防腐木材中戊唑醇和丙環(huán)唑的高效液相色譜分析方法

張景朋，張卿碩，吳玉章，蔣明亮*

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091； 2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院木材工業(yè)研究所，北京 100091)

木材作為一種生物質(zhì)材料，在使用過程中極易遭受蟲蛀以及腐朽菌、霉菌等微生物的侵害[1-2]。木材防腐處理可以延長木材使用壽命5倍左右[3]，是節(jié)約木材的重要措施，對木材資源高效利用具有重要意義。木材防腐劑包括銅基、硼基防腐劑，以及有機殺菌劑和天然提取物為主成分的防腐劑[4-6]，目前戶外防腐材使用最廣泛的為銅基防腐劑和有機防腐劑，市場占有率超過95%。銅唑(CA)是由銅胺絡(luò)合物和三唑殺菌劑復(fù)配而成的一種水載型木材防腐劑，其中三唑藥劑是戊唑醇(TEB)和丙環(huán)唑(PPZ)[3]，銅唑制劑抗流失性強、防腐防白蟻性能優(yōu)良[7-8]，處理材野外耐久9年完好[9]，已在我國大量推廣應(yīng)用。戊唑醇和丙環(huán)唑(兩者簡稱PT)作為麥角甾醇生物合成抑制劑對擔(dān)子菌、子囊菌等木材腐朽菌有很好的防治效果[10]，已被列入GB/T 27654—2011《木材防腐劑》和GB/T 27651—2011《防腐木材的使用分類和要求》，室外地上使用載藥量在300 g/m3以下，使用成本較低、環(huán)境相容性好[8]。

為了保證含PT防腐劑處理木材的質(zhì)量，建立一種簡便、準確分析防腐材中戊唑醇和丙環(huán)唑含量的方法非常重要。戊唑醇和丙環(huán)唑一般采用高效液相色譜法(HPLC)分析[11]，將戊唑醇和丙環(huán)唑從木材中充分抽提是準確分析其含量的關(guān)鍵，Miyauchi等[12]和馬紅霞等[13]報道了超聲波提取木材中戊唑醇的方法，其中木材抽提物的干擾色譜峰通過固相萃取預(yù)處理減弱或消除，可實現(xiàn)戊唑醇的準確分析。不同木材的抽提物組成和含量會有差別[14]，抽提物色譜峰的干擾對PT的準確分析影響較大。目前關(guān)于防腐木中PT的提取以及HPLC分離分析的研究鮮有報道，僅有GB/T 23229—2009《水載型木材防腐劑分析方法》和GB/T 33021—2016《有機型木材防腐劑分析方法 三唑及苯并咪唑類》公布了關(guān)于PT及其處理木材中含量的分析方法，其中關(guān)于防腐木分析的前處理用時較長、操作步驟煩瑣，對防腐木樣品的前處理進行優(yōu)化研究，可為相關(guān)標準修訂提供支撐。

在前期PT分析方法[15]研究基礎(chǔ)上，筆者重點對超聲波提取木材中PT方法的提取溶劑種類、溶劑用量、提取時間進行優(yōu)化，運用最佳提取方法對輻射松、杉木、楊木、橡膠木和竹材的處理材進行前處理，對處理液采用HPLC進行PT的含量分析，為防腐材中PT的含量分析提供簡便快捷的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

輻射松(Pinusradiata)產(chǎn)地新西蘭；杉木(Cunninghamialanceolata)產(chǎn)自湖南??；橡膠木(Heveabrasiliensis)產(chǎn)自海南省樂東縣；楊木(Populusspp.)，107品系，產(chǎn)自山東省長青縣。選取無明顯節(jié)子、變色等缺陷的邊材制成規(guī)格20 mm×20 mm×20 mm(縱向×弦向×徑向)的試件。毛竹(Phyllostachysedulis)，竹齡4年，產(chǎn)于浙江省杭州市，刨去竹青、竹黃后的竹條，制成50 mm×20 mm×5 mm(縱向×弦向×徑向)的試件。

石油醚、環(huán)己烷、丙酮、乙醇，均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，購自美國Thermo-Fisher公司；丙環(huán)唑(質(zhì)量分數(shù)≥95%)，褐色黏稠狀液體；戊唑醇(質(zhì)量分數(shù)≥97%)，白色粉末，購自溫州綠佳農(nóng)藥進出口有限公司；戊唑醇標準品(純度≥99.5%，甲醇中丙環(huán)唑溶液標準物質(zhì)1 000 mg/L)，購自北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院；PT制劑，其中戊唑醇質(zhì)量分數(shù)7.2%、丙環(huán)唑質(zhì)量分數(shù)7.4%，由本實驗室自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

根據(jù)參考文獻[11,16]，結(jié)合各種木材的抽提物分離條件，確定如下色譜條件：SilGreen C18色譜柱(長×柱徑=250 mm×4.6 mm，填料粒徑5 μm，購自北京綠百草科技發(fā)展有限公司)；柱溫30 ℃；流動相V甲醇∶V乙腈∶V水=1∶1∶1，流速1.2 mL/min；檢測波長220 nm；進樣量20 μL。

1.2.2 標準溶液配制

稱取0.010 0 g戊唑醇標準品于10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇定容至刻度得1 000 mg/L標準溶液。分別量取1 000 mg/L的戊唑醇和丙環(huán)唑標準溶液各5 mL混合均勻，得到質(zhì)量濃度均為500 mg/L的PT標準溶液。將上述溶液用甲醇稀釋，配得質(zhì)量濃度梯度為5，20，40，60，80和100 mg/L的PT系列標準溶液，在相同的色譜條件下進樣分析，繪制標準曲線。

1.2.3 輻射松試件的防腐處理

稱取10.000 g的PT制劑于2.5 L燒杯中，加水至1 000 g稀釋得到一定濃度的處理藥液。選取無節(jié)子、變色等缺陷的輻射松試材，在28 ℃烘箱中，自然氣干，含水率為9.2%。稱取處理前質(zhì)量(精確至0.001 g)，將試件放入處理槽中，用重物壓穩(wěn)，注入防腐處理液，置于真空干燥箱中，抽真空至-0.09 MPa，保持15 min，卸壓后常壓浸泡10 min。處理完畢后取出試件，用濾紙擦去表面殘留藥液，稱取處理后質(zhì)量(精確至 0.001 g)，在28 ℃烘箱中，自然氣干7天，含水率為9.2%。試件中藥劑的載藥量按如下公式計算：

R0=(m2-m1)c/m1×103

(1)

式中：R0為試件中防腐劑的載藥量，mg/g；m1為試件吸藥前質(zhì)量，g；m2為試件吸藥后質(zhì)量，g；c為防腐劑中有效成分的質(zhì)量分數(shù)，%。

圖1 PT溶液色譜圖Fig. 1 PT solution chromatograms

1.2.4 木竹材樣品的制備與分析

1)輻射松分析樣品的預(yù)處理方法優(yōu)化：將處理的輻射松鋸解成厚5 mm的小試件，用植物粉碎機粉碎過 30目(孔徑為0.55 mm)篩。準確稱取約0.300 0 g木粉于30 mL螺蓋樣品瓶中，準確加入體積為V的溶劑，旋緊螺蓋，置于超聲波清洗器中，保持溫度25 ℃，超聲提取一定時間。結(jié)束后，取上層清液，過孔徑為0.45 μm有機濾膜后，用于HPLC分析，每組樣品重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)防腐劑的回收率對超聲預(yù)處理的溶劑種類、溶劑用量、提取時間因素進行優(yōu)化。試件中防腐劑載藥量的測定值按如下公式計算：

R=V×C/(m×103)

(2)

式中：R為試件中防腐劑載藥量的測定值，mg/g；V為提取溶劑體積，mL；C為測得的有效成分質(zhì)量濃度，mg/L；m為木粉的質(zhì)量，g。

2)5種木竹材樣品的制備與分析：將輻射松、杉木、橡膠木、楊木和竹材的素材試件用植物粉碎機制成木粉。準確稱取0.300 0 g木粉于30 mL螺蓋樣品瓶中，用移液槍量取戊唑醇和丙環(huán)唑質(zhì)量濃度為714和734 mg/L的PT溶液1 mL 加入樣品瓶中，敞口在自然狀態(tài)下充分氣干得戊唑醇和丙環(huán)唑質(zhì)量載藥量分別為2.380和2.447 mg/g的分析樣品；使用戊唑醇和丙環(huán)唑質(zhì)量濃度為178.5和183.5 mg/L的PT溶液用同樣的方法處理，得到載藥量分別為0.595 和0.612 mg/g 的分析樣品。采用優(yōu)化出的超聲提取條件進行處理，處理后樣品液過孔徑為0.45 μm有機濾膜后，用于HPLC分析，每組進行5次重復(fù)，計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析方法的評價

質(zhì)量濃度約為24 mg/L的PT制劑溶液的色譜圖見圖1a，色譜圖中基線較穩(wěn)，色譜峰峰形較好，無拖尾，兩者分離效果理想。其中戊唑醇保留時間在14.3 min，丙環(huán)唑的出峰時間在17.1 min左右，其與GB/T 33021—2016中戊唑醇和丙環(huán)唑保留時間相比有所延長，主要原因是本研究所用色譜柱規(guī)格不同，且流動相流速較慢所致。丙環(huán)唑色譜峰出現(xiàn)分叉是因為對映體的存在。此外，檢測防腐木竹材中防腐劑的含量，色譜分析最關(guān)鍵的是實現(xiàn)木材抽提物色譜峰和防腐劑色譜峰的完全分離。采用上述流動相對防腐輻射松抽提后進行液相色譜分析，如圖1b所示，輻射松抽提物種類較多，大部分在防腐劑出峰之前已分離出來，在丙環(huán)唑出峰后僅有1個小雜峰，抽提物色譜峰對戊唑醇和丙環(huán)唑色譜定量分析無干擾。

采用外標法定量分析PT含量，以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標作圖，得戊唑醇(丙環(huán)唑)線性相關(guān)曲線(圖2)。在5～100 mg/L線性范圍內(nèi)：戊唑醇線性方程為y=35.465x+0.349 3，決定系數(shù)R2=0.999 7；丙環(huán)唑線性方程為y=35.653x-12.660 0，決定系數(shù)R2=0.999 7。

圖2 戊唑醇和丙環(huán)唑的標準曲線Fig. 2 Standard curves of tebuconazole and propiconazole

6份平行試樣在相同色譜條件下進行進樣分析，精密度結(jié)果見表1。其中，戊唑醇的平均含量為7.17%，標準偏差為0.07%，變異系數(shù)為0.98%；丙環(huán)唑的平均含量為7.45%，標準偏差為0.06%，變異系數(shù)為0.83%。戊唑醇和丙環(huán)唑的相對標準偏差均非常小，表明平行分析結(jié)果之間數(shù)據(jù)非常接近，分析方法精密度高。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Precision test results

在戊唑醇和丙環(huán)唑質(zhì)量濃度分別為11.970和12.440 mg/L的PT樣品中添加一定質(zhì)量濃度的PT標準品，在相同色譜條件下進行測定，計算回收率，結(jié)果見表2。測得戊唑醇和丙環(huán)唑的回收率分別為99.0%～101.3%和98.9%～100.8%，表明該方法準確度較高。由此可知，本研究所采用的分析方法標準曲線線性相關(guān)性好，精密度及準確度較高，可準確應(yīng)用于有效成分戊唑醇和丙環(huán)唑的含量分析。

表2 準確度試驗結(jié)果Table 2 Accuracy test results

2.2 防腐輻射松中PT提取方法的優(yōu)化

取防腐處理后的輻射松木粉，采用不同極性的有機溶劑對PT進行超聲提取，測定結(jié)果見圖3a。結(jié)果表明不同溶劑的提取效率不同，石油醚、環(huán)己烷和丙酮對戊唑醇的提取效果優(yōu)于丙環(huán)唑，回收率均小于60%，提取效果最差；乙腈、乙醇對戊唑醇和丙環(huán)唑的提取效果無差別，但乙腈和乙醇的回收率大約在50%和70%；采用強極性甲醇超聲提取戊唑醇和丙環(huán)唑的測定載藥量與理論載藥量一致，能夠很準確地提取檢測輻射松中PT的含量，優(yōu)先使用甲醇作為溶提取劑。出現(xiàn)上述差別，可能是因為木材表面有許多極性基團[14]，極性太小的溶劑，會很難滲透到木材內(nèi)部，難以提取出木材內(nèi)的藥劑。

a)提取溶劑; b)提取溶劑體積; c)液料比; d)超聲時間。圖3 防腐輻射松中PT提取方法的條件優(yōu)化Fig. 3 Optimization of conditions for PT extraction method in anti-corrosion Pinus radiata

水在提取中代替甲醇使用具有較高環(huán)保和經(jīng)濟價值。在提取木材中的PT時，雖然水的極性最大，最易滲透木材，但PT在水中溶解度較小，很難將木材中的藥劑全部溶出，兼顧對木材滲透性和對藥劑的溶解性，需將水和甲醇混合。甲醇和水的體積比為9∶1和8∶2時，對輻射松中戊唑醇和丙環(huán)唑提取均比較完全，測定載藥量與上面采用甲醇提取的結(jié)果一致(圖3b)，但隨著甲醇與水的體積比增大到7∶3之后，對輻射松中戊唑醇和丙環(huán)唑的提取率下降到95%左右，在保證測定載藥量接近理論載藥量前提下，甲醇與水的體積比為8∶2較為合適，推薦為超聲提取中的適宜溶劑。

提取分析木材中藥劑時，溶劑用量越低越經(jīng)濟，溶劑用量用液料比(溶劑體積與木粉質(zhì)量之比，mL∶g)表示。用甲醇與水體積比為8∶2的混合液提取輻射松中的PT，不同液料比測定結(jié)果如圖3c所示。在液料比為10∶1時，戊唑醇和丙環(huán)唑的測定載藥量分別是1.170和1.262 mg/g，低于實際計算載藥量，表明溶劑用量過少，不能將杉木中的PT充分提取出來。隨著液料比增大到30∶1及以上時，測定載藥量均非常接近理論載藥量，后續(xù)分析采用30∶1的液料比最為合適。

在上述提取條件下，對輻射松在不同提取時間下的樣品溶液進行分析，結(jié)果如圖3d所示。超聲提取10 min時戊唑醇和丙環(huán)唑的測定載藥量為1.198 和1.265 mg/g，回收率較低；超聲提取時間延長到30 min時，戊唑醇和丙環(huán)唑的測定載藥量均接近各自的理論載藥量，可實現(xiàn)輻射松中PT的充分提取，因此從效率和能耗角度考慮，不必將時間延長到60 min或更長，選取超聲提取30 min作為最佳提取時間。

綜上所述，對防腐輻射松中的PT含量分析時，前處理采用超聲波提取法，優(yōu)化得到的最佳條件為：甲醇和水(體積比8∶2)為溶劑，采用30∶1(mL∶g)的液料比，提取時間30 min。與GB/T 23229—2009和GB/T 33021—2016相比，超聲提取的時間縮短至30 min，且超聲波提取木材中戊唑醇和丙環(huán)唑的前處理方法簡化了步驟：處理后的抽提液過濾后直接進行HPLC分析，不需先濃縮至干，再定容的操作。

2.3 提取方法對5種防腐木竹材的處理分析

除輻射松外的其他4種木竹材素材在相同處理條件下抽提物的液相分析在處理之前進行，結(jié)果顯示抽提物對PT分析均無干擾(圖4)。為進一步驗證所優(yōu)化出的防腐木中PT提取方法的可靠性和適用性，在上述優(yōu)化得到的最佳提取條件下進行前處理，除輻射松外，同時處理和分析了包括杉木、橡膠木、楊木和竹材在內(nèi)的5種防腐木竹材樣品。

圖4 杉木、橡膠木、楊木和竹材的提取溶液色譜圖Fig. 4 Extraction solution chromatograms of Cunninghamia lanceolata, Hevea brasiliensis, Populus spp and bamboo

5種處理材的測試結(jié)果見表3，每個樹種2個水平的載藥量。結(jié)果表明：所有防腐木竹中戊唑醇和丙環(huán)唑的回收率分別為95.2%～102.1%和95.9%～104.0%，標準偏差分別為0.7%～3.0% 和 0.3%～2.8%，均在可接受范圍。出現(xiàn)回收率大于100%是由于系統(tǒng)誤差造成的，如前處理過程中個別樣品瓶未能完全密封導(dǎo)致部分溶劑的揮發(fā)，會使分析結(jié)果偏高。從表3可以看出，對輻射松、杉木、橡膠木和楊木的防腐處理材中PT的含量分析結(jié)果均接近實際載藥量值。對防腐處理竹材的PT含量分析結(jié)果稍低于實際載藥量，戊唑醇和丙環(huán)唑的回收率在96%左右，可能是因為混合溶劑(甲醇和水)對竹材的滲透性較差，相比于木材提取較慢，在超聲處理的30 min內(nèi)不能將竹材里的藥劑全部提取出來，對防腐竹材前處理時可適當(dāng)延長超聲提取時間或改為純甲醇溶劑提取。對于其他樹種防腐木中PT的含量分析也可參照此方法，但需確保抽提物的色譜峰對PT色譜峰無干擾。

表3 5種防腐木竹材的分析結(jié)果(n=5)Table 3 Analysis results of five kinds treated wood and bamboo (n=5)

3 結(jié) 論

1)采用紫外檢測器及C18反相色譜柱，檢測戊唑醇和丙環(huán)唑的色譜條件：甲醇、乙腈和水(體積比1∶1∶1)為流動相，流速1.2 mL/min，檢測波長220 nm；在5～100 mg/L范圍內(nèi)，標準曲線決定系數(shù)R2均為0.999 7，線性相關(guān)性好，精密度及準確度較高，可用于戊唑醇和丙環(huán)唑含量分析。

2)超聲波法提取輻射松中戊唑醇和丙環(huán)唑，最佳條件為：甲醇和水(體積比8∶2)為溶劑，采用30∶1(mL∶g)的液料比，提取時間30 min。超聲波提取木材中戊唑醇和丙環(huán)唑的方法溶劑消耗少、提取時間短。

3)最佳提取和色譜條件下，處理分析輻射松、杉木、橡膠木、楊木和竹材5種樣品中戊唑醇和丙環(huán)唑的回收率分別為95.2%～102.1%和95.9%～104.0%，標準偏差分別為0.7%～3.0%和0.3%～2.8%。該方法可以檢測常用防腐處理材中戊唑醇和丙環(huán)唑的含量，具有前處理快捷、分析結(jié)果重現(xiàn)性好、適用性廣的優(yōu)點，同時提取過程減少了有機溶劑用量。