納米錳暴露對(duì)大鼠神經(jīng)毒性及脈絡(luò)叢相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

許明顏，孟睿，郝卓璐,2，馬心怡，吳靜雯，崔夢(mèng)祥，孟春燕,*，韓鐵生,#

1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，唐山 063210

2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166

納米二氧化錳(nano-MnO2)不僅具有良好的電化學(xué)性能和氧化還原性，還擁有納米級(jí)結(jié)構(gòu)，其作為藥物載體的應(yīng)用更是被人們廣泛關(guān)注[1]。實(shí)際生活中鋼鑄件和干電池行業(yè)是工人接觸nano-MnO2的兩大行業(yè)[2]，此外焊接煙霧通常含有錳金屬和氧化錳顆粒，焊工暴露風(fēng)險(xiǎn)較高[3]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，人們與納米物質(zhì)接觸的機(jī)會(huì)增多，接觸環(huán)境中的納米材料可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性效應(yīng)。納米材料體積小、表面積大，可通過(guò)不同的途徑進(jìn)入人體，跨越生物膜進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)相應(yīng)的器官和組織產(chǎn)生靶效應(yīng)。潘洋和張?chǎng)卧囱芯堪l(fā)現(xiàn)，納米顆?？蛇M(jìn)入大腦產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用[4]。

脈絡(luò)叢是構(gòu)成血腦脊液屏障的組織基礎(chǔ)，不僅能分泌腦脊液，還可將血液中過(guò)量的有毒物質(zhì)蓄積在組織內(nèi)，從而保護(hù)大腦[5]。但脈絡(luò)叢的蓄積能力有一定限度，當(dāng)進(jìn)入機(jī)體的有毒物質(zhì)蓄積過(guò)量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致脈絡(luò)叢的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而破壞血腦脊液的屏障功能[6]。為探討nano-MnO2對(duì)脈絡(luò)叢的損傷機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立nano-MnO2暴露動(dòng)物模型，觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化，檢測(cè)大鼠神經(jīng)損傷及脈絡(luò)叢損傷情況，研究暴露前后大鼠脈絡(luò)叢相關(guān)基因表達(dá)的變化，為nano-MnO2的安全評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18只雄性SD大鼠(無(wú)特定病原體級(jí))，體質(zhì)量為180～220 g，訂購(gòu)并飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

nano-MnO2，純度高達(dá)99.9%，平均粒徑50 nm，比表面積30 m2·g-1，暗棕色，球形，體積密度0.35 g·cm-3，購(gòu)自北京德科島金科技有限公司(圖1)。使用時(shí)配制nano-MnO2懸濁液，前期用無(wú)菌生理鹽水配制成80 mg·mL-1的濃度，后期隨著大鼠體質(zhì)量增加，配制100 mg·mL-1濃度。使用時(shí)超聲混勻，按具體體質(zhì)量確定灌注體積。4%多聚甲醛溶液和10%水合氯醛均購(gòu)自索萊寶公司。YLS-6B智能熱板儀購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，BX41-32H02光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

圖1 納米二氧化錳(nano-MnO2)SEM圖Fig. 1 The SEM photographs of manganese dioxide nanomaterial (nano-MnO2)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染毒方法

SD大鼠共18只，隨機(jī)分成3組，構(gòu)成對(duì)照組、低劑量染毒組和高劑量染毒組。實(shí)驗(yàn)采用無(wú)創(chuàng)傷氣管內(nèi)注入法進(jìn)行染毒。異氟烷麻醉大鼠后，提上顎，使大鼠身體僵直，輕輕夾出鼠舌固定，在大鼠口腔中放入窺耳鏡，暴露聲門(mén)，插入鈍頭灌注器進(jìn)行注入。低劑量組染毒劑量為200 mg·kg-1(以體質(zhì)量計(jì))，高劑量組為400 mg·kg-1，對(duì)照組每只灌注等量生理鹽水。每周染毒1次，連續(xù)染毒12周。

1.2.2 神經(jīng)行為檢測(cè)

染毒結(jié)束分別將各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為測(cè)試，即大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和熱板儀實(shí)驗(yàn)。將具有25個(gè)箱底方格的無(wú)頂木箱(100 cm×100 cm×30 cm)作為曠場(chǎng)，將大鼠置于中央方格內(nèi)，觀察并記錄大鼠5 min內(nèi)在中央格的停留時(shí)間、跨越方格的次數(shù)和站立次數(shù)。觀察時(shí)盡量保持周?chē)h(huán)境安靜，每只大鼠記錄結(jié)束后清理曠場(chǎng)箱底部。熱板儀預(yù)熱并恒定在55 ℃，將3組大鼠依次放于板上，每只重復(fù)3次且間隔30 min以上，觀察并記錄每次每只大鼠從進(jìn)入至第一次舔后足的時(shí)間，根據(jù)熱痛反應(yīng)時(shí)間的變化判斷大鼠的感覺(jué)神經(jīng)功能。

1.2.3 樣品的制備和形態(tài)學(xué)觀察

參考馬海陽(yáng)[7]的方法，首先選用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注，待大鼠身體開(kāi)始僵硬時(shí)將其斷頭，立即分離SD大鼠脈絡(luò)叢及各部分腦組織。用4%多聚甲醛溶液對(duì)大鼠脈絡(luò)叢組織固定，制片后HE染色觀察病理學(xué)變化；取腦組織固定于為2.5%的戊二醛中，進(jìn)行電鏡樣品制備和觀察。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組分析

根據(jù)樣品保存情況，共收集3組動(dòng)物8個(gè)樣本送檢，其中對(duì)照組2個(gè)樣本，低、高劑量組各3各樣本。采用illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，利用Fast QC軟件對(duì)預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，統(tǒng)計(jì)Q30的堿基比例。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量、高劑量染毒組大鼠與對(duì)照組相比，中央格停留時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)；與對(duì)照組相比，高劑量組的大鼠跨格次數(shù)減少(P<0.05)，低劑量組和高劑量組站立次數(shù)顯著增多(P<0.05)，其余各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。熱板儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低劑量組、高劑量組熱痛反應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng)，其中高劑量組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，染毒濃度越高，大鼠熱痛反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)(表1)。

表1 nano-MnO2暴露后大鼠神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果Table 1 Results of neurobehavioral test in rats treated with nano-MnO2

2.2 脈絡(luò)叢HE染色結(jié)果

正常大鼠的脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞排列緊密整齊，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞基底部，如圖2(a)所示。經(jīng)nano-MnO2染毒后，低劑量組大鼠部分脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)染色變淺，細(xì)胞邊緣不清晰，細(xì)胞之間界限開(kāi)始變得模糊，有空泡出現(xiàn)，如圖2(b)所示。高劑量組大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變形且空泡化現(xiàn)象明顯，多數(shù)細(xì)胞以及細(xì)胞核出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮及溶解，如圖2(c)所示。隨著染毒濃度升高，細(xì)胞輪廓模糊且變形加重，細(xì)胞連接間隙變寬，細(xì)胞內(nèi)空泡明顯增多。

圖2 脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞HE染色結(jié)果(HE染色，400×)注：(a) 對(duì)照組；(b) 低劑量組；(c) 高劑量組。Fig.2 HE staining results of choroid plexus epithelial cells (HE staining,400×)Note:(a) Control group;(b) Low-dose group;(c) High-dose group.

2.3 腦皮質(zhì)電鏡觀察結(jié)果

電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)nano-MnO2染毒后大鼠腦皮質(zhì)中線粒體形態(tài)異常，線粒體腫脹，且有大量空泡出現(xiàn)(圖3(c))；正常髓鞘結(jié)構(gòu)完整，處理組髓鞘有較大面積的染色變淺，出現(xiàn)分層，染色質(zhì)邊集(圖3(b)和3(c))。

2.4 高通量測(cè)序分析結(jié)果

取對(duì)照組、低劑量組和高劑量組共8個(gè)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序。8個(gè)cDNA文庫(kù)共產(chǎn)生8.67億個(gè)原始序列數(shù)，進(jìn)行質(zhì)量控制后(表2)，從原始讀數(shù)中獲得8.53億個(gè)過(guò)濾后序列，Q30平均堿基質(zhì)量為95.04%，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

表2 原始序列和預(yù)處理序列的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical results of original sequence and preprocessed sequence

2.4.1 差異基因篩選

如圖4(a)所示，主成分分析圖顯示一個(gè)高劑量組與其他組基因存在差異。針對(duì)樣本組間篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)，圖4(b)中顏色的深淺表示不同樣本基因的表達(dá)量高低，可以明顯看出高劑量組與其他組別相比差異性較大。為此，選取對(duì)照組和高劑量組進(jìn)行分析。

圖4 差異表達(dá)基因篩選情況注：(a) 主成分分析圖；(b) 差異基因表達(dá)聚類(lèi)。Fig.4 Screening of differentially expressed genesNote:(a) Principal component analysis diagram;(b) Differential gene expression clustering.

2.4.2 GO功能富集

對(duì)照組與高劑量組篩選到差異表達(dá)基因4 056個(gè)。差異表達(dá)的基因在生物過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能3個(gè)大功能類(lèi)均有富集，在生物過(guò)程功能類(lèi)中，差異基因主要富集到的低層級(jí)GO Term為神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程調(diào)節(jié)相關(guān)基因；分子功能中的差異基因主要富集在轉(zhuǎn)運(yùn)活性類(lèi)別中，富集到的低層級(jí)GO Term為離子門(mén)控通道活性(148，上調(diào)141)、離子通道活性(180，上調(diào)169)和金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性(165，上調(diào)147)；細(xì)胞組分中差異基因富集最多的GO功能是突觸。

分子功能類(lèi)別中，顯著表達(dá)的基因如表3所示，有關(guān)金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的鈣、鉀電壓門(mén)控通道等相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)，提示可能影響膜通道活性進(jìn)而破壞細(xì)胞。顯著表達(dá)的差異基因Slc17a7屬于溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(solute carrier,SLC)家族中的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，與突觸囊泡膜和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)[8]。

表3 分子功能類(lèi)別低層級(jí)GO Term顯著表達(dá)基因Table 3 Significant expression genes of low-level GO Term in molecular functional categories

2.4.3 KEGG Pathway富集分析

差異基因共富集到64條主要代謝通路上，其中信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)系統(tǒng)2個(gè)功能分類(lèi)富集差異基因最多。信號(hào)傳導(dǎo)途徑差異基因富集情況如表4所示。

表4 信號(hào)傳導(dǎo)途徑差異基因富集分析Table 4 Differential gene enrichment analysis of signal transduction pathway

按顯著性排名前五的Pathway如表5所示，分別是神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用、嗎啡成癮、谷氨酸能突觸、鈣信號(hào)通路和膽堿能突觸。在差異上調(diào)基因中編碼代謝型谷氨酸受體的Grm系列基因顯著表達(dá)。

表5 差異基因KEGG代謝途徑富集分析Table 5 Enrichment analysis of differential gene KEGG metabolic pathway

3 討論(Discussion)

諸多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)nano-MnO2具有細(xì)胞毒性[9-10]，然而也有研究顯示納米錳的氧化物具有一定的細(xì)胞保護(hù)作用[11]，且不同劑量顯示出的作用也不盡相同[12-14]。有研究應(yīng)用5.26 mg·kg-1(以體質(zhì)量計(jì))的nano-MnO2氣管滴注可看到大鼠神經(jīng)損傷[12]，500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1(以體質(zhì)量計(jì))經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)可觀察到大鼠多器官損傷、DNA損傷等[13]，另一項(xiàng)研究則認(rèn)為35 mg·kg-1的nano-MnO2靜脈注射對(duì)小鼠并沒(méi)有明顯毒性作用[14]。以往的研究在nano-MnO2染毒濃度和染毒方式方面存在很大差異，為觀察到明顯的毒性作用，本研究選擇的高濃度為400 mg·kg-1，低劑量為200 mg·kg-1，本研究結(jié)果顯示低劑量組對(duì)大鼠的損傷作用不如高劑量組明顯。

以往的研究顯示nano-MnO2可以穿過(guò)血腦屏障并在腦內(nèi)蓄積[12,15]，而關(guān)于納米錳進(jìn)入大腦的確切機(jī)制目前尚無(wú)定論。腹腔注射MnCl2后，錳可以穿過(guò)血腦脊液屏障，對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生影響[16]。有研究顯示納米材料可以直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并在溶酶體中聚集[17]。而錳離子可以從納米材料表面溶解，不溶性的納米粒子作為離子載體，使錳離子能夠進(jìn)入細(xì)胞[18]，細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境更促進(jìn)了溶解過(guò)程[19]。熱板儀實(shí)驗(yàn)顯示染毒后大鼠熱痛反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，表明大鼠感覺(jué)神經(jīng)功能損傷。大鼠疼痛調(diào)節(jié)功能的改變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中錳水平的變化對(duì)多巴胺能系統(tǒng)的影響有關(guān)[20]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)反映大鼠的焦慮樣行為減少，空間識(shí)別能力降低，興奮性相對(duì)減弱。同樣，大腦皮質(zhì)線粒體形態(tài)異常，髓鞘發(fā)生變化，提示錳對(duì)大鼠腦組織產(chǎn)生了損傷作用。脈絡(luò)叢可調(diào)節(jié)血液和腦脊液之間各種物質(zhì)的交換，包括重金屬、小分子物質(zhì)以及多種肽類(lèi)[21]，其參與大腦的解毒過(guò)程、神經(jīng)免疫作用，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)體液等。脈絡(luò)叢的調(diào)節(jié)功能可保護(hù)大腦免受各種潛在的毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也在維護(hù)血-腦脊液之間各種物質(zhì)生理和藥理學(xué)分布方面起重要作用。因此，脈絡(luò)叢對(duì)周?chē)惓Ｐ盘?hào)反應(yīng)靈敏，以維持其物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及各種調(diào)節(jié)功能的穩(wěn)態(tài)[22]。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，且隨著nano-MnO2濃度增加，細(xì)胞受損情況加重，出現(xiàn)細(xì)胞胞膜和核仁不清晰，胞核濃縮、溶解，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞緊密連接部分出現(xiàn)斷裂(圖2)，這與納米硫化鉛對(duì)脈絡(luò)叢的損傷作用類(lèi)似[23]，提示錳可以直接損害脈絡(luò)叢的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

王璨[24]的研究表明，錳可以使腦中的谷氨酸(Glu)代謝紊亂，Glu作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其增多會(huì)引起興奮性毒作用。徐斌[25]的研究顯示錳含量增加，Glu的含量隨之增加。本研究顯示，高劑量nano-MnO2染毒后，編碼代謝型谷氨酸受體的Grm系列基因表達(dá)顯著上調(diào)，關(guān)于Glu轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(表3)，錳很可能破壞了Glu的代謝平衡，Glu含量增多后，持續(xù)地激活Glu受體，胞漿中Ca2+濃度增高，細(xì)胞外K+增加，引起神經(jīng)元過(guò)度興奮，影響其正常功能，引起大量H2O和Na+進(jìn)入細(xì)胞使其腫脹，引起離子滲透壓改變，造成滲透性損傷[26]，這可能是脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化的原因之一。GO功能分子功能類(lèi)別中有關(guān)金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的鈣、鉀電壓門(mén)控通道等相關(guān)基因顯著表達(dá)，提示錳可能影響了脈絡(luò)叢對(duì)微量元素轉(zhuǎn)運(yùn)功能，有些金屬離子如鉛暴露可以導(dǎo)致脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞對(duì)微量元素轉(zhuǎn)運(yùn)功能的紊亂[27]。

本研究表明nano-MnO2高劑量暴露下，大鼠的神經(jīng)行為學(xué)出現(xiàn)異常改變，空間探究能力下降、感覺(jué)功能受損，提示納米錳產(chǎn)生了神經(jīng)毒性。錳可使編碼代謝型谷氨酸受體的Grm系列基因表達(dá)上調(diào)，并影響脈絡(luò)叢的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。納米錳可經(jīng)脈絡(luò)叢進(jìn)入大腦，引起脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞受損，使細(xì)胞腫脹，破壞脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的正常功能，從而使錳更容易進(jìn)入腦內(nèi)造成進(jìn)一步的損傷。