3株枯草芽孢桿菌對(duì)煙草白粉病的防效

蔡永占，王瑞寶，白 濤，劉有才，韓小女，王 斌，華小兵，李 誠(chéng)，毛明林，字文霖

（1云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000；2宣威市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南宣威 655400；3微生物菌種篩選與應(yīng)用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，昆明 650217；4云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司，昆明 650217）

0 引言

煙草白粉病(Erysiphe ciohoracearam)是由二孢白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)引起的氣傳真菌性病害[1-2]，通常老葉先發(fā)病，主要危害時(shí)期為旺長(zhǎng)期前后，明顯癥狀為葉片正反面附著一層白粉。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)西南部分地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，導(dǎo)致煙葉烘烤困難，喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值。煙草白粉病的防治需遵循“預(yù)防為主、綜合防治”的方針，當(dāng)前多選取抗病品種選育[3-6]、化學(xué)藥劑施用[7-11]及加強(qiáng)栽培管理[11]等措施防治煙草白粉病，但存在大面積推廣難、抗藥性強(qiáng)、受氣候環(huán)境因素制約等問(wèn)題，尤其是宣威植煙區(qū)域，品種以‘云煙87’為主，屬易感白粉病品種，綜合防治白粉病是一大難題。通過(guò)篩選應(yīng)用有益微生物抑制煙草白粉病的發(fā)生是煙葉高質(zhì)量綠色發(fā)展有效途徑。大量研究[12-19]表明，有益功能微生物尤其是芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對(duì)煙草白粉病的發(fā)生及防治具有優(yōu)良效果，無(wú)污染、無(wú)殘留、安全高效等優(yōu)點(diǎn)使得生物防治成為現(xiàn)代煙葉生產(chǎn)過(guò)程中最具應(yīng)用前景的防治手段。筆者借鑒前人的研究方法，通過(guò)篩選對(duì)煙草白粉病具有高效防治效果的功能微生物，并制成懸浮制劑，采用葉面噴施的方法對(duì)煙草白粉病進(jìn)行預(yù)防和防治，以期篩選出效果優(yōu)于常用化學(xué)農(nóng)藥的微生物菌株，并開(kāi)發(fā)成生物制劑用于煙草白粉病防治，為曲靖煙區(qū)煙葉的持續(xù)、協(xié)調(diào)、優(yōu)質(zhì)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究田間試驗(yàn)于2020年4—10月在曲靖市宣威市德祿鄉(xiāng)（海拔1835.8 m，26.464070°N、103.956701°E）進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)在云南省微生物發(fā)酵工程研究中心有限公司溫室大棚進(jìn)行。

1.2 供試材料

供試作物為‘云煙87’。供試藥劑為微生物菌種篩選與應(yīng)用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心從‘云煙87’葉片中篩選獲得的對(duì)白粉病具有明顯效果的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)（菌株編號(hào)分別為YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071）制得的懸浮制劑和菌懸液，25%嘧菌酯懸浮劑（江西紅土地化工有限公司生產(chǎn)），500 g/L甲基硫菌靈懸浮劑（上海滬聯(lián)生物藥業(yè)技術(shù)股份有限公司）。供試器材為舜宇OD140B光學(xué)顯微鏡。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 室內(nèi)防效研究

（1）供試煙草的培養(yǎng)。將混勻的土壤裝入口徑12cm、高度10 cm的黑色育苗盆中，每盆種1株煙草幼苗，待煙草長(zhǎng)至團(tuán)棵期時(shí)，用白粉孢子懸浮液均勻噴霧于煙草葉片，調(diào)整溫室溫度為27℃，濕度為75%，利于白粉病的發(fā)生。

（2）供試菌液的制備。將枯草芽孢桿菌分別活化后，挑取單菌落放入250 mL LB液體培養(yǎng)基中，在170 r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)72 h，備用。

（3）溫室防效探究。待煙草葉片初現(xiàn)病斑時(shí)，吸取供試菌株發(fā)酵液200 mL，加入0.1 g吐溫20和0.2 g黃原膠攪拌均勻制備成菌量達(dá)1.0×108CFU/mL的懸浮制劑，用清水稀釋10倍噴施于葉片表面，每株葉片噴20 mL。設(shè)噴清水的植株為空白對(duì)照，25%嘧菌酯懸浮劑2000倍液為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理15株煙苗，每隔3天噴施1次，共噴施3次，并于第3次用藥后7天調(diào)查最終發(fā)病情況，計(jì)算各處理所有葉片病情指數(shù)和防效[式(1)～(2)]。

（4）抑制白粉孢子萌發(fā)的研究。將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液制備成菌量為1.0×108CFU/mL菌懸液，分別取50 μL均勻涂布到撒有白粉孢子的瓊脂玻片上，25℃真菌培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h后鏡檢，根據(jù)芽管長(zhǎng)度判斷白粉孢子萌發(fā)情況。

1.3.2 大田防效研究

（1）枯草芽孢桿菌不同用量對(duì)白粉病發(fā)生的影響。選取易發(fā)白粉病地塊，在白粉病發(fā)病初期將供試菌發(fā)酵液制備成懸浮生防制劑，分別取50、100、150倍液噴施于發(fā)病植株葉片，同時(shí)設(shè)置噴清水的處理為空白對(duì)照，甲基硫菌靈全量噴施為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理15株煙苗，3次重復(fù)，每隔3天用藥1次，連噴3次。第1次用藥前調(diào)查病害，最后1次用藥后3、7、10天分別調(diào)查病害，計(jì)算病情指數(shù)和防效。

（2）枯草芽孢桿菌與低毒化學(xué)農(nóng)藥協(xié)調(diào)使用對(duì)白粉病發(fā)生的影響。選取白粉病發(fā)病嚴(yán)重地塊，在白粉病發(fā)病初期選取防效最優(yōu)的供試菌株與低毒化學(xué)農(nóng)藥協(xié)調(diào)使用，全量、半量噴施甲基硫菌靈一次后，噴施不同用量懸浮制劑，同時(shí)設(shè)置單獨(dú)使用生防制劑的處理、單獨(dú)使用甲基硫菌靈的處理和清水對(duì)照，每個(gè)處理15株煙苗，3次重復(fù)，每隔3天用藥1次，連噴3次。第1次用藥前調(diào)查病害，最后1次用藥后3、7、10天分別調(diào)查病害，計(jì)算病情指數(shù)和防效。

1.4 調(diào)查與統(tǒng)計(jì)

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和防治效果計(jì)算方法參考GB/T 23222—2008。煙草白粉病病情調(diào)查分6個(gè)等級(jí)。0級(jí)—無(wú)病斑；l級(jí)—病斑面積占整個(gè)葉片面積5%以下；3級(jí)—病斑面積占整個(gè)葉片面積6%～10%；5級(jí)—病斑面積占整個(gè)葉片面積11%～20%；7級(jí)—病斑面積占整個(gè)葉片面積21%～40%；9級(jí)—病斑面積占整個(gè)葉片面積40%以上。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多組樣本間的差異顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)溫室白粉病發(fā)生的影響

供試菌株YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071懸浮劑稀釋10倍后使用，防效分別達(dá)70.49%、61.15%、69.71%（表1）。25%嘧菌酯懸浮劑較YWF-19-0068、YWF-19-0071防效不顯著；同時(shí)，25%嘧菌酯懸浮劑和YWF-19-0068防效顯著高于YWF-19-0070。

表1 株拮抗細(xì)菌對(duì)溫室煙草白粉病的防治效果

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)煙草白粉孢子萌發(fā)的影響

取供試菌株YWF-19-0068、YWF-19-0070和YWF-19-0071的菌懸液，平板計(jì)數(shù)法測(cè)定有效活菌數(shù)分別為8.40×108、5.7×108、7.90×108CFU/mL，將菌量調(diào)至1.0×108CFU/mL，分別將其稀釋為50、100、150倍3種濃度的菌懸液，取50 μL均勻涂布到撒有白粉孢子的瓊脂玻片上，在25℃真菌培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h后鏡檢結(jié)果表明，3株生防菌對(duì)煙草白粉孢子萌發(fā)均具有良好的抑制效果，隨著稀釋倍數(shù)的增加，抑制率逐漸降低（表2）。50倍液時(shí)抑制率分別為56.92%、56.92%、58.46%，100倍液時(shí)抑制率分別為41.54%、35.38%、33.85%，150倍液時(shí)抑制率分別為30.77%、24.62%、23.08%。

表2 生防菌抑制煙草白粉孢子萌發(fā)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 枯草芽孢桿菌對(duì)大田白粉病發(fā)生的影響

以甲基硫菌靈全量噴施作為陽(yáng)性對(duì)照，使用枯草芽孢桿菌懸浮制劑3次后，調(diào)查煙株白粉病發(fā)病情況。表3的結(jié)果表明，最后一次用藥3天后，懸浮菌液的防效隨稀釋倍數(shù)增加而降低，50倍液處理防效由高到低依次為 YWF-19-0068、YWF-19-0071、YWF-19-0070；100倍液處理和150倍液處理的防效由高到低均為YWF-19-0070、YWF-19-0068、YWF-19-0071。最后一次用藥7天后，菌懸浮劑的防效均大幅提升，隨稀釋倍數(shù)的增加，YWF-19-0068懸浮劑防效依次為54.10%、43.72%、40.13%；YWF-19-0070懸浮劑防效依次為65.98%、62.04%、56.34%；YWF-19-0071懸浮劑防效依次為57.05%、41.88%、40.18%。最后一次用藥10天后，YWF-19-0068懸浮劑50倍液處理防效降至46.85%；100倍液處理防效降至43.48%；150倍液處理防效降至38.02%。YWF-19-0070懸浮劑50倍液處理防效達(dá)65.50%；100倍液處理防效達(dá)65.23%；150倍液處理防效降至52.79%。YWF-19-0071懸浮劑用藥10天后防效均有所下降，50倍液、100倍液、150倍液防效依次為51.70%、39.83%、36.09%。整體而言，3株枯草芽孢桿菌對(duì)煙株白粉病均具有良好的防效，用藥3次后防效與全量甲基硫菌靈相當(dāng)，甚至更優(yōu)，但從持效期及使用成本看，YWF-19-0070更適合用于煙株白粉病的生物防治。

表3 煙草白粉病大田防治劑量對(duì)烤煙白粉病發(fā)生的影響

2.4 枯草芽孢桿菌與低毒化學(xué)農(nóng)藥協(xié)調(diào)使用對(duì)烤煙白粉病發(fā)生的影響

選取YWF-19-0070懸浮劑與低毒化學(xué)農(nóng)藥甲基硫菌靈協(xié)調(diào)使用。表4的結(jié)果表明，單獨(dú)使用YWF-19-0070懸浮劑時(shí)，隨著用藥后天數(shù)的增加，白粉病的防效呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，用藥10天后防效依然高于單獨(dú)使用甲基硫菌靈的處理。先噴施一次全量甲基硫菌靈后，每隔3天噴施一次枯草芽孢桿菌懸浮劑，用藥10天后，50倍液、100倍液、150倍液防效分別為83.06%、84.91%、77.73%，遠(yuǎn)高于甲基硫菌靈全量噴施處理。甲基硫菌靈半量噴施一次后，每隔3天噴施1次生防制劑，用藥10天后，隨著稀釋倍數(shù)的增加，防效分別達(dá)75.01%、60.23%、72.13%，除100倍液處理低于半量甲基硫菌靈防效外，其余均高于甲基硫菌靈處理的防效。整體而言，使用甲基硫菌靈與否，對(duì)煙草白粉病的防治并無(wú)顯著促進(jìn)作用，反而噴施菌懸浮劑的處理防效遠(yuǎn)勝于使用甲基硫菌靈處理。

表4 枯草芽孢桿菌與低毒化學(xué)農(nóng)藥協(xié)調(diào)使用對(duì)烤煙白粉病的影響

3 結(jié)論

（1）本研究的3株枯草芽孢桿菌菌懸液處理后的白粉孢子鏡檢結(jié)果表現(xiàn)為不萌發(fā)或萌發(fā)率較低，已萌發(fā)孢子的芽管出現(xiàn)畸形，扭曲成念珠狀，胞質(zhì)外流，或頂端膨大，不能發(fā)育成正常的菌絲體，這一結(jié)果與前人[7,10,20-22]的研究結(jié)果一致。

（2）3株枯草芽孢桿菌YWF-19-0068、YWF-19-0070、YWF-19-0071發(fā)酵液制備的懸浮劑對(duì)煙草室內(nèi)防效分別達(dá)70.49%、61.15%、69.71%。菌株YWF-19-0070懸浮劑的大田防效遠(yuǎn)優(yōu)于甲基硫菌靈。同時(shí)，菌株YWF-19-0070懸浮劑與甲基硫菌靈協(xié)調(diào)使用在一定程度上可以提升對(duì)煙草白粉病的防效，但不同稀釋倍數(shù)下的持效期不如YWF-19-0070懸浮劑穩(wěn)定，可能與該菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等抑菌功能物質(zhì)的數(shù)量多、活性強(qiáng)有關(guān)系。

（3）芽孢桿菌作為有益微生物與病原真菌的拮抗機(jī)制廣泛存在，芽孢桿菌在促進(jìn)煙株生長(zhǎng)與防病方面發(fā)揮著重要作用，這除與有益微生物分泌生長(zhǎng)激素有關(guān)外，還與能誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)及提高相關(guān)防御酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)系統(tǒng)抗性有關(guān)[23-28]。

4 討論

枯草芽孢桿菌類(lèi)有益微生物對(duì)于作物真菌性病害的防治具有優(yōu)良效果。本研究單獨(dú)使用生防制劑的研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，但證實(shí)功能性代謝產(chǎn)物的數(shù)量及活性對(duì)于煙草白粉病的防治更具有指導(dǎo)意義與研究?jī)r(jià)值。同時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)于增強(qiáng)煙株地下部長(zhǎng)勢(shì)，豐富土壤有益功能微生物同樣功不可沒(méi)，關(guān)于根施微生物菌劑增強(qiáng)作物抗病性的研究較多，但關(guān)于其與葉部病害減輕的機(jī)理揭示研究較少。筆者在此大膽設(shè)想，是否可以通過(guò)根施功能性生防菌劑結(jié)合葉面噴施對(duì)白粉病具有優(yōu)良防效的生防制劑，來(lái)實(shí)現(xiàn)煙草真菌性病害真正意義上的生物防治，但此設(shè)想還需進(jìn)一步研究及論證。本研究中的菌株YWF-19-0070作為煙草白粉病葉面噴施的潛力菌株，制備成懸浮劑后對(duì)白粉病的抑制效果明顯，持效期穩(wěn)定，可作為煙草生產(chǎn)過(guò)程中白粉病生物防治的生防產(chǎn)品廣泛應(yīng)用。