煙蚜取食對(duì)抗、感煙草品種信號(hào)分子和CAT活性的影響

孫計(jì)平，李雪君，孫 煥

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南許昌 461000）

0 引言

中國是煙草種植大國，尤其是烤煙，是國內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]，煙草生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展事關(guān)行業(yè)發(fā)展全局。煙蚜是世界性害蟲，也是國內(nèi)煙草的主要害蟲之一[2]。煙蚜通過刺吸取食危害煙草，造成系統(tǒng)性損傷[3]，同時(shí)分泌甜而黏的“蜜露”，常誘發(fā)煙葉產(chǎn)生“煤污病”。此外，煙蚜還傳播黃瓜花葉病(cucumber mosaic virus，CMV)和馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，PVY)等多種病毒病[4]。化學(xué)農(nóng)藥防治煙蚜見效快，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上被廣泛使用，但容易產(chǎn)生抗藥性，研究表明，煙蚜已經(jīng)對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性[5-6]。因此，防治蚜蟲最有效的方法是推廣抗蚜蟲品種，利用其防御機(jī)制控制蚜蟲是一種有效且環(huán)境友好型防治措施[7]。

蚜蟲取食會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系列化學(xué)反應(yīng)，包括水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)等多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控[8]，從而抑制蚜蟲取食、產(chǎn)卵等行為[9]，減輕煙蚜危害。茉莉酸是植物抗蟲的主要信號(hào)分子，在植物防御昆蟲中發(fā)揮著重要作用[10]。蚜蟲取食小麥同時(shí)激活了茉莉酸信號(hào)和水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑[11]，受到蚜蟲為害后，高鉀小麥體內(nèi)JA含量顯著提高[12]。榆癭蚜為害榆樹葉片后，榆樹葉片JA含量顯著增加[13]。一氧化氮(carbon monoxide，NO)是植物體次生代謝物合成的必需信號(hào)分子之一，可以通過合成苯丙氨酸解氨酶促進(jìn)SA的合成，通過SA改變過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性以增強(qiáng)植物防御反應(yīng)[14]。不同口器昆蟲取食煙草葉片后，烤煙和白肋煙均能激發(fā)植物防御初期的NO和JA等信號(hào)分子的防御響應(yīng)[15]，提高相關(guān)酶活性。武德功[16]研究認(rèn)為，玉米品種的抗蚜性與POD和CAT活性的變化具有相關(guān)性。關(guān)于煙草品種抗蚜機(jī)制的研究較少，煙蚜取食可誘導(dǎo)煙草體內(nèi)信號(hào)物質(zhì)NO和H2S含量增加、防御酶活性提高[17]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)煙草品種蚜蟲抗性進(jìn)行了鑒定，并對(duì)不同煙蚜抗性煙草品種受到蚜蟲侵襲5 h后JA含量與0 h進(jìn)行了比較[18]，不同煙蚜抗性煙草品種在受到煙蚜侵襲后NO含量和酶活性變化的研究較少。為深入研究不同蚜蟲抗性煙草品種受到蚜蟲侵襲后信號(hào)分子變化趨勢(shì)，本研究選用6個(gè)不同煙蚜抗性的煙草品種，研究煙蚜侵襲不同時(shí)間對(duì)JA和NO含量以及CAT活性的影響，以期揭示煙草品種對(duì)煙蚜的防御響應(yīng)機(jī)制，并為煙草抗蚜材料的進(jìn)一步應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6個(gè)供試煙草品種具體見表1，均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

表1 參試品種

1.2 煙苗培養(yǎng)和接種蚜蟲

2020年3月，在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育苗大棚采用漂浮育苗培育煙苗。煙苗培養(yǎng)至3～4片真葉時(shí)，移栽到花盆中培養(yǎng)，每盆1株，每個(gè)品種18盆。煙苗培養(yǎng)至7～8片真葉，每個(gè)品種選擇有代表性15株接種蚜蟲，每株接種4齡無翅成蚜30頭，0、3、6、9 h分別取葉片，5株混合取樣作為1個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 樣品測(cè)試分析

1.3.1 茉莉酸含量測(cè)定 參考實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定方法[18]。稱取0.1 g樣品，液氮中研磨，加入1 mL80%甲醇溶液，-20℃過夜；4℃、8 000 r/min離心1 h，取上清液，過C-18固相萃取柱，氮?dú)獯蹈桑４鎮(zhèn)溆?；上機(jī)前加入pH 7.4的PBS緩沖液，定容1 mL；室溫條件下放置30 min，4℃離心15 min，取上清液保存于4℃冰箱，采用超高效液相色譜測(cè)定。

1.3.2 一氧化氮含量測(cè)定 采用試劑盒提?。ㄔ噭┖胁少徲谔K州科銘生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為NO-1-G），酶標(biāo)儀微量法測(cè)定，測(cè)定步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行，讀取特定產(chǎn)物在波長(zhǎng)550 nm的吸光值，根據(jù)說明書計(jì)算樣品一氧化氮含量。

1.3.3 過氧化氫酶活性測(cè)定 采用過氧化氫酶試劑盒提取，測(cè)定步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行（試劑盒采購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為CAT-1-Y），采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)240 nm，根據(jù)說明書計(jì)算樣品CAT活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖采用Excel 2007。方差分析應(yīng)用DPS 14.5軟件，采用LSD法進(jìn)行多重比較和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙蚜取食對(duì)不同煙蚜抗性煙草品種茉莉酸含量的影響

不同煙草品種煙蚜取食后茉莉酸含量均呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢(shì)（圖1），所有品種JA含量均在煙蚜取食6 h達(dá)到最高，且顯著高于其他時(shí)間段。煙蚜取食前，茉莉酸含量表現(xiàn)為抗蚜品種＞中抗品種＞感蚜品種＞高感品種，品種間差異達(dá)到顯著水平。煙蚜取食3 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’茉莉酸含量增加量最多，比0 h增加67.59 ng/g，其次為‘龍舌煙’、‘毛煙’，茉莉酸分別增加57.70、59.63 ng/g，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’茉莉酸增加量分別為37.56、35.90、36.19 ng/g。煙蚜取食6 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’茉莉酸含量比0 h增加357.26 ng/g，其次為‘龍舌煙’和‘毛煙’，茉莉酸分別增加348.18、329.50 ng/g，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’茉莉酸增加量均低于300 ng/g。煙蚜取食9 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’茉莉酸含量比0 h增加275.55 ng/g，其次為‘龍舌煙’和‘毛煙’，茉莉酸分別增加250.65、249.47 ng/g，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’茉莉酸增加量分別為213.119、206.40、201.99 ng/g。不同煙草品種受蚜蟲侵襲后茉莉酸含量增加量不同，總體表現(xiàn)為抗蚜品種＞中抗品種＞感蚜品種＞高感品種。

圖1 煙蚜取食對(duì)不同抗性煙草品種JA含量的影響

2.2 煙蚜取食對(duì)不同煙蚜抗性煙草品種一氧化氮含量的影響

由圖2可知，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’各時(shí)間點(diǎn)一氧化氮含量均高于其他品種，其中0、6、9 h差異達(dá)顯著水平。煙蚜取食后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’、中抗品種‘毛煙’和‘龍舌煙’的一氧化氮含量變化均呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢(shì)，一氧化氮含量均在煙蚜取食3 h達(dá)到最高，其次為煙蚜取食6 h后，這2個(gè)時(shí)間段一氧化氮含量顯著高于其他時(shí)間段。感蚜品種‘SpeightG-28’、高感蚜蟲品種‘云煙97’和‘螺絲頭2474’在煙蚜取食3 h后一氧化氮含量與0 h差異不顯著，在煙蚜取食6 h和9 h后一氧化氮含量顯著低于0 h。

圖2 煙蚜取食對(duì)不同抗性煙草品種一氧化氮含量的影響

所有參試品種的一氧化氮含量均在煙蚜取食9 h后最低，與0 h相比較，感蚜品種‘SpeightG-28’、高感蚜蟲品種‘螺絲頭2474’和‘云煙97’的一氧化氮含量下降幅度較大，分別下降了20.41%、21.31%和29.23%；‘豎把老母雞2113’、中抗品種‘龍舌煙’和‘毛煙’的一氧化氮含量下降幅度相對(duì)較小，分別下降了6.36%、8.96%和11.97%。

2.3 煙蚜取食對(duì)不同煙蚜抗性煙草品種CAT活性的影響

由圖3可知，所有品種CAT活性均以蚜蟲取食前最低，煙蚜取食后，CAT活性表現(xiàn)為增加趨勢(shì)，蚜蟲取食后9 h最高，極顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)。煙蚜取食3 h后，中抗品種‘龍舌煙’CAT活性增加量最多，比0 h增加19.40 U/mg，其次為抗蚜品種‘豎把老母雞2113’。煙蚜取食6 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’和中抗品種‘毛煙’CAT活性增加量最多，分別22.34、22.73 U/mg。煙蚜取食9 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’CAT活性增加量最多、增幅最大，比0 h增加43.21 U/mg，是0 h的1.66倍。

圖3 煙蚜取食對(duì)不同抗性煙草品種CAT活性的影響

3 結(jié)論

煙蚜取食可誘導(dǎo)煙草植株體內(nèi)信號(hào)物質(zhì)NO和JA含量增加、CAT活性提高，進(jìn)而產(chǎn)生系列防御反應(yīng)，抗蚜蟲煙草品種在受到煙蚜為害后信號(hào)分子和酶活性變化快，且升高幅度大于感蚜蟲品種。煙蚜為害前后煙草葉片NO和JA含量及CAT活性的變化可以作為煙草品種抗蚜性鑒定生理指標(biāo)，為進(jìn)一步深入研究煙草品種抗蚜機(jī)理提供了參考。

4 討論

植物防御反應(yīng)是植物應(yīng)對(duì)昆蟲取食的特異性反應(yīng)，可激發(fā)植物體內(nèi)乙烯、SA、JA、H2O2等多條信號(hào)途徑[15]。JA是關(guān)鍵的信號(hào)分子之一，與植物的抗逆性密切相關(guān)[18,22]，JA最重要的作用就是對(duì)傷口誘導(dǎo)的防御響應(yīng)[23]。張艷敏等[15]研究‘云煙87’接種蚜蟲后發(fā)現(xiàn)葉片和根系中JA含量均顯著增加。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究認(rèn)為，蚜蟲為害5 h后，煙草葉片JA含量顯著增加，且抗蚜品種受到蚜蟲侵襲后JA含量增幅也明顯高于其他品種[18]，但沒有進(jìn)行蚜蟲危害后多個(gè)時(shí)間段JA的變化研究。為了深入研究煙草品種受到蚜蟲侵襲后信號(hào)分子變化趨勢(shì)，選用不同抗蚜性的煙草品種接種蚜蟲，受到蚜蟲為害后，煙草葉片JA含量表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，煙蚜取食6 h后葉片JA含量達(dá)到峰值，且抗蚜品種JA含量的增量大于感蚜品種，因此結(jié)合前期研究結(jié)果，煙蚜取食5～6 h后取葉片測(cè)定JA含量，可以用于鑒定煙草品種的抗蚜性。

植物遭受到害蟲侵襲后，可以誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生防御信號(hào)物質(zhì)，進(jìn)而激活防御反應(yīng)提高抗蟲性[17]。信號(hào)分子NO參與植物逆境脅迫的防御反應(yīng)[24]，能夠介導(dǎo)植物細(xì)胞中防衛(wèi)基因表達(dá)[15]。Moloi等[25]研究認(rèn)為，蚜蟲取食能誘導(dǎo)小麥體內(nèi)NO的增加。余源嬋等[17]研究發(fā)現(xiàn)，煙蚜取食可誘導(dǎo)葉片NO含量顯著升高，不同品種NO含量達(dá)到峰值時(shí)間不同，推測(cè)信號(hào)分子NO參與了植物抗蟲性的誘導(dǎo)。張艷敏等[14]研究表明，煙蚜取食‘云煙87’煙株后，NO含量在葉部和根部均呈先增加后降低趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲為害煙草葉片后，不同煙蚜抗性煙草品種表現(xiàn)不同，抗蚜品種NO含量表現(xiàn)為先增加后下降，煙蚜取食3 h后NO含量達(dá)到峰值；感蚜品種NO含量在煙蚜取食3 h后與0 h差異不顯著，但煙蚜取食6、9 h后顯著降低，這與張艷敏等[14]研究認(rèn)為‘云煙87’接種蚜蟲9 h后NO含量達(dá)到峰值的結(jié)果不一致，可能是煙草品種、苗齡和接種蚜蟲數(shù)量差異所致；但研究結(jié)果均表明信號(hào)分子NO參與了煙蚜脅迫響應(yīng)，煙蚜取食前后NO含量變化可以作為鑒定煙草品種抗蚜性的輔助指標(biāo)。

昆蟲取食可誘導(dǎo)植物多種防御酶活性變化，以形成有效的防御體系來抵制蟲害[26]，抗蚜和感蚜玉米品種在受到蚜蟲為害后，SOD、POD、CAT均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，抗蚜品種升高率高于感蚜品種[16]。本研究結(jié)果表明，抗蚜和感蚜煙草品種在受到煙蚜侵襲后，CAT均表現(xiàn)為增加趨勢(shì)，煙蚜取食9 h后，抗蚜品種‘豎把老母雞2113’的CAT活性為0 h的1.66倍，顯著高于其他品種。由于試驗(yàn)只檢測(cè)到接蟲后9 h，CAT活性在9 h之后變化還有待于進(jìn)一步研究。

本研究?jī)H研究了6個(gè)煙草品種煙蚜取食后JA、NO含量和CAT活性的變化，初步探討了不同蚜蟲抗性煙草品種接蟲后的反應(yīng)。寄主植物對(duì)煙蚜的抗性是一個(gè)綜合性狀，不僅受葉片結(jié)構(gòu)、腺毛密度等物理特征的影響，而且受葉面化學(xué)成分的影響?？瓜x性是一個(gè)個(gè)體內(nèi)部全部基因的綜合效應(yīng)，因此，煙草品種抗蚜機(jī)理的研究還有待于進(jìn)一步開展。