(jìn)行再次分離和鏡檢，對(duì)比形態(tài)特征是否與接種的菌株一致。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 利用生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速提取試劑盒進(jìn)行菌株基因組提取，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和 ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，采用 25 μL PCR 反應(yīng)體系：基因組DNA(20～25 ng/μL)0.5 μL、10*Buffer(Mg2+)2.5 μL、dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL、酶0.2 μL、引物 ITS1(10 μmol/L)、引物 ITS4(10 μmol/L)，加 ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序如下：94℃ 4 min；94℃ 45 s，55℃45 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將獲得序列與BLAST比對(duì)，運(yùn)用MEGA11軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定實(shí)驗(yàn)菌株分類地位[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜立枯病病原菌分離

苗期甜菜受到立枯病感染會(huì)出現(xiàn)根莖組織受傷發(fā)黑，變細(xì)，出現(xiàn)倒伏，葉片枯黃等并發(fā)癥狀，見(jiàn)圖1。依據(jù)發(fā)病癥狀采集菌株樣本，而后進(jìn)行組織分離，獲得目標(biāo)菌株。通過(guò)觀察分離菌株在PAD培養(yǎng)基上的特征，發(fā)現(xiàn)菌株的氣生菌絲比較豐富，菌落呈圓形，菌絲為灰白色，生長(zhǎng)速度快，菌落呈環(huán)形放射狀，見(jiàn)圖2。

2.2 致病性測(cè)定

待幼苗生長(zhǎng)至7天時(shí)，將L1菌株接種于甜菜幼苗培養(yǎng)盆內(nèi)的土壤中，實(shí)時(shí)觀察生長(zhǎng)。菌株L1接種3天時(shí)，甜菜幼苗開(kāi)始出現(xiàn)病狀。從幼苗根莖處開(kāi)始萎蔫，病處根莖開(kāi)始枯萎逐漸細(xì)小。隨著接種菌落時(shí)長(zhǎng)增加，患病根莖由枯黃逐漸呈現(xiàn)黑色，最后直至甜菜幼苗死亡。在接種菌株5天時(shí)，將接種菌株幼苗與未接種菌株CK進(jìn)行對(duì)比，能明顯對(duì)比出，未接種菌株CK葉片更綠，幼苗根莖更加挺拔，幼苗根莖處未出現(xiàn)枯萎、細(xì)小、變黑等染病癥狀，見(jiàn)圖3 a；接種L1菌株的培養(yǎng)盆中，幼苗根莖普遍呈現(xiàn)枯萎狀，幼苗葉片泛黃，幼苗地上部倒伏染病癥狀。觀察圖3 b可得，接種菌株10天后，甜菜幼苗地上部倒下嚴(yán)重，根莖染病處完全枯萎，呈黑色。

圖3 未接種菌株CK與接種菌株對(duì)比圖

2.3 致病菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株L1于PAD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌落為灰白色，表面呈環(huán)形放射狀。利用顯微鏡觀察，分生孢子呈鐮刀型。大型孢子大小為(33.21～49.72)μm×(7.75～9.21)μm，多數(shù)有0～3個(gè)隔膜，散生于氣生菌絲上；小型孢子大小為(16.28～24.28)×(5.52～9.4)μm，多為單細(xì)胞，少數(shù)有隔膜，形狀有卵形、橢圓形，形成于氣生菌絲上，見(jiàn)圖4。

圖4 大型分生孢子和小型分生孢子

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 將L1菌株進(jìn)行分子鑒定，將該菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得約543bp的擴(kuò)增條帶，得到菌株L1的序列長(zhǎng)度為543 bp(GenBank的登錄號(hào)為DQ513513)，見(jiàn)圖5。使用Mega11軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖6系統(tǒng)樹(shù)可知，黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜立枯病病原分離物L(fēng)1菌株與腐皮鐮孢菌(Fusarium solanistrain)MW165532.1 39-b處于同一個(gè)分支，近緣關(guān)系最近。通過(guò)結(jié)合甜菜立枯病病原菌的形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，可將引起黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜苗期立枯病的病原菌L1確定為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)。

圖5 菌株P(guān)CR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳

圖6 菌株L1序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論與結(jié)論

鐮孢真菌是重要的植物病原真菌之一，是多種植物在生長(zhǎng)過(guò)程中一大病害，是世界糧食生產(chǎn)體系中重要的致病因素之一[15]。鐮孢菌易滋生在潮濕溫暖地區(qū)，病發(fā)嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致作物產(chǎn)量驟減，損失達(dá)到50%以上[16-17]。以及不同的地理、氣候、土壤等條件的差異[7]，導(dǎo)致不同鐮孢菌的組成也各不相同[18]。本實(shí)驗(yàn)采集的病原菌試材為黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)的幼苗期甜菜，該種植地位于中國(guó)半干旱地區(qū)。推測(cè)此病原菌多在甜菜幼苗時(shí)期侵染的原因，是由于當(dāng)?shù)氐臍夂蛴绊?，使得甜菜苗期的生長(zhǎng)環(huán)境過(guò)于潮濕，從而利于病原菌的滋生。鐮孢菌屬中所含毒素，不僅會(huì)造成甜菜種子的發(fā)芽減少，發(fā)育不良等病癥，還可引起植株萎蔫和壞死[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)論，接種病原菌3天后的甜菜幼苗開(kāi)始出現(xiàn)幼苗倒伏、根莖部枯萎、壞死等情況。鐮孢菌單獨(dú)或復(fù)合侵染都可導(dǎo)致立枯病的發(fā)生，使得植株養(yǎng)分和水分流失，導(dǎo)致作物減產(chǎn)，同時(shí)莖部纖維受損引起植株倒伏[7]。有很多種鑒定鐮孢菌基因位點(diǎn)的方法，在前人研究中，ITS、tef1等方法最常使用[20]。如，高園園等[21]基于ITS和tef1基因序列的分子鑒定，構(gòu)建其基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定了引起山東大蒜根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)。劉文杰等[22]研究結(jié)果顯示，基于rDNAITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定引起山東青島膠州南瓜果實(shí)腐爛的病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，ITS和tef1基因序列的分子鑒定相結(jié)合，構(gòu)建該基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將分離出的菌株L1確定為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)，為甜菜該病原菌的防控提供了理論基礎(chǔ)。但研究該地區(qū)甜菜立枯病的病原菌生物學(xué)特征的探究是開(kāi)展有效防控的前提條件，還需要進(jìn)一步研究。除此以外，腐皮鐮孢菌的侵染范圍很廣[23]，不僅可以造成各種植物的立枯病、根腐病外，還會(huì)侵染其他農(nóng)產(chǎn)品，如桃子[24]、咖啡[25]、香蕉[26]等，造成其果腐病，造成茶葉、刺桐等的葉斑病以及枯萎病[27-28]。本研究中鑒定的L1菌株的侵染范圍如何，有待進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，該研究結(jié)果可為防控管理該病害的下一步研究提供依據(jù)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)立枯病甜菜進(jìn)行分離獲得菌株L1，并對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)觀察初步確定引起黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)甜菜立枯病的病原菌是鐮孢菌屬(Fusarium)真菌。而后進(jìn)一步確定病原，經(jīng)過(guò)柯赫氏法則認(rèn)證，通過(guò)運(yùn)用分子生物手段對(duì)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)。