稀土元素鐿和釹對大型溞的毒性效應研究

鄧麗思，舒軍輝，王灶生,*

1.江西理工大學江西礦治環(huán)境污染與控制重點實驗室，贛州 341000

2.江西理工大學資源與環(huán)境工程學院，贛州 341000

稀土元素一共有17個，也稱為稀土金屬，是鑭系元素系稀土類元素群的總稱。由于外觀酷似“土壤”，且含此元素的礦物很少，故名為稀土。根據原子序數的大小將稀土分為“輕稀土元素”和“重稀土元素”，“輕稀土元素”大多分布在北方；而在南方，特別是被稱為“稀土王國”的江西贛州，擁有大量的中重稀土資源。稀土元素是寶貴的戰(zhàn)略資源，因而多應用在軍事與科技方面，是工業(yè)的“維生素”，是高新技術產業(yè)的工業(yè)原料，更是新興產業(yè)中不可缺少的部分[1]。

鐿是重稀土元素，性質與釔相似，大多運用于光纖通訊和激光等高新技術。隨著“信息高速公路”的建設發(fā)展，鐿在光纖材料上得到了快速的發(fā)展。利用鐿的光譜特性可以制作優(yōu)質的激光材料，如激光玻璃、激光武器和光纖激光器等[2-3]。而這些激光材料酸洗過程的廢水排放將帶來污染問題。杜正清等[4]研究了高氯酸鐿對大鼠背根神經元細胞毒性及對膜上鉀通道的影響，并對比了鑭、釓和鐿3種稀土離子誘導背根神經元的凋亡程度，實驗結果表明鐿離子有一定的神經毒性且毒性比鑭、釓都要強；徐婷[5]通過研究紫背浮萍對稀土元素鐿的脅迫應答機制，發(fā)現隨著鐿的處理濃度的逐漸增大，紫背浮萍的葉片色素含量逐漸下降，并出現褪色現象，此外還影響對其他礦質營養(yǎng)元素的吸收；聶毓秀等[6]的研究表明5 mm的鐿離子對體外培養(yǎng)的細胞具有很大的毒性效應，而鐿所形成的不同配合物對人二倍體細胞不但沒有毒性作用，還可以破壞癌細胞，使癌細胞死亡。據報道，在高濃度的稀土元素下，蠶豆根尖生長會受到明顯抑制作用，根尖顏色變黃、發(fā)黑，根尖組織變硬；會改變細胞的結構與功能，具有一定毒性效應；還會破壞葉綠體結構而影響光合作用等等[7-11]。但目前國內研究金屬鐿離子對水生生物大型溞的毒性效應較少。

稀土釹元素為過渡稀土金屬，為銀白色，有順磁性，化學性質較活潑，化合價主要為正三價，廣泛分布在土壤中，在植物體內中不同器官和生長部位含量不一。我國釹正處于迅速發(fā)展時期，特別是在一些高端產業(yè)當中，憑借獨特的理化性質，多應用于永磁材料、合金制備以及高端技術產業(yè)中[12-13]；在20世紀60年代人們發(fā)現某些稀土元素具有抗菌、抗癌和消炎的作用，并得到釹的抗菌與消炎功效相比其他稀土元素更強，使釹在臨床診斷和醫(yī)療價值方面有了廣泛的應用[14]。釹元素的廣泛應用可能會進入周圍水體環(huán)境，進而對水生生物影響的研究需求也愈加迫切。胡勤海等[15]采用722型分光光度計，在波長為692 nm處通過測OD值來反映小球藻的生長狀況，實驗結果表明在初期稀土元素有促進小球藻生長的作用，但到后期則為抑制作用，甚至出現小球藻停止生長繁殖的現象。此外他還發(fā)現單一稀土元素釹的毒性比混合稀土元素對水藻的毒性作用要更強[16]。屈艾和高寬場[17]采用細胞有絲分裂指數和微核測試技術，用硝酸釹溶液處理玉米根尖，研究對玉米的遺傳及細胞毒性，結果表明硝酸釹在不大于8 mg·L-1的濃度下對玉米根尖有促進生長的作用，而在高濃度下，>16 mg·L-1時，具有抑制的作用，稱之為“低促高抑”效應，同時對遺傳的影響也具有同樣的特點。Xing等[18]以釹為脅迫因子，對渦蟲進行研究，結果顯示隨著釹濃度的增高，渦蟲體內中的釹積累量變大，同時礦質營養(yǎng)代謝出現失衡現象，渦蟲的解體死亡數量變多。

世界約含440多種溞類，而我國含有130多種，分布在各地淡水水體。溞類以最初生產者藻類為食，也可食水中的碎屑和細菌，而它本身又被魚類捕食，故在食物鏈中起著重要的作用，同時也影響著水體的凈化。實驗中的大型溞體長2～6 mm，體呈寬卵形，發(fā)達的第二觸角是它的主要游泳器官，具有繁殖周期短、繁殖數量多、對水體中的毒性物質敏感、容易獲得和培養(yǎng)等特點，故在國內外常常用作測試生物。

本次實驗主要以釹和鐿對水域中的大型溞的危害作用為例，鑒于大型溞在水生食物鏈中擔任重要的角色，一旦溞類受到危害不僅僅會影響其種群的數量，而且會在體內積聚，隨著食物鏈，危害水中的其他水生生物，最終危害人體健康，以致影響人類生存發(fā)展和自然生態(tài)環(huán)境，故通過研究稀土元素對大型溞的毒性效應，找到危害大型溞的濃度范圍，計算出半數致死率，并分別考察有關稀土元素暴露液對大型溞的急性和慢性毒性，從而綜合評價釹和鐿對大型溞的毒性生態(tài)效應，為開展這2種元素的生態(tài)風險評價提供可靠數據，為減少稀土礦開采過程中所造成的環(huán)境危害的評估提供思路，以及為確定流域稀土的生態(tài)效應與環(huán)境治理提供科學基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗生物

大型溞(Daphniasp.)購于中國科學院水生生物研究所，在實驗中采用的是經過2 d以上曝氣的自來水，并放于溫度為(20±2) ℃、光照強度為1 200 lx、14 h光/10 h暗的1 000 mL的燒杯中培養(yǎng)。實驗中采用由中國科學院城市環(huán)境研究所提供的小球藻進行飼喂，小球藻使用BG11培養(yǎng)液放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間的小球藻再放入離心機離心后，倒去上清液，濃縮后的小球藻放置4 ℃的冰箱中保存，可對大型溞進行飼喂，食物量保持在0.1～0.2 mg·溞-1·d-1(以碳計)，此外，每天要定時清理大型溞退去的殼，2 d換一次培養(yǎng)液。

1.2 暴露液與試劑

本實驗的暴露培養(yǎng)液采用改良重組水，為防止標準重組水中的碳酸根離子與鈣離子產生沉淀，而將碳酸氫鈉換成氯化鈉，改良后的重組水成分為氯化鈣0.294 g·L-1，硫酸鎂0.123 g·L-1，氯化鈉0.065 g·L-1和氯化鉀0.00575 g·L-1。

五水硝酸鐿(Yb(NO3)3·5H2O)為分析純，純度為99.99%，六水硝酸釹(Nd(NO3)3·6H2O)為分析純，均購買于上海麥克林試劑。試驗液由儲備液稀釋而成。稱量2.6 g的硝酸鐿，去離子水溶解后，定容到1 L，即可得到1 g·L-1的鐿儲備液；稱量3.0 g的硝酸釹，采用同樣的方法可得到1 g·L-1的釹儲備液。稀釋到各個濃度對大型溞進行暴露實驗，另外用ICP法測定試驗液中鐿和釹的實際濃度。

1.3 實驗方法

1.3.1 預實驗

依據文獻，設置預實驗濃度范圍為1、5、10、50和100 mg·L-1，不設置平行組，分別記錄其24 h和48 h的死亡個數。依據預實驗結果確定正式試驗濃度范圍。

1.3.2 稀土鐿和釹元素的急性毒性

參考經濟合作與發(fā)展組織(OECD)大型溞急性抑制測試方法，采用約繁殖3代后已經穩(wěn)定的新生幼溞，將鐿的濃度范圍設為1、4.4、9、20、40和80 mg·L-1，1個空白對照組；釹的濃度設為5、13.24、21.92、36.26、50和60 mg·L-1和1個對照組。每個濃度均有3組平行，選擇10只剛出生形態(tài)相似的健康大型溞放置于含100 mL暴露液體的燒杯中，將其放入光照培養(yǎng)箱中，不對大型溞投喂，分別記錄大型溞24 h和48 h的死亡個數及任何異常癥狀。

1.3.3 稀土釹元素的慢性毒性

參考OECD大型溞21 d慢性抑制測試實驗方法，暴露液為改良重組水配制，在最低濃度的1/10與1/50之間按等對數間距設置慢性毒性的濃度，以確保大型溞在21 d內能夠正常生長，實驗中的濃度分別為0.12、0.15、0.22、0.3和0.47 mg·L-1，設置1個對照組，每個濃度設置9個平行組，將新生健康的一只大型溞放置于含50 mL暴露液的燒杯中單獨培養(yǎng)，每2 d換水和投喂適量的小球藻。小球藻需用4 000 r·min-1的離心機離心15 min，離心后倒掉上清液，并加入去離子水多次清洗。每天對大型溞進行觀察，并記錄每個大型溞的生長狀況以及大型溞生殖的幼溞個數和生殖的時間，而且在實驗過程中要將每一次生殖的幼溞與母溞隔開，直到大型溞繁殖第3代或者21 d，分別記錄F1、F2、F3和F4的數量和各濃度組繁殖一代所需要的時間，并分析顯著差異的濃度，計算內稟增長率。

1.3.4 統(tǒng)計分析

采用概率單位統(tǒng)計法求出24 h和48 h的半數致死濃度，并計算95%的置信區(qū)間；慢性實驗數據處理采用單因素方差分析和多重比較(Dunnett’s檢驗)來計算各個試驗濃度組與對照組之間是否存在顯著差異(P=0.05)，再利用非參數檢驗方法(根據Holm趨勢檢驗得到的Bonferroni-U檢驗)來確定無觀察效應濃度(NOEC)和最低可觀察效應濃度(LOEC)，并計算95%的置信區(qū)間。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 鐿對大型溞的急性毒性

隨著溶液中鐿濃度的增加，大型溞的活動越來越受到抑制，最終縮成一團白色下沉在容器底部，直到死亡。如圖1和表1所示，鐿對大型溞24 h-LC50為24.57 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為12.64～66.01 mg·L-1；如圖2和表1所示，48 h-LC50為7.91 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為6.73～10.39 mg·L-1。

圖1 鐿暴露24 h時鐿的對數濃度與大型溞死亡率之間的關系Fig. 1 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in ytterbium exposure for 24 h

圖2 鐿暴露48 h時鐿的對數濃度與大型溞死亡率之間的關系Fig. 2 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in ytterbium exposure for 48 h

表1 稀土元素鐿對大型溞急性數據Table 1 Acute toxicity of rare earth element ytterbium to Daphnia magna

2.2 釹對大型溞的急性毒性

如圖3和表2所示，釹對大型溞的24 h-LC50為37.72 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為30.49～58.57 mg·L-1；如圖4和表2所示，48 h-LC50為12.98 mg·L-1，其95%的置信區(qū)間為10.56～15.84 mg·L-1。

圖3 釹暴露24 h時釹的對數濃度與大型溞死亡率之間的關系Fig. 3 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in neodymium exposure for 24 h

圖4 釹暴露48 h時釹的對數濃度與大型溞死亡率之間的關系Fig. 4 The relationship between logarithmic concentration and mortality of Daphnia magna in neodymium exposure for 48 h

表2 稀土元素釹對大型溞急性毒性數據Table 2 Acute toxicity of rare earth element neodymium to Daphnia magna

2.3 釹對大型溞的慢性毒性

2.3.1 釹暴露液對大型溞存活個數的影響

統(tǒng)計繁殖3代的數據可知，對照組的大型溞在14 d內無死亡現象，在21 d后，只有3只死亡，其他均保持正常生長。而在含釹暴露液中的大型溞在不同程度上受到影響，特別是后期出現了大量的死亡現象。0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組第20天時均只剩1只大型溞，其余均死亡，如圖5所示。這與急性毒性實驗中的48 h-LC50為13.96 mg·L-1的結果有差異，這在已有的一些研究結果中亦有發(fā)現。Ellesat等[19]用鹽酸苯海拉明和硫氰酸紅霉素2種藥物對大型溞進行毒性研究，發(fā)現類似現象，當暴露液的濃度為62 μg·L-1時，大型溞可在15 d左右死亡。

圖5 大型溞在釹暴露液中21 d的死亡個數注：0組為對照組，1、2、3、4和5組中釹的濃度分別為0.12、0.15、0.22、0.3和0.47 mg·L-1；下同。Fig.5 Number of deaths of Daphnia magna after neodymium exposure for 21 dNote:Group 0 was the control group,and the concentrations of neodymium in group 1,2,3,4 and 5 were 0.12,0.15,0.22,0.3 and 0.47 mg·L-1;similarly hereinafter.

2.3.2 釹暴露液對大型溞首次蛻殼時間的影響

對于大型溞首次蛻殼時間的影響如圖6所示，大多數大型溞的首次蛻殼時間集中在第2天，但0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組大型溞蛻殼時間略有延長。

圖6 釹暴露對大型溞的首次蛻殼時間的影響Fig. 6 Effect of neodymium exposure on first molting time of Daphnia magna

2.3.3 釹暴露液對大型溞首次產溞時間的影響

對照組首次產溞時間為8 d左右，而處于不同濃度暴露液中的大型溞首次產溞時間均有延長，0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組與對照組相比具有顯著差異，如圖7所示。

圖7 釹暴露對大型溞的首次產溞時間的影響注：*表示P<0.05。Fig.7 Effect of neodymium exposure on first birth time of Daphnia magna Note:*indicates P<0.05.

2.3.4 釹暴露液對大型溞每代平均產溞數量的影響

對單個大型溞的每次產幼溞的數量進行統(tǒng)計，由圖8可知，隨著暴露液中釹濃度的增加，母代所產小溞數量明顯下降，并且高濃度釹暴露組母代生殖胎數減少，出生的幼溞死亡率較高。

圖8 釹暴露對大型溞21 d的每窩平均凈生殖數量注：不同字母表示不同處理在同代間的差異顯著(P<0.05)。Fig.8 Average net reproductive number per brood of Daphnia magna after neodymium exposure for 21 dNote:Different letters indicate significant differences between different treatments in the same generation.

在0.47 mg·L-1釹暴露濃度下，大型溞的首次產溞時間、產溞個數和21 d的產溞胎數均與對照組有顯著差異。

2.3.5 釹暴露液對大型溞產溞胎數的影響

觀察大型溞的繁殖胎數，發(fā)現對照組一般可在21 d繁殖4～5代，而0.3 mg·L-1和0.47 mg·L-1濃度組出現顯著差異(P<0.01)，只能繁殖1～2代，母代便會死亡，如圖9所示。

圖9 釹暴露對大型溞繁殖胎數的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig.9 Effect of neodymium exposure on the reproductive cycle of Daphnia magnaNote:*indicates P<0.05,and **indicates P<0.01.

2.3.6 釹暴露液對大型溞體型的影響

對照組中的大型溞帶有深灰色，活動能力極強，體型很大且能在水中前后翻滾；在釹濃度較高的暴露液中，大型溞個頭較小，體色多為白色，產溞個數少，活動能力較差，后期實驗中有不少大型溞陸續(xù)死亡。

2.3.7 釹暴露液中大型溞內稟增長率的計算

計算了慢性實驗中大型溞的內稟增長率，內稟增長率是一種生態(tài)指標，不僅可以反映某個種群在環(huán)境中的生長趨勢，還可反映該種群的繁殖能力，其計算公式如下。

R0=∑Lxmx

(1)

T0=∑XLxmx/∑Lxmx

(2)

r=ln(R0/T0)

(3)

式中∶Lx為存活率，mx為大型溞每次產幼溞數，T0為世代周期(d)，X為時間(d)，R0為大型溞的凈生殖率，r為內稟增長率。

由圖10可知，隨著含釹暴露液中的釹濃度增加，大型溞的內稟增長率逐漸下降，并當暴露液中釹的濃度≥0.22 mg·L-1時，內稟增長率與對照組出現了顯著差異(P<0.01)，特別是在0.47 mg·L-1釹濃度下，內稟增長率僅為0.17，可見暴露液對大型溞的生長繁殖影響極大。

3 討論(Discussion)

胡泗才[20]報道硝酸稀土對大型溞的24 h和48 h-LC50為38.67 mg·L-1和32.09 mg·L-1，慢性實驗中并未發(fā)現對大型溞的生存率和生命壽限有明顯的影響。而本研究發(fā)現，重稀土元素鐿的急性毒性比輕稀土元素釹強。釹的24 h-LC50為37.72 mg·L-1，48 h-LC50為12.98 mg·L-1，與Blinova等[21]報道的釹對大型溞的48 h-LC50為(20.8±3.8) mg·L-1的結果相差不大。鐿對大型溞的24 h-LC50為24.57 mg·L-1，48 h-LC50為7.91 mg·L-1。目前，有關鐿對大型溞毒性試驗鮮有報道。從慢性毒性角度分析，稀土元素對大型溞的各項繁殖指標均有影響，如每代繁殖幼溞個數減少、蛻皮次數減少、個體變小甚至畸變、繁殖時間變長和高濃度組母胎死亡等[22-25]，且表現出劑量-效應關系[24]。綜合分析得到釹元素對大型溞21 d-LOEC為0.3 mg·L-1，21 d-NOEC為0.12 mg·L-1，95%的置信區(qū)間為0.08～0.14 mg·L-1。此外，隨著時間延長，這種稀土毒性會影響后代，甚至可能隨著食物鏈傳播，危害人體健康和水生生態(tài)系統(tǒng)，所以要關注各類含稀土元素的廢水對水生生物在不同層次上的毒理效應。

實驗未對F1等后代進行試驗和觀察，稀土元素的毒性是否會通過繁殖影響后代且其影響表現形式如何，這都值得進一步探討；此外實驗未對釹和鐿元素的溶解度進行深入研究。王靖坤[26]指出，稀土元素的溶解度一般與pH、溫度、配體類型及離子濃度等有關，鑭系元素中的硝酸鹽、磷酸鹽和氯化物等可溶解，而一些碳酸鹽和氫氧化物不可溶。在實驗中，含高濃度稀土元素的暴露液中，確實發(fā)現少許沉淀，實驗中的釹和鐿是否也會在一定條件下發(fā)生水解，進而生成一些水解產物或進一步與水中的小球藻發(fā)生微量絮凝現象，這些是否會影響大型溞的生存值得討論，因此對于不同稀土元素在試驗液中的存在形式，以及對大型溞致毒的形式都值得進一步探究。例如，Das等[27]在研究中發(fā)現，在phosphorous-free培養(yǎng)基中La大部分以無機配合物形式存在，卻觀察到毒性作用，研究表明，少部分的La3+，在有磷的條件下，會形成LaPO4，造成小球藻的沉淀現象，從而間接影響大型溞的正常生活狀況，而這種現象是否同樣對其他稀土元素適用，進而造成實驗誤差，值得思考。不同稀土元素的離子半徑不同，相應的，到鈣結合位點的時間不同[28]，研究表明，鑭系元素在一定的溫度下可以提高鈣調蛋白的生物活性，改變細胞膜表面的鈣離子通道[29-31]。相應的稀土元素一旦進入細胞，鈣離子的濃度隨之提高，導致鈣離子在體內的代謝發(fā)生絮亂，進而使生物死亡[32]。據報道，稀土元素在高濃度時具有金屬離子的特性，與Ca2+形成競爭，帶來抑制作用[33]，還會取代Ca2+而與CaM結合，結合位點可達10個，其中CaM是生物體內一種多功能鈣結合蛋白，參與體內的眾多生理生化反應，對細胞的增殖、運動、轉化和死亡都有重要的作用，而過高濃度的稀土元素對CaM的活性具有抑制效果[34-38]。因此稀土元素所帶來的環(huán)境風險應當引起人們的重視。