河蜆鹽溶蛋白的提取及其加工特性

王伯華，王晨曦，劉麗萍，楊品紅，周順祥

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 常德 415000；3.順祥食品有限公司，湖南 益陽(yáng) 413200）

河蜆（Corbicula fluminea）是一種雜食性雙殼貝類。河蜆生長(zhǎng)速度快、繁殖率高，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，常常成為當(dāng)?shù)厮虻膬?yōu)勢(shì)底棲種群。河蜆不僅在我國(guó)太湖、洪澤湖、洞庭湖、大通湖等各大水域都有分布，且已傳播遍布世界各地，常被國(guó)外列入高危入侵物種[1]。河蜆肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2]，具有抑制腫瘤[3-4]、增強(qiáng)免疫力[5]、抗氧化[6-7]等多種生理活性。我國(guó)每年以數(shù)萬(wàn)噸的規(guī)模出口鮮活河蜆至國(guó)外[8]，國(guó)內(nèi)對(duì)河蜆的加工利用率較低，鮮銷為主，少部分以蜆干、罐頭等產(chǎn)品形式存在。因此，開(kāi)展河蜆資源的綜合利用研究十分必要。

鹽溶蛋白主要指肌原纖維蛋白，是一類結(jié)構(gòu)蛋白，在肌肉中具有重要功能，含量高，約占蛋白總量的50%左右。鹽溶蛋白與肌肉的嫩度、口感緊密相關(guān)，生物學(xué)性質(zhì)重要[9]。鹽溶蛋白具有在熱誘導(dǎo)條件下形成凝膠的能力，這對(duì)肉制品的保水性、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等特征極其重要[10]。不同肉類的鹽溶蛋白含量不同，理化性質(zhì)各異，加工性能差異顯著[11]。關(guān)于畜禽類鹽溶蛋白功能特性[12-13]的研究較多，也有學(xué)者進(jìn)行了鰱魚(yú)[14]、鯊魚(yú)[15]、魷魚(yú)[16]、河蚌[17]等水產(chǎn)品鹽溶蛋白特性的研究，而目前關(guān)于河蜆鹽溶蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)優(yōu)化了河蜆鹽溶蛋白的提取條件，并對(duì)其不同溫度時(shí)的持水性、持油性、起泡能力、乳化性質(zhì)等加工性能進(jìn)行了探究，以期為河蜆的高值化加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮河蜆（殼長(zhǎng)2.0 cm～3.0 cm）：市售；大豆分離蛋白（食品級(jí)）：山東富禾生物科技有限公司；植物調(diào)和油（食品級(jí)）：山東魯花集團(tuán)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、碘化鉀、硫酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鹽酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（分析純）：北京馳明瑞生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH-40A型pH計(jì)：杭州陸恒生物有限公司；LD4-2A離心機(jī)：北京恒奧德科技有限公司；A-88勻漿機(jī)：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；AL204天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；WFZ UV-2000分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；TDL-40B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 河蜆鹽溶性蛋白的提取方法

1）暫養(yǎng)取肉：將新鮮河蜆置于清水中，暫養(yǎng)1d～2d，至其吐出泥沙。去殼取肉備用。

2）搗碎：將20 g河蜆肉放入高速組織搗碎機(jī)中，加入80 mL 4℃的預(yù)冷超純水，搗成勻漿液。

3）離心：將河蜆勻漿液3 000 r/min離心15 min后去上清液，重復(fù)該步驟兩次，取出沉淀物放至燒杯中。

4）靜置：加入30 mL不同試驗(yàn)濃度的NaCl溶液，將勻漿液置于4℃的環(huán)境下，不同試驗(yàn)時(shí)間后用紗布對(duì)其進(jìn)行初濾，濾液3 000 r/min離心5 min，所得上清液為河蜆鹽溶蛋白，上清液冷凍干燥后，用作功能特性的研究。

1.3.2 鹽溶蛋白得率的測(cè)定

鹽溶蛋白含量的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用雙縮脲法進(jìn)行。鹽溶蛋白得率計(jì)算公式如下。

1.3.3 河蜆鹽溶蛋白提取工藝的優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

分別在不同 NaCl濃度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L）、不同固液比[1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g/mL）]、不同浸提時(shí)間（5、10、15、20、25 h）、不同浸提 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的條件下提取鹽溶蛋白，測(cè)定各單因素試驗(yàn)的鹽溶蛋白得率。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

利用SPSS 26.0軟件設(shè)計(jì)L9（3）4正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 河蜆鹽溶蛋白功能特性的研究方法

1.3.4.1 持水性的測(cè)定

稱取0.3 g凍干樣品（m）放入15 mL離心管中，離心管和樣品的質(zhì)量記為m1，向離心管中加入4 mL蒸餾水，混勻。將樣品管分別于不同溫度（20、30、40、50、60℃）水浴鍋中保溫30 min，平衡至室溫后2 000 r/min離心25 min，離心管和沉淀物的質(zhì)量記為m2。持水性按公式（1）計(jì)算。

1.3.4.2 持油性的測(cè)定

稱量0.3g凍干樣品（m）至具刻度離心管，加入4 mL植物調(diào)和油，充分混勻。將水浴鍋設(shè)置為不同試驗(yàn)溫度（20、30、40、50、60℃），樣品管分別靜置保溫 30 min，冷卻后于2 000 r/min離心20 min。讀取游離油的體積（V）用于計(jì)算持油性[18]。持油性按公式（2）計(jì)算。

1.3.4.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

將上述測(cè)定起泡性后的樣品，靜置于室溫環(huán)境30 min，及時(shí)記錄泡沫體積（V30）用于計(jì)算其穩(wěn)定性。泡沫穩(wěn)定性按公式（4）計(jì)算。

1.3.4.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

分別取20 mL不同濃度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）的鹽溶蛋白溶液于50 mL燒杯中，勻漿30 s，調(diào)節(jié)pH值。再加入20 mL大豆油，在10 000 r/min的速度下勻漿1 min后，置于樣品管，1 500 r/min離心10 min，記錄此時(shí)乳化層體積（V1）和離心管中總液體體積（V2）。乳化性按公式（5）計(jì)算。

將以上樣品置于80℃水浴鍋中30 min，取出冷卻后離心，記錄此時(shí)的乳化層體積（V3），計(jì)算其穩(wěn)定性，乳化穩(wěn)定性按公式（6）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為采用雙縮脲法所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.097 9x+0.005 1，其R2=0.999 9，擬合度高，可用于后續(xù)試驗(yàn)中鹽溶蛋白濃度的測(cè)定。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

2.2 鹽溶蛋白提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 鹽濃度對(duì)鹽溶蛋白得率的影響

鹽濃度對(duì)鹽溶蛋白得率的影響見(jiàn)圖2。

新常態(tài)的背景下，電商沖擊下的連鎖零售企業(yè)在管理模式上也需要不斷地與時(shí)俱進(jìn)，創(chuàng)新體制。接著在現(xiàn)代化信息技術(shù)的作用下，實(shí)現(xiàn)各個(gè)環(huán)節(jié)的經(jīng)營(yíng)管理模式，展現(xiàn)無(wú)縫接的體感模式。例如：電商沖擊下的連鎖零售企業(yè)在支付模式上可以進(jìn)行創(chuàng)新，并在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)支付寶支付、微信支付等主要內(nèi)容。這樣不僅滿足了消費(fèi)者的心理狀態(tài)，同時(shí)也可以利用微信，構(gòu)建屬于自身微信公眾號(hào)，推進(jìn)商品的品牌性構(gòu)建，提高忠誠(chéng)度。

圖2 鹽濃度對(duì)鹽溶蛋白得率的影響Fig.2 Effect of salt concentration on salt-soluble protein yield

從圖2可知，NaCl濃度低于0.5 mol/L時(shí)，鹽溶蛋白得率與NaCl濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，0.5 mol/L時(shí)得率達(dá)到最高值（6.21%），鹽濃度繼續(xù)增加時(shí)，鹽溶蛋白得率下降?？梢?jiàn)，NaCl濃度0.5 mol/L時(shí)鹽溶蛋白已基本溶出，鹽濃度過(guò)高會(huì)使得蛋白發(fā)生鹽析變性，反而降低得率，與李強(qiáng)等[19]的研究情況一致。后續(xù)采用NaCl濃度0.5 mol/L進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.2 固液比對(duì)鹽溶蛋白得率的影響

固液比對(duì)鹽溶蛋白得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 固液比對(duì)鹽溶蛋白得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on salt-soluble protein yield

由圖 3 可以看出，固液比在 1∶2（g/mL）～1∶5（g/mL）時(shí)，提高溶劑的用量，可使鹽溶蛋白得率不斷增加，達(dá)到1∶5（g/mL）之后，鹽溶蛋白的提取率不再增加。說(shuō)明固液比為1∶5（g/mL）時(shí)鹽溶蛋白已充分溶出，故采用固液比 1∶5（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)鹽溶蛋白得率的影響

浸提時(shí)間對(duì)鹽溶蛋白得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)鹽溶蛋白得率的影響Fig.4 Effect of leaching time on salt-soluble protein yield

由圖4可以看出，通過(guò)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，可使鹽溶蛋白的溶出更加充分。浸提20 h時(shí)，提取率可達(dá)7.15%，進(jìn)一步提高浸提時(shí)間，蛋白得率不再繼續(xù)增加?？紤]到提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能造成蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性增加，而蛋白分子一定程度的變性、沉淀會(huì)降低鹽溶蛋白得率，后續(xù)采用浸提20 h進(jìn)行試驗(yàn)。本研究結(jié)果與宋宏新等[20]的研究結(jié)果類似。

2.2.4 pH值對(duì)鹽溶蛋白得率的影響

pH值對(duì)鹽溶蛋白得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 pH值對(duì)鹽溶蛋白得率的影響Fig.5 Effect of pH value on salt-soluble protein yield

由圖5可以看出，pH值在7.0時(shí)，鹽溶蛋白得率較高。pH值在5.0時(shí)，因?yàn)榻咏油樀鞍椎牡入婞c(diǎn)，蛋白顆粒碰撞概率增大，沉淀增多，造成鹽溶蛋白提取量減少。升高pH值偏離等電點(diǎn)后，蛋白表面凈電荷增加，電荷排斥作用使得蛋白間結(jié)構(gòu)較松散，與水分子的作用增強(qiáng)，增加了蛋白溶解性，提高了蛋白得率[21]。后續(xù)采用pH7.0進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 鹽溶蛋白提取正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

鹽溶蛋白提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由表2可以看出，河蜆鹽溶蛋白提取的最佳工藝組合：提取液 NaCl濃度為 0.5 mol/L、固液比 1∶6（g/mL）、浸提時(shí)間25 h、pH8.0，對(duì)應(yīng)正交試驗(yàn)組合為A1B3C3D3。根據(jù)極差R分析，浸提時(shí)間對(duì)NaCl溶蛋白提取影響最大，其次為固液比、pH值和NaCl濃度。最佳工藝參數(shù)組合正好列在正交試驗(yàn)組3，此時(shí)河蜆鹽溶蛋白得率達(dá)到最大值（13.7%），優(yōu)于河蚌[17]、鱈魚(yú)[22]、白鰱[14]中鹽溶蛋白的得率。

2.4 河蜆鹽溶蛋白的加工特性

2.4.1 持水性和持油性

蛋白質(zhì)持水性和持油性是各類食品加工的重要性能指標(biāo)。蛋白質(zhì)持水性佳可以結(jié)合極性較強(qiáng)的風(fēng)味物質(zhì)，持油性則影響著加工過(guò)程中產(chǎn)品對(duì)油脂成分的吸收和保持，均有利于產(chǎn)品風(fēng)味的改善和提升[17]。溫度對(duì)蛋白質(zhì)持水性和持油性的影響見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 溫度對(duì)蛋白質(zhì)持水性的影響Fig.6 Effect of temperature on protein water holding capacity

圖7 溫度對(duì)蛋白質(zhì)持油性的影響Fig.7 Effect of temperature on protein oil holding capacity

由圖6可以看出，溫度在20℃～40℃時(shí)，河蜆鹽溶蛋白的持水性較穩(wěn)定，30℃時(shí)其持水性可達(dá)2.41 g/g，40℃之后隨溫度升高持水性開(kāi)始減弱。可能是因溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)-水合作用減弱，導(dǎo)致其持水性下降[23]。與大豆分離蛋白相比，20、30℃時(shí)河蜆鹽溶蛋白的持水性更低，當(dāng)溫度高于40℃之后，鹽溶蛋白持水性更高。

從圖7可以看出，河蜆鹽溶蛋白的持油性比大豆分離蛋白更優(yōu)，20℃時(shí)其持油性達(dá)到最大值（3.16 mL/g）?？赡苁且蚱浜休^多的親脂基團(tuán)，與油脂的結(jié)合力較強(qiáng)。河蜆鹽溶蛋白與大豆分離蛋白的持油性均隨著溫度的升高而降低，可能是因?yàn)闇囟壬?，油的黏度減弱，更易流動(dòng)，造成持油性下降[23]。河蜆鹽溶蛋白持油性較好，高溫時(shí)仍能保持穩(wěn)定的持油性，十分有利于肉糜制品等食品的加工。

2.4.2 起泡能力及泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)起泡能力及泡沫穩(wěn)定性影響到加工過(guò)程中起泡或泡沫的形成及保持能力，起泡性能好可以促進(jìn)食品結(jié)構(gòu)松散，改善適口性。河蜆鹽溶蛋白和大豆分離蛋白的起泡性能如圖8和圖9所示。

圖8 蛋白質(zhì)濃度對(duì)起泡性的影響Fig.8 Effect of protein concentration on protein foaming

圖9 蛋白質(zhì)濃度對(duì)泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of protein concentration on protein foam stability

由圖8可知，與大豆分離蛋白類似，河蜆鹽溶蛋白的起泡性與蛋白質(zhì)濃度整體呈正相關(guān)，起泡性最大值為67.8%。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)濃度增加時(shí)，泡沫界面的親水和疏水基團(tuán)數(shù)量增多，利于氣泡的產(chǎn)生，從而增加其起泡性[24]。

由圖9可知，蛋白質(zhì)濃度在0.4%～1.0%時(shí)，河蜆鹽溶蛋白的泡沫穩(wěn)定性不斷減弱，泡沫穩(wěn)定性最大值為65.7%。河蜆鹽溶蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均弱于大豆分離蛋白。

2.4.3 乳化能力及乳化穩(wěn)定性

由于蛋白質(zhì)富含親水和親油基團(tuán)，能夠在微小油滴周圍形成油水界面，阻止油滴的聚集，促使油相和水相的乳化。河蜆鹽溶蛋白的乳化性能見(jiàn)圖10和圖11。

圖10 蛋白質(zhì)濃度對(duì)乳化性的影響Fig.10 Effect of protein concentration on emulsification

圖11 蛋白質(zhì)濃度對(duì)乳化穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of protein concentration on emulsification stability

由圖10可知，隨著蛋白濃度增加，河蜆鹽溶蛋白乳化性呈上升趨勢(shì)，乳化性最大為56.8%。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)濃度增加使得油水界面吸附的蛋白質(zhì)增多，界面膜厚度增加，從而改善乳化能力。由圖11可知，蛋白質(zhì)濃度為0.6%時(shí)，乳化穩(wěn)定性可達(dá)94.5%。蛋白質(zhì)濃度繼續(xù)增加，乳化穩(wěn)定性有所下降，可能是因?yàn)榻缑嫖降牡鞍踪|(zhì)濃度達(dá)到一定量時(shí)，油水界面之間的蛋白質(zhì)分子相互作用增加，促使油滴聚集，降低了體系的乳化穩(wěn)定性[25]。河蜆鹽溶蛋白的乳化性能總體與大豆分離蛋白相當(dāng)。

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了河蜆鹽溶蛋白的提取工藝，在NaCl濃度為 0.5 mol/L、pH8.0、固液比 1∶6（g/mL）時(shí)浸提25 h蛋白得率最高，可達(dá)到13.7%。對(duì)河蜆鹽溶蛋白的加工特性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其持水性最高為2.41 g/g，且在40℃～60℃時(shí)高于大豆分離蛋白；持油性可達(dá)3.16 mL/g，優(yōu)于大豆分離蛋白。起泡能力和起泡穩(wěn)定性分別可達(dá)67.8%和65.7%，低于大豆分離蛋白。乳化能力和乳化穩(wěn)定性最大值分別為56.8%和94.5%，總體與大豆分離蛋白相當(dāng)?？梢?jiàn)，河蜆鹽溶蛋白具有較好的加工特性，是良好的功能性蛋白資源。