環(huán)境濃度氧化石墨烯和多環(huán)芳烴復合暴露誘發(fā)成年斑馬魚腦組織的分子響應研究

孫晶，劉玉瑋，胡獻剛，歐陽少虎,*

1.生態(tài)環(huán)境部海河流域北海海域生態(tài)環(huán)境監(jiān)督管理局生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與科學研究中心，天津 300061

2.南開大學環(huán)境科學與工程學院，環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復與污染防治重點實驗室，天津 300071

近年來，隨著氧化石墨烯(graphene oxide,GO)研究的增多和產(chǎn)品應用的增長，GO不可避免地釋放到環(huán)境尤其是水體環(huán)境中[1-2]。水中的有機污染物可能被在水環(huán)境中穩(wěn)定存在的碳納米材料吸附(如GO)后發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而誘導生物產(chǎn)生更大的毒性效應，或者水體中污染物的化學結(jié)構(gòu)因為與碳納米材料相互作用發(fā)生改變，從而使之毒性變小，即納米材料與污染物聯(lián)合毒性可能是協(xié)同的、拮抗的或是抑制的[3]。GO可以吸附多種有機污染物，如染料、抗生素、多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)和農(nóng)藥等[4-6]。其中，PAHs因其在環(huán)境中分布極為廣泛，且具有致癌、致畸和致突變等特性受到了人們的極大關(guān)注，也是重要的環(huán)境和食品污染物[7-8]。有報道指出，近年來我國主要地表水中的PAHs含量在104.78～7 596.56 ng·L-1之間[9-11]，且已有部分地區(qū)達到中等或重度污染水平。因而當GO被排放到水體環(huán)境中時，將與水體中的PAHs污染物共存，其潛在的復合暴露生態(tài)風險不容忽視。

環(huán)境中的復合污染造成的毒性評估是生態(tài)風險評價中十分重要的一環(huán)[12]。近年來針對PAHs與碳納米材料的復合污染研究時有報道。例如，剝離石墨烯和多壁碳納米管與PAHs發(fā)生相互作用后，碳納米材料的生物相容性發(fā)生了改變，且剝離石墨烯和多壁碳納米管均可以通過對PAHs的吸附來降低PAHs的生物利用度[13]；然而，也有其他研究指出納米材料與有機污染物復合后，對生物的聯(lián)合毒性效應可能表現(xiàn)為協(xié)同作用、拮抗作用或沒有相互影響[14-15]。然而，目前關(guān)于GO和PAHs對斑馬魚成魚腦組織的復合暴露毒性及其分子效應和機理尚未可知。斑馬魚是一種經(jīng)典的環(huán)境毒理學模式生物，也是研究納米材料和PAHs的水生態(tài)毒性的常用模型[16-17]。CYP1B1和β-半乳糖苷酶與斑馬魚腦組織的代謝和衰老相關(guān)，可以反映外源污染對斑馬魚的作用[18-19]，而轉(zhuǎn)錄組學是近年來斑馬魚毒理機制研究的重要手段之一[20]。因而，為考察GO與PAHs對水生生物的聯(lián)合毒性效應，選取環(huán)境預測濃度的GO與環(huán)境當量濃度PAHs同時暴露成年斑馬魚21 d，對暴露后斑馬魚腦組織的CYP1B1和β-半乳糖苷酶水平及轉(zhuǎn)錄組學響應進行研究，從表觀到基因?qū)用嫔钊虢沂綠O和PAHs對成年斑馬魚腦組織聯(lián)合暴露毒性的分子機理。本文的結(jié)果為其他碳納米材料和其他共存污染物的潛在毒理效應提供技術(shù)方法和理論參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 GO與PAHs的購置與配制

GO購于南京先豐納米科技公司(貨號XF002-1)，16種優(yōu)控PAHs購自于美國AccuStandard公司(初始濃度：2 mg·mL-1)。GO和PAHs的相關(guān)性質(zhì)和表征結(jié)果詳見本課題組之前的工作[21-22]。參考既往研究[20,23-24]，選取0.01 mg·L-1和0.1 mg·L-1為GO在環(huán)境中的預測濃度，并將其應用于斑馬魚的暴露；與此同時，參考了近年來我國主要水體PAHs的平均濃度[10-11]，同時考慮到進行低濃度亞急性毒性效應測試(21 d)，選擇了較為合適的斑馬魚成魚的PAHs暴露濃度，為5 μg·L-1。綜上，本研究將GO與5 μg·L-1PAHs復合，設定了0.01 mg·L-1GO與5 μg·L-1PAHs復合暴露組(PAHs-GO01)、0.1 mg·L-1GO與5 μg·L-1PAHs(PAHs-GO1)復合暴露組，同時為確認5 μg·L-1PAHs對斑馬魚的毒性效應，設立了5 μg·L-1PAHs暴露組(PAHs)。各實驗組設置和名稱縮寫如表1所示。將成年斑馬魚暴露于空白和污染物溶液中21 d后，收集斑馬魚腦組織進行毒性分析。

表1 毒理實驗中PAHs和GO濃度Table 1 Concentrations of PAHs and GO in toxicity test

1.2 斑馬魚飼養(yǎng)與毒性暴露

暴露生物為6～8月齡AB型野生成年斑馬魚，購自中國科學院水生生物研究所斑馬魚資源中心。開始暴露實驗前統(tǒng)一將斑馬魚飼養(yǎng)于配備循環(huán)水泵的30 L玻璃水箱中，飼養(yǎng)水為60 mg·L-1天然海鹽水，水溫為(28.0±1.0) ℃。使用商業(yè)魚飼料(中國惠州市寸金飼料有限公司)進行飼養(yǎng)，頻率為每天2次，投食量以斑馬魚1 min內(nèi)吃完為宜。光照程序為10 h黑暗+14 h光照。

開始暴露前，斑馬魚被置于人工氣候箱(SPX-300I-C，中國上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)進行環(huán)境適應，適應和暴露期間氣候箱溫度、光照程序和喂食均與未暴露時飼養(yǎng)環(huán)境一致。在2周的適應期結(jié)束后，每次實驗暴露均選取36條健康且體型相近的成年斑馬魚并將其隨機地分成6組，每組包含6條斑馬魚，分別按照表1中組別的設置將其分為對照組、GO01組、GO1組、PAHs組、PAHs-GO01組和PAHs-GO1組。對照組和暴露組的斑馬魚均分別置于相應1 L燒杯中進行為期21 d的暴露，斑馬魚暴露液每隔一天更換一次，暴露環(huán)境與斑馬魚飼養(yǎng)和適應條件保持一致。為保證后續(xù)實驗生物重復樣品量，本研究中對照組和實驗組均設置了3組平行，3組平行同時進行暴露，每組的馴養(yǎng)和暴露條件相同。

暴露實驗進行21 d后，使用3%三卡因(純度99%，美國Sigma公司)處死斑馬魚后，迅速使用冰冷的生理鹽水清洗，并將其置于解剖盤上進行解剖，取出斑馬魚腦組織，清洗干凈后裝入潔凈無菌離心管中，置于冰上備用。

1.3 斑馬魚腦β-半乳糖苷酶和氧化代謝酶CYP1B1含量測定

將對照組和暴露組的斑馬魚腦組織轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入200 μL冰冷的生理鹽水，使用勻漿器將組織勻漿2 min，制成斑馬魚腦組織勻漿。將斑馬魚腦組織勻漿使用冷凍離心機(5804 R，德國Eppendorf公司)在4 ℃、4 000 r·min-1條件下離心5 min，吸取上清備用。斑馬魚腦組織β-半乳糖苷酶和氧化代謝酶CYP1B1的含量使用酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒(中國上海哈靈有限公司)測定。測試過程嚴格按照試劑盒說明書進行。斑馬魚腦組織勻漿上清蛋白質(zhì)含量由BCA蛋白試劑盒(中國南京建成有限公司)測定，測定過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 轉(zhuǎn)錄組樣品測試與結(jié)果分析

為探究GO與PAHs對斑馬魚腦組織的作用機理，使用轉(zhuǎn)錄組學對其分子機理進行研究。在本研究中，GO有2個濃度，0.01 mg·L-1和0.1 mg·L-1，為獲得更好的實驗效果，斑馬魚腦組織轉(zhuǎn)錄組的樣品使用0.1 mg·L-1GO組；同時，為研究PAHs與GO-PAHs復合暴露對斑馬魚腦組織的影響，且為與GO組結(jié)果保持一致，因而本研究中轉(zhuǎn)錄組測定的濃度組為對照組、GO1組、PAHs組和PAHs-GO1組。獲取各濃度組斑馬魚腦組織后，迅速將其置入液氮中進行保存。樣品的RNA的提取和檢測參考本課題組之前的工作[25]，簡要步驟如下。

首先，樣品RNA提取使用TRIzol液(美國Invitrogen公司)，采用經(jīng)典提取法提取樣品的總RNA。樣品總RNA的純度和濃度分別使用超微量分光光度計(NP80，德國Implen公司)和Qubit?RNA測定試劑盒(Nano 6000，美國安捷倫公司)進行鑒定和測定；RNA測序前進行文庫構(gòu)建，文庫構(gòu)建完成后，使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nmol·L-1)，用以保證文庫質(zhì)量；文庫準確定量完成后進行上機測序。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：得到測序結(jié)果后，首先定義差異基因在本研究中，為保證去除測序過程中的假陽性的出現(xiàn)，對差異基因(different expressed genes,DEGs)的篩選標準為：∣Log2(暴露組的基因表達量/對照組基因的表達量)∣≥1，且其檢驗后的P≤0.0005，分別為上調(diào)基因和下調(diào)基因。同時，基因的功能分析，即功能富集分析和通路分析，均使用篩選出的DEGs進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的實驗組均設置3個或3個以上生物重復，結(jié)果用平均值±標準偏差表示。所得實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差(ANOVA)分析，當P<0.05時，認為在統(tǒng)計學上具有顯著性。斑馬魚腦組織功能富集分析以及通路分析數(shù)據(jù)均源于京都基因和基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫。對于轉(zhuǎn)錄組顯著差異通路的定義為：若該通路P<0.05時，則該通路則被認為是顯著變化的。數(shù)據(jù)條形圖和線圖均使用Origin 8.5繪制。

2 結(jié)果(Results)

2.1 斑馬魚暴露期間存活、畸形、CYP1B1酶和β-半乳糖苷酶含量變化

在成年斑馬魚暴露于對照組和暴露組21 d后，結(jié)果顯示，對照組和所有暴露組均未對成年斑馬魚的存活和畸形造成影響，該結(jié)果與已有研究報道結(jié)果一致[23-24]，說明在環(huán)境預測濃度的GO、5 μg·L-1PAHs及其復合暴露組中亞急性暴露狀態(tài)下均不會誘發(fā)成年斑馬魚的死亡和畸形。與此同時，暴露結(jié)束后斑馬魚的腦組織CYP1B1酶和β-半乳糖苷酶含量分別如圖1(a)和1(b)所示。相比于對照組，暴露組出現(xiàn)了下降趨勢，且GO1組和PAHs-GO1組CYP1B1含量顯著下降(P<0.05，圖1(a))，說明GO對斑馬魚腦CYP1B1含量造成了比較顯著的影響，PAHs-GO01組的CYP1B1含量亦顯著下降。與CYP1B1含量類似，GO01和GO1組斑馬魚腦組織β-半乳糖苷酶含量下降，其中GO01組β-半乳糖苷酶含量下降23.90%，GO1組β-半乳糖苷酶含量與對照組相比顯著下降(P<0.05，圖1(b))，下降50.27%。與此同時，與對照相比，PAHs-GO01組和PAHs-GO1組也同樣出現(xiàn)了β-半乳糖苷酶含量下降現(xiàn)象，分別下降12.14%和35.05%(P<0.05)，而PAHs組中β-半乳糖苷酶的含量與對照組相比無顯著性差異。

圖1 GO組、PAHs組和PAHs-GO復合暴露組對成年斑馬魚腦CYP1B1含量及β-半乳糖苷酶含量的影響注：*代表實驗組相對于對照組有顯著性差異(P<0.05)。Fig.1 Influences on brain CYP1B1 content and β-galactosidase content induced by GO,PAHs,PAHs-GO co-exposure in adult zebrafishNotes:*denote significant differences at P<0.05 compared with the control group.

2.2 GO、PAHs和聯(lián)合暴露對成年斑馬魚轉(zhuǎn)錄組的影響

為探究GO和PAHs和復合物對斑馬魚腦組織的分子水平的影響，對暴露組和對照組的斑馬魚腦組織進行了轉(zhuǎn)錄組研究。使用皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)和聚類分析對不同組別(包括對照組)基因表達相似度進行了分析，結(jié)果如圖2所示。對照組與GO1組、PAHs-GO1組和PAHs組之間的皮爾森系數(shù)分別為0.966、0.966和0.942(圖2(a))。對于皮爾森系數(shù)而言，2組之間比較的r2越接近于1，則2組之間的基因表達相似度越高。所以在皮爾森系數(shù)分析中，GO1組和PAHs-GO1組相對于PAHs組來說，其基因表達更接近于對照組。然而，值得注意的是，在皮爾森系數(shù)分析時，GO1組和PAHs-GO1組的系數(shù)相同，無法判斷GO1組和PAHs-GO1組基因表達相對于對照組的區(qū)別。因此，采用聚類分析來分析3個暴露組與對照組的基因表達區(qū)別，結(jié)果如圖2(b)所示。聚類分析的結(jié)果顯示，PAHs組基因的表達與對照組差異最大，而GO1組的基因表達是3個暴露組中最接近對照組的，PAHs-GO1組與對照組基因表達的差異介于GO1組和PAHs組之間。

圖2 GO組、PAHs組和PAHs-GO復合暴露組之間轉(zhuǎn)錄組基因表達差異分析注：(a) 皮爾森系數(shù)分析；(b) Hclust聚類分析。Fig.2 Analysis of differential expressed gene expression among GO,PAHs,PAHs-GO groupsNotes:(a) Pearson’s coefficient analysis;(b) Hclust analysis.

2.3 GO、PAHs和聯(lián)合暴露誘發(fā)的成年斑馬魚腦組織DEGs的分析

根據(jù)1.4中DEGs的篩選標準，本研究中轉(zhuǎn)錄組DEGs數(shù)量和分布情況如圖3所示。由3(a)～3(c)可知，GO1組引起的斑馬魚腦組織轉(zhuǎn)錄組的變化最小，共有61個DEGs，其中上調(diào)DEGs 29個，下調(diào)DEGs 32個；PAHs組包含最多的DEGs，其中上調(diào)DEGs 123個，下調(diào)DEGs 39個；PAHs-GO1組包含的DEGs介于GO1組和PAHs組之間，其中上調(diào)DEGs 34個，下調(diào)DEGs 59個。對3個暴露組的DEGs進行了分析，其結(jié)果如圖3(d)所示。在本研究中，3個暴露組共引起了251個基因的顯著變化，20個DEGs為3個暴露組共有，27個DEGs為GO1組和PAHs組共有，28個DEGs為GO1組和PAHs-GO1組共有，27個DEGs為GO1組和PAHs組共有，30個DEGs為PAHs-GO1組和PAHs組共有。總體而言，3個暴露組兩兩之間的共同DEGs數(shù)量雖然相近，但每個暴露組獨有的DEGs數(shù)量卻相差很大，轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果表明不同的暴露組合引發(fā)的分子毒性是不同的，且從誘發(fā)斑馬魚腦組織DEGs的數(shù)量上看，3個暴露組的排序為GO1組

圖3 GO1、PAHs和PAHs-GO1組誘發(fā)的斑馬魚轉(zhuǎn)錄組DEGs分布圖注：(a)～(c)分別為GO1、PAHs和PAHs-GO1組DEGs的數(shù)量火山圖；(d)為GO1、PAHs和PAHs-GO1組之間DEGs的韋恩圖；DEGs代表顯著差異表達基因。Fig.3 DEGs and analysis in zebrafish of control,GO1 group,PAHs group and PAHs-GO1 groupNotes:(a)～(c) represent the amount volcano figure of DEGs in control,GO1 group,PAHs group and PAHs-GO1 group,respectively;(d) represents the Venn diagram of DEGs in control,GO1 group,PAHs group and PAHs-GO1 group;DEGs was short for differential expressed genes.

由表2可知，在20個3個暴露組共有的DEGs中功能涉及細胞代謝(如ckma)、緊密連接(myhc4和mylpfa)、鈣離子轉(zhuǎn)運(atp2a1l和pvalb2等)和細胞骨架等(tnni2b.2和tpma等)。且除krt5在GO1組中上調(diào)、RCVRN在3個暴露組中上調(diào)外，其余DEGs在3個暴露組中的表達相比于對照組均顯著下調(diào)，說明在受到外界影響，尤其是納米材料、PAHs亦或是二者皆有的情況下，生物組織代謝以及細胞骨架等會率先響應，這種現(xiàn)象在既往研究中也有證實[26-28]。而當考察3個暴露組中獨有的DEGs時，3個暴露組的DEGs的功能也各有差異：GO1組包含氧化酶相關(guān)的DEGs，包括steap4和ncf1；而PAHs組中富集了能量代謝和緊密連接的相關(guān)基因，如uqcrfs1、cldnd和cldng等；PAHs-GO1組包含大量代謝過程相關(guān)的DEGs，如與有機環(huán)化合物代謝過程的arntl1a、氨基酸代謝相關(guān)基因gpt2l和膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因acap3a等。

表2 部分差異基因的功能Table 2 Function of partial differential expressed genes

2.4 GO、PAHs和聯(lián)合暴露誘發(fā)的成年斑馬魚腦組織基因通路變化的分析

從基因功能方面來看，基因的轉(zhuǎn)錄是調(diào)控生物過程的一個必不可少的方式。因而本研究將3個暴露組的DEGs進行了KEGG通路分析，GO1、PAHs和PAHs-GO1組的KEGG富集通路結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，GO1、PAHs和PAHs-GO1組的DEGs一共富集到了38個通路中，其中GO1、PAHs和PAHs-GO1組的DEGs分別富集到了17、25和25條基因通路。其中，GO1組顯著變化生物通路(P<0.05)有2個，分別為緊密連接和初次膽汁酸的生物合成；PAHs組的顯著變化生物通路(P<0.05)有4個，分別為緊密連接、細胞周期、心肌收縮和吞噬體；PAHs-GO1組的顯著變化生物通路(P<0.05)有4個，粘著斑、ECM-受體相互作用、緊密連接和光轉(zhuǎn)導。值得注意的是，緊密連接在3個暴露組中的通路富集基因數(shù)量均位于首位且均為顯著變化生物通路(P<0.05)；不僅如此，GO1組、PAHs-GO1組和PAHs組在緊密連接通路上富集的DEGs分別為3、4和6個，且GO1組在緊密連接通路上富集的DEGs(MYH13、myhc4和mylpfa)在PAHs-GO1組和PAHs組中均有表達和富集，而cldng和cldnd是PAHs組中獨有的DEGs。

表3 暴露組差異基因(DEGs)富集的基因通路Table 3 Function pathways of differential expressed genes (DEGs) in exposure groups

續(xù)表3通路名稱Pathway name通路編號Pathway serial暴露組DEGs數(shù)量DEGs amount mapped to function pathways暴露組通路富集P值P value of exposure groupsGO1PAHsPAHs-GO1GO1PAHsPAHs-GO1氨基糖和核苷酸糖代謝Amino sugar and nucleotide sugar metabolismdre00520010-0.2559-視黃醇代謝Retinol metabolismdre00830010-0.1868-RNA轉(zhuǎn)運RNA transportdre03013010-0.5377-mRNA監(jiān)測途徑mRNA surveillance pathwaydre03015010-0.3617-RNA降解RNA degradationdre03018010-0.3326-細胞周期Cell cycledre04110040-0.0055-p53信號通路p53 signaling pathwaydre04115020-0.0522-背腹軸形成Dorso-ventral axis formationdre04320010-0.1287-細胞粘附分子(CAMs)Cell adhesion molecules (CAMs)dre04514020-0.1451-嘧啶代謝Pyrimidine metabolismdre00240010--0.3535丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝Alanine, aspartate and glutamate metabolismdre00250010--0.15832-氧代羧酸代謝2-oxocarboxylic acid metabolismdre01210010--0.0825內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工Protein processing in endoplasmic reticulumdre04141010--0.5341NOD樣受體信號通路NOD-like receptor signaling pathwaydre04621010--0.1822光轉(zhuǎn)導Phototransductiondre04744020--0.0127

3 討論(Discussion)

納米材料進入水環(huán)境中，通過物理化學作用與有機污染物相互作用，可以通過影響有機污染物的生物可利用性和生物富集性影響污染物毒性。目前關(guān)于納米材料和有機污染物復合污染的研究有一定的報道[15,29-30]。本文中我們探索了GO與環(huán)境濃度PAHs對成年斑馬魚復合暴露誘發(fā)的腦組織酶含量的變化及復合暴露分子機理。

首先，在酶水平上，GO1組和PAHs-GO1組均顯著降低成年斑馬魚腦組織β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶含量。β-半乳糖苷酶是一種典型的細胞衰老標志物，其含量與細胞衰老速度相關(guān)[31-32]；另外，在生物細胞中，β-半乳糖苷酶的表達也同一些疾病的潛在風險密切相關(guān)[33]。而CYP1B1酶是抗氧化酶的一種，可以對外源化學物質(zhì)進行功能化反應[34-35]。Zindler等[14]的研究指出，自由溶解態(tài)的菲與羧基碳納米管對大型溞進行復合暴露后，使得菲的半最大效應濃度降低了25%～40%，從而增加菲對大型溞的毒性效應。在本文中，GO01組、GO1組、PAHs-GO01組和PAHs-GO1組均可誘發(fā)β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶含量下降，甚至GO1組和PAHs-GO1組與對照組相比有顯著下降的趨勢，但是PAHs組卻與對照組相比無顯著差異，GO01組與PAHs-GO01組、GO1組與PAHs-GO1組亦無顯著差異。造成這種結(jié)果的原因可能有二：(1)本文選取的GO和PAHs均為環(huán)境預測濃度和環(huán)境濃度，與既往相關(guān)復合暴露研究的濃度(碳材料10 mg·L-1以上、PAHs為70～735 μg·L-1)相比較低，因而兩者復合暴露時誘發(fā)的典型毒性效應(如酶含量)的差異不明顯；(2)GO對有機物如PAHs存在一定的吸附效應[14,22]，而復合暴露組與其對應的單獨GO暴露組誘發(fā)的毒性效應在酶含量上非常相似，因此，我們有理由推論，在本文提供的復合暴露條件下，在對成年斑馬魚的酶的毒性效應的影響中GO是占據(jù)主導地位的。

分子水平上，GO與環(huán)境濃度PAHs對斑馬魚成魚腦組織復合暴露誘發(fā)的效應與生物酶的結(jié)果不同，各暴露組誘發(fā)的基因水平變化的順序為PAHs組>PAHs-GO1組>GO1組。3個暴露組誘發(fā)的共有DEGs僅占DEGs總數(shù)的8.0%，包括細胞代謝、緊密連接、鈣離子轉(zhuǎn)運和細胞骨架等基礎功能，部分功能的基因表達變化已在本課題組之前的工作中進行了驗證[25]；而每個暴露組獨有的差異基因的高占比說明在分子層面上，單獨GO、單獨PAHs和PAHs-GO復合后的毒性機理是總體來說區(qū)別仍然很大。尤其是PAHs作為一種經(jīng)典的環(huán)境污染物，雖然在本研究的濃度下未對β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶的含量造成顯著影響，但是分子層面上，PAHs誘發(fā)了緊密連接蛋白相關(guān)基因cldnd和cldng的下調(diào)。有報道指出，cldng和cldnd是編碼緊密連接蛋白(claudin)的重要基因，而緊密連接蛋白的下調(diào)可能會引起生物血腦屏障的損傷[36-37]；而在GO1組和PAHs-GO1組中這2個基因并未出現(xiàn)顯著變化，說明PAHs對生物血腦屏障的影響可能更明顯，這可能是由于PAHs具有脂溶性，可通過代謝途徑導致生物細胞DNA和蛋白的損傷或產(chǎn)生活性氧簇，從而誘發(fā)細胞的損傷[38]。而在GO1組中，變化較為突出的基因功能以及相關(guān)的基因通路均與生物代謝和細胞骨架等功能相關(guān)，而這正是GO誘發(fā)的斑馬魚典型的分子效應[25,39]，同時與PAHs組對比可發(fā)現(xiàn)，GO1組在氧化酶相關(guān)基因的變化表現(xiàn)(如steap4和ncf1)要大于PAHs組，與本文中CYP1B1酶在GO組的變化趨勢大于PAHs組的結(jié)果相一致。

在PAHs-GO1組中，復合暴露組誘發(fā)的DEGs所在的基因通路與GO1組和PAHs組均有15條通路相同，說明PAHs-GO1組的毒性效應在分子機理上兼具GO1組和PAHs組的特點，同時也說明了2點：(1)PAHs-GO1復合暴露組兼具GO和PAHs的分子毒性效應的特點與β-半乳糖苷酶和CYP1B1酶的結(jié)果相呼應，即，其誘發(fā)的效應在2個單獨暴露組中間；(2)雖然GO在水環(huán)境中會對PAHs產(chǎn)生吸附，且在對成年斑馬魚腦組織效應中GO占主導地位，但是在分子層面上，與GO共同存在的PAHs依然具有分子毒性，而且在復合后可能會誘發(fā)新的基因通路變化，值得我們注意；(3)本研究中采取的GO濃度和PAHs的濃度相對較小，在自然環(huán)境中，水體中PAHs的含量可能因為環(huán)境突發(fā)事件或者水文條件改變等發(fā)生變化，因而GO與動態(tài)變化的PAHs的復合暴露效應是值得進一步深入研究。本研究結(jié)果可為后續(xù)相關(guān)的環(huán)境濃度納米材料與環(huán)境污染物之間的相互作用和復合毒性效應提供了重要的參考資料，同時也可為研究GO與自然環(huán)境污染物的復合毒性機理研究提供了研究思路及技術(shù)研究手段。