高通量測(cè)序揭示高、低溫季節(jié)下長牡蠣菌群變化

徐皓月，張翔，谷莉，白昌明，辛魯生，王文彬，王崇明*

（1.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

牡蠣又稱為生蠔，根據(jù)《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》[1]，2019年貝類總產(chǎn)量占全國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量的69.67%，其中牡蠣產(chǎn)量占比為36.31%。牡蠣肉鮮美多汁，富含多種人體日常所需要的營養(yǎng)成分，營養(yǎng)價(jià)值較高，一直以來被稱作“海洋牛奶”[2]。我國養(yǎng)殖牡蠣種類較多，而市場(chǎng)中常見的食用牡蠣品種是長牡蠣。長牡蠣又稱太平洋牡蠣，原產(chǎn)于亞洲東部，具有抗逆性強(qiáng)、生長快等優(yōu)點(diǎn)[3]，被廣泛引進(jìn)到全球多個(gè)國家和地區(qū)養(yǎng)殖，也是我國經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)品中產(chǎn)量最大的貝類[1-4]。近幾年，未經(jīng)烹飪的鮮牡蠣受到部分消費(fèi)者的喜愛，尤其是冬季牡蠣集中上市季節(jié)（11月到次年3月）。而貝類濾食這一特性使得牡蠣易于富集海洋環(huán)境中的致病菌，從而成為人類致病菌的攜帶者。江河及海洋環(huán)境中普遍存在著大量的弧菌，是牡蠣中最常見的食源性致病菌，這些細(xì)菌往往會(huì)通過未被充分加熱的海產(chǎn)品或交叉污染的食物進(jìn)入人體，導(dǎo)致腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀[5-7]。長牡蠣所攜帶的微生物造成了長牡蠣食用過程中的安全隱患，而其體內(nèi)的微生物群落組成與長牡蠣生長或繁殖的環(huán)境有著巨大關(guān)系。在水體環(huán)境和生物餌料的影響下，長牡蠣體內(nèi)微生物種類、數(shù)量組成在時(shí)間和空間維度上存在差異[8]，給生食長牡蠣引發(fā)食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估造成困難。傳統(tǒng)微生物群落分析多依賴于培養(yǎng)微生物與其他方法相結(jié)合，但這種研究方法的局限性很大。而近幾年來，快速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等優(yōu)勢(shì)，不僅突破了傳統(tǒng)微生物學(xué)限制，而且可以在同一時(shí)間檢測(cè)樣品中的高豐度菌群和低豐度菌群，并將這些菌群的豐富度用數(shù)字的方式直觀地呈現(xiàn)出來[9]。

有學(xué)者采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)牡蠣的微生物群落結(jié)構(gòu)及其在冷藏過程中的變化進(jìn)行了分析[10-11]，在初始階段，牡蠣體的細(xì)菌群落在屬水平上豐度最高的菌屬為弧菌屬（Vibrio）、希瓦氏菌屬（Shewanella）和交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。長牡蠣在不同季節(jié)下的品質(zhì)有較大差異，食用安全風(fēng)險(xiǎn)也有可能不同，其微生物群落的季節(jié)變化目前尚未有研究報(bào)道。本文通過高通量測(cè)序技術(shù)分析高溫季節(jié)和低溫季節(jié)的長牡蠣微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化，旨在提供基礎(chǔ)信息以便可以更加深入地研究長牡蠣的菌群組成、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及相關(guān)調(diào)控技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

長牡蠣：青島市即墨區(qū)鰲山灣牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)。高溫季節(jié)采樣日期為2019年08月01日，當(dāng)日海水溫度25.2℃；低溫季節(jié)采樣日期為2019年11月12日，當(dāng)日海水溫度15.3℃。樣本采集后放置于便攜式冰箱中保存，并立即返回實(shí)驗(yàn)室，從采集的樣本中選取5只完整個(gè)體作為5份平行樣本，使用無菌海水沖洗后，使用已滅菌的刀具小心割斷其閉殼肌，使得外殼能夠完整去除，從而保留樣本軟體組織的完整性，在潔凈工作臺(tái)中切割挑取長牡蠣的閉殼肌、鰓、外套膜和肝胰腺4個(gè)組織，置于無菌離心管中。將最后提取出來的20個(gè)樣本簡(jiǎn)單處理后，進(jìn)行高通量測(cè)序。

磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）：北京索萊寶科技有限公司；taq mix酶：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物515F、806R：上海生工生物工程股份有限公司；GeneJET膠回收試劑盒：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒：Illumina公司；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96孔梯度型PCR擴(kuò)增儀、S-2000凝膠成像儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYY-6C電泳儀、WD-2105A微型離心機(jī)：北京六一生物科技有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；OSE-Y30電動(dòng)研磨器：天根生化科技（北京）有限公司；MK2000-2干式恒溫器：杭州奧盛儀器有限公司；CX30 DC速凍車載冰箱：佛山市艾凱電器有限公司；NovaSeq6000基因測(cè)序儀：Illumina公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)條件下高、低溫季節(jié)長牡蠣弧菌變化

高溫、低溫季節(jié)同批樣本各選取20個(gè)長牡蠣分別采用TCBS瓊脂培養(yǎng)基（用于篩選弧菌）進(jìn)行傳統(tǒng)純培養(yǎng)分析，分離株通過16S rDNA測(cè)序鑒定。

1.2.2 DNA提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

樣本基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）[12]法提取，通過濃度為1%的瓊脂糖凝膠在100 V電壓下電泳40 min檢測(cè)DNA的純度，采用微量紫外法進(jìn)行定量。根據(jù)鑒定細(xì)菌多樣性的試驗(yàn)?zāi)康模x擇V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，PCR擴(kuò)增使用的引物分別為515F和806R[12]，樣本DNA采用無菌水稀釋至1 ng/μL作為擴(kuò)增模板。引物序列為 515F:5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。擴(kuò)增程序：98 ℃，1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的混合與純化

根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，充分混勻后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，使用濃度為2%的瓊脂糖膠在80 V電壓下電泳40 min，隨后選擇長度為400 bp～450 bp的序列進(jìn)行切膠回收。

1.2.4 文庫構(gòu)建與測(cè)序

構(gòu)建文庫使用TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒[13]，文庫構(gòu)建好后經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測(cè)合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，去除引物序列后使用Flash軟件[14]進(jìn)行拼接，得到Tags數(shù)據(jù)；進(jìn)一步過濾處理[15]得到Clean Tags。根據(jù)擴(kuò)增子分析工具Qiime軟件[16]的Tags控制方法，進(jìn)一步過濾Tags之后，Tags序列通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列并去除[17]，得到有效數(shù)據(jù)。

1.2.6 分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種注釋

對(duì)1.2.5節(jié)得到全部有效數(shù)據(jù)通過Uparse軟件[18]進(jìn)行聚類，將Identity≥97%Tags數(shù)據(jù)聚類成OTUs。

對(duì)OTUs序列使用Mothur方法與SILVA132[19]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[20]進(jìn)行物種注釋（定閾值為0.8～1.0），獲得分類學(xué)信息并分別從界至種各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE[21]軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

根據(jù)所有樣本在綱水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度比為前20的屬根據(jù)豐度信息進(jìn)行聚類，以便于樣本中顯著差異物種水平聚集。

1.3 數(shù)據(jù)處理

為了對(duì)高、低溫季節(jié)長牡蠣體內(nèi)微生物群落變化情況進(jìn)行分析，將高溫和低溫季節(jié)各5份長牡蠣、共20個(gè)組織樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)通過NovoMagic云平臺(tái)合并成高溫季節(jié)組和低溫季節(jié)組，并利用平臺(tái)處理數(shù)據(jù)和繪制相關(guān)的數(shù)據(jù)圖進(jìn)行比較分析。同時(shí)，將高溫季節(jié)5份長牡蠣的鰓、閉殼肌、外套膜、肝胰腺組織的測(cè)序數(shù)據(jù)合并，低溫季節(jié)5份長牡蠣的鰓、閉殼肌、外套膜、肝胰腺組織測(cè)序數(shù)據(jù)也按照組織類型合并，采用平臺(tái)處理數(shù)據(jù)和繪制相關(guān)的數(shù)據(jù)圖進(jìn)行比較分析。根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取高、低溫季節(jié)或不同組織在不同分類水平上豐度值排名前十的物種生成相對(duì)豐度柱形圖，對(duì)長牡蠣菌群物種組成情況進(jìn)行展示。使用Qiime 軟件計(jì)算 Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goodscoverage指數(shù)，使用R軟件繪制稀釋曲線、等級(jí)聚類曲線。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)評(píng)估樣本中微生物群落的物種豐富度（ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

稀釋曲線（rarefaction curve，RC）和等級(jí)聚類曲線（rank abundance curve，RAC）常用于描述組內(nèi)樣本多樣性。圖1展示了樣本的稀釋曲線和等級(jí)聚類曲線圖。

圖1 稀釋曲線和等級(jí)聚類曲線Fig.1 Rarefaction curve and rank abundance

由圖1可知，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線趨向平緩，能夠看出測(cè)序數(shù)據(jù)量逐漸合理，即使有更多的數(shù)據(jù)量對(duì)與發(fā)現(xiàn)新的OTUs邊際貢獻(xiàn)也很小，而從等級(jí)聚類曲線的寬度和平滑程度能夠看出兩組樣本中物種分布比較均勻，夏季長牡蠣樣本中的物種豐富度要高于低溫季節(jié)長牡蠣樣本。

微生物群落的豐度和多樣性可通過Alpha多樣性來反映[22]。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)揭示樣本中細(xì)菌群落的豐富程度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)揭示樣本中細(xì)菌群落的多樣性。ACE指數(shù)與群落中物種數(shù)量呈正相關(guān)。Chao1指數(shù)與細(xì)菌群落的物種豐富度呈正相關(guān)。此外，Coverage代表各樣本的文庫覆蓋率，可以直接反映測(cè)序結(jié)果是否具有代表性。表1數(shù)據(jù)展示了樣本內(nèi)的Alpha多樣性指數(shù)。

表1 Alpha指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistic graph of alpha indices

由表1可知，相比于高溫季節(jié)，低溫季節(jié)的長牡蠣樣本中，ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)呈上升趨勢(shì)，而Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)呈下降趨勢(shì)，可以看出隨著季節(jié)溫度的降低，長牡蠣中微生物物種數(shù)量有所增加，但細(xì)菌群落的多樣性有所減少。且Coverage指數(shù)均在0.980以上，說明測(cè)序?qū)颖局屑?xì)菌的覆蓋率高，并且測(cè)序深度符合分析長牡蠣樣品中細(xì)菌多樣性的要求[23]。

2.2 長牡蠣測(cè)序結(jié)果OTU聚類及物種注釋

2.2.1 OTUs聚類

利用高通量測(cè)序技術(shù)得到高溫和低溫季節(jié)長牡蠣樣本下機(jī)原始數(shù)據(jù)后，通過相關(guān)處理后，得到高溫季節(jié)樣本的有效序列范圍為39 767條～69 778條，平均長度范圍為408 bp～429 bp；低溫季節(jié)樣本的有效序列范圍為44 105條～69 381條，平均長度范圍為397 bp～416 bp。對(duì)高溫季節(jié)和低溫季節(jié)這兩個(gè)季節(jié)樣本的Effective Tags進(jìn)行聚類后分別得到9625、9253個(gè)OTUs，其中高溫季節(jié)和低溫季節(jié)樣本共有OTUs 4 809個(gè)。

2.2.2 門、綱、目、科水平上高溫、低溫季節(jié)及不同組織間的長牡蠣物種注釋

高溫和低溫季節(jié)長牡蠣樣本整體的微生物物種注釋結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同季節(jié)下在門、綱、目和科水平上長牡蠣中細(xì)菌群落的物種注釋結(jié)果Fig.2 Species annotation results of bacterial communities in Crassostrea gigas at phylum,class,order and family levels in different seasons

在門的水平上，高溫季節(jié)長牡蠣樣品中附著的主導(dǎo)細(xì)菌為變形菌門（Proteobacteria，40.35%）、厚壁菌門（Firmicutes，19.87%）、放線菌門（Actinobacteria，12.23%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，10.39%）；而低溫季節(jié)長牡蠣樣品中放線菌門占比從12.23%下降為4.14%，不再是優(yōu)勢(shì)菌群；藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）占比由2.61%上升為9.05%，其它變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門仍然是主導(dǎo)菌群。在綱、目、科水平上，高溫季節(jié)的長牡蠣樣品以γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，23.52%）、梭菌目（Clostridiales，14.45%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，5.47%）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae，5.34%）和雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae，5.17%）為主；低溫季節(jié)的長牡蠣樣品以α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，33.00%）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales，22.87%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，22.87%）為主，放線菌和藍(lán)細(xì)菌未得到更為詳細(xì)的物種分類，變化趨勢(shì)同門水平一致。部分細(xì)菌組成的季節(jié)差異變化可能與細(xì)菌特性有關(guān)，根據(jù)相關(guān)資料[24-25]，藍(lán)細(xì)菌在干燥、低溫和長期黑暗等條件下，可形成休眠狀態(tài)的靜息孢子，比放線菌更加耐寒抗凍。其他細(xì)菌種類如梭桿菌門（Fusobacteria）等在高溫和低溫季節(jié)群落中占比相差不大。

長牡蠣不同組織的菌群結(jié)構(gòu)季節(jié)差異如圖3所示。

圖3 不同季節(jié)下長牡蠣4個(gè)組織中細(xì)菌群落在門、綱、目和科水平上的物種注釋結(jié)果Fig.3 Species annotation results of bacterial communities in 4 tissues of Crassostrea gigas at phylum，class，order and family levels in different seasons

高溫季節(jié)下鰓、閉殼肌和外套膜3種組織的菌群結(jié)構(gòu)較為相似，優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門。肝胰腺組織的微生物群落組成與上述3種組織中的差異較大，其中厚壁菌門占比（27.90%）比上述3種組織（14.99%～19.74%）高；軟壁菌門占比17.74%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組織（＜1%）；而變形菌門占比為25.80%，遠(yuǎn)低于在其它3個(gè)組織中的占比（42.75%～48.30%）。低溫季節(jié)下長牡蠣不同組織的微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，變形菌門在閉殼肌中占比21.74%，遠(yuǎn)小于在其它3種組織（46.92%～59.0%）；藍(lán)細(xì)菌門在肝胰腺中占比26.22%，而遠(yuǎn)高于其它3種組織（1.24%～5.76%）；軟壁菌門在鰓中占比20.35%，遠(yuǎn)高于其他3種組織（0.21%～0.76%）；擬桿菌門在閉殼肌中占比28.22%，遠(yuǎn)高于其他3種組織（4.29%～6.95%）。

從高溫季節(jié)到低溫季節(jié)，隨著生長季節(jié)溫度的降低，長牡蠣鰓、肝胰腺、閉殼肌組織的菌群構(gòu)成均發(fā)生了明顯變化。鰓組織中優(yōu)勢(shì)菌群厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門占比減少；變形菌門占比略有增加，其中α-變形菌綱占比大幅增加，主要包括紅螺菌目、鞘脂單胞菌目，而γ-變形菌綱占比大幅減少；軟壁菌門（Tenericutes）從0.87%大幅增加至20.34%，主要包括軟壁菌綱、支原體目、支原體科微生物；在肝胰腺組織中，優(yōu)勢(shì)菌群中厚壁菌門、軟壁菌門（支原體科）和放線菌門的占比大幅降低，藍(lán)細(xì)菌門的占比從6.31%大幅上升至26.30%。閉殼肌組織中，厚壁菌門、擬桿菌門占比上升明顯，而變形桿菌門占比大幅降低，其中莫拉氏菌科由19.06%降至0.16%。外套膜組織高低溫季節(jié)的菌群組成在門水平差異較小。從高溫季節(jié)到低溫季節(jié)，所有組織中變形菌門中的鞘脂單胞菌科細(xì)菌占比均大幅上升。

2.2.3 屬水平上高溫、低溫季節(jié)及不同組織間的長牡蠣微生物物種注釋

屬水平上高、低溫季節(jié)長牡蠣細(xì)菌群落組成情況如表2所示。

表2 高、低溫季節(jié)長牡蠣附著細(xì)菌群落在屬水平的分布情況Table 2 Distribution of bacterial communities attached to Crassostrea gigas at genus level in different seasons

高溫季節(jié)長牡蠣樣品中雙歧桿菌屬（5.11%）、棲水菌屬（5.03%）、內(nèi)源性單胞菌屬（4.81%）和甲基桿菌屬（3.04%）占比相對(duì)較高，乳桿菌屬（1.98%）等其它細(xì)菌的占比較低。低溫季節(jié)的長牡蠣樣品中雙歧桿菌屬（0.58%）、棲水菌屬（0.05%）占比大幅降低，內(nèi)源性單胞菌屬（3.50%）、甲基桿菌屬（1.79%）、乳桿菌屬（1.28%）占比有所降低，而鞘氨醇單胞菌屬（21.13%）、分類不明確的藍(lán)細(xì)菌（7.70%）、支原體屬（5.08%）的占比大幅增加。另外，高溫季節(jié)和低溫季節(jié)的長牡蠣樣本中存在大量占比＜0.1%的菌屬，分別達(dá)到63.42%和49.35%，表明長牡蠣組織的微生物種類組成整體較為復(fù)雜，且隨著季節(jié)溫度的降低組織的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)略有簡(jiǎn)化。

此外，食源性病原菌弧菌屬在青島鰲山灣養(yǎng)殖長牡蠣樣品中占比較小，并且從高溫季節(jié)到低溫季節(jié)存在較為明顯的降低趨勢(shì)，弧菌屬在高溫季節(jié)占比1.25%，在低溫季節(jié)僅占比0.10%。這一結(jié)果與傳統(tǒng)純培養(yǎng)的細(xì)菌16SrDNA鑒定結(jié)果一致，從20只高溫季節(jié)長牡蠣中分別分離到了46株弧菌，主要包括溶藻弧菌（11株）、克拉索氏弧菌（4株）、哈維氏弧菌（2株）和燦爛弧菌（2株）等，而從20只低溫季節(jié)長牡蠣中分離出17株弧菌，包括嗜環(huán)弧菌（5株）和燦爛弧菌（2株）等，高低溫季節(jié)均未分離到副溶血性弧菌。低溫季節(jié)生食長牡蠣的弧菌感染風(fēng)險(xiǎn)是否有所降低，有待進(jìn)一步研究。

高通量測(cè)序可以詳細(xì)準(zhǔn)確地反映長牡蠣不同組織、不同季節(jié)等附著的高豐度菌群和低豐度菌群。曹榮等[10-11]對(duì)牡蠣體中附著的細(xì)菌種類和牡蠣冷藏過程中的微生物群落變化進(jìn)行了研究分析，研究發(fā)現(xiàn)新鮮牡蠣樣品中附著的細(xì)菌以變形菌門（77.50%）、γ-變形菌綱（72.30%）和弧菌目（Vibrionales，49.30%）為主[10]。牡蠣冷藏過程中隨時(shí)間推移，弧菌屬（28.30%～6.2%）占比迅速減少，希瓦氏菌屬（Shewanella，10.30%）占比先迅速下降至4.00%，后又增加至19.50%，而交替假單胞菌屬（Pseudoalteromons，7.20%～32.20%）占比增加[11]。本文所研究的長牡蠣菌群結(jié)構(gòu)結(jié)果與上述報(bào)道在門和綱水平的優(yōu)勢(shì)菌群是較為一致的，但在目水平存在一定差異，如弧菌屬在群落中占比較低，占比僅有1.25%和0.10%，這可能受多種因素的影響[11，26]，比如牡蠣的品種、生長水域、餌料、捕獲季節(jié)、捕獲手段等。

不同季節(jié)溫度下長牡蠣4個(gè)組織中微生物豐度聚類熱圖（屬水平）見圖4。

圖4 不同季節(jié)溫度下長牡蠣4個(gè)組織中微生物豐度聚類熱圖（屬水平）Fig.4 Heat map of microbial abundance in 4 issues of Crassostrea gigas at genus level in different seasons

物種豐度熱圖將不同豐度微生物反映在顏色梯度上，從而可以對(duì)比橫向的樣本信息和縱向的物種信息。由圖4可知，長牡蠣中細(xì)菌的組成隨季節(jié)溫度變化發(fā)生了顯著變化。從高溫季節(jié)到低溫季節(jié)，長牡蠣中雙歧桿菌屬、棲水菌屬和擬桿菌屬等菌類占比明顯下降，而鞘氨醇單胞菌屬、支原體屬（Mycoplasma）和分類不明確的藍(lán)細(xì)菌等菌類占比有明顯提升，這可能是因?yàn)檫@幾種菌類都能更好地適應(yīng)低溫[24-25]，從而使得這幾種菌群在低溫季節(jié)中占比上升，成為長牡蠣中的高豐度菌群。由此可知，不同季節(jié)溫度下長牡蠣樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、種類及占比，均發(fā)生了改變。此外，可以清晰看出高溫季節(jié)的外套膜組織中弧菌屬占比（3.03%）明顯高于其他3個(gè)組織（0.48%～0.89%），且高溫季節(jié)4個(gè)組織中弧菌屬的占比均高于低溫季節(jié)4個(gè)組織（0.04%～0.16%）。之前的研究也表明副溶血性弧菌更容易定殖于外套膜中[27]，具體可能與夏季海洋環(huán)境中弧菌的豐度較高，長牡蠣濾食過程中外套膜與內(nèi)臟等形成的外套腔直接與海水、排泄物等接觸有關(guān)。

2.2.4 菌群物種進(jìn)化情況

通過多序列比對(duì)得到所有OTUs的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，選取相對(duì)豐度前20的屬所對(duì)應(yīng)的OTUs數(shù)據(jù)，并結(jié)合置信度信息構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌屬所對(duì)應(yīng)的門通過分支和扇形的顏色表示，不同樣本中該菌屬的豐度則由扇環(huán)外側(cè)的柱形圖來表示，結(jié)果見圖5。

圖5 OTUs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.5 Phylogenetic relationship of OTUs

從圖5可以看出，鞘氨醇單胞菌屬、內(nèi)源性單胞菌、支原體屬和分類不明確的藍(lán)細(xì)菌雖然在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上相對(duì)較遠(yuǎn)，但是相對(duì)豐度很高。

3 結(jié)論

為了掌握長牡蠣物種菌群組成情況，通過高通量測(cè)序法對(duì)高溫和低溫季節(jié)青島鰲山灣養(yǎng)殖長牡蠣軟組織中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果表明，高溫季節(jié)長牡蠣軟體組織群落以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門為主，在屬水平上雙歧桿菌屬、棲水菌屬、內(nèi)源性單胞菌屬和甲基桿菌屬的豐度較高。而低溫季節(jié)長牡蠣軟體組織中放線菌門占比大幅降低，藍(lán)細(xì)菌門占比有明顯上升，屬水平上鞘氨醇單胞菌屬、分類不明確的藍(lán)細(xì)菌和支原體屬的豐度較高。潛在食源性致病菌弧菌屬在高溫季節(jié)長牡蠣中占比（1.25%）高于低溫季節(jié)（0.10%），尤其是在高溫季節(jié)的外套膜組織（3.03%）占比較高。研究結(jié)果可為評(píng)估不同季節(jié)微生物群落組成對(duì)長牡蠣品質(zhì)與安全的影響提供參考，長牡蠣群落的季節(jié)變化對(duì)長牡蠣品質(zhì)、人體健康風(fēng)險(xiǎn)的影響應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。