補腎健脾化瘀中藥對難治/復(fù)發(fā)再生障礙性貧血患者骨髓CD3+T 淋巴細胞內(nèi)p-mTOR、p-S6、IFN-γ 表達的影響*

李 錦，華海應(yīng)△，高華強，朱文艷，周 曄，王志清，張 艷，何廣勝

1 江南大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，江蘇 無錫 214041；2 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血功能衰竭性疾病，普遍認為AA 是由功能亢進的T 淋巴細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾?。?-2］。以免疫抑制治療(immunosuppressive therapy，IST)為主，應(yīng)用抗人胸腺細胞球蛋白(antithymocyte globulin，ATG)和環(huán)孢素(Cyclosporine A，CsA)方案治療，療效約60%～80%，有約30%患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)。目前對于難治/復(fù)發(fā)AA，除異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）外，尚無統(tǒng)一的有效治療方案[3]，且allo-HSCT找到人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相合供體少，其次受年齡與身體因素影響，適合者很少，這就迫切需要尋找新的治療方法。

AA 屬中醫(yī)“虛勞”“血虛”“亡血”等范疇，中醫(yī)認為血液的生成、運行和功能狀態(tài)與心、肝、脾、腎有關(guān)，與脾、腎關(guān)系尤為密切［4-5］。江南大學(xué)附屬醫(yī)院采用中西醫(yī)結(jié)合治療難治/復(fù)發(fā)AA 常聯(lián)合補腎健脾化瘀中藥，取得了較好療效，但具體機制尚不明確。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎健脾化瘀中藥對難治/復(fù)發(fā)AA 患者骨髓紅系集落形成單位（colony forming unit-erythroid，CFU-E）、紅系爆式集落形成單位（burst forming unit-erythroid，BFU-E）、粒-巨噬細胞集落形成單位(colony forming unit-granulocyte macrophage，CFU-GM)具有促增殖作用［6］，為進一步探討具體作用機制，本研究采用補腎健脾化瘀中藥、雷帕霉素干預(yù)難治/復(fù)發(fā)AA與初發(fā)AA患者骨髓造血細胞，運用流式細胞術(shù)檢測藥物處理前后各組CD3+T 淋巴細胞內(nèi)磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、磷酸化核糖體蛋白S6(phosphorylated ribosomal protein S6，p-S6)及干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的表達水平。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2015 年8 月至2017 年7 月門診與住院的AA患者28例，其中難治/復(fù)發(fā)AA 15例中女6 例，男9 例；中位年齡24（12～61）歲；初治AA 13 例中女5 例，男8 例；中位年齡21（9～58）歲。應(yīng)用CsA 或聯(lián)合ATG 進行免疫抑制劑治療，治療6個月無效視為難治性AA；AA 經(jīng)正規(guī)免疫抑制劑治療獲得緩解后，患者出現(xiàn)外周血細胞計數(shù)下降到緩解中位水平的50%以下，或需要輸注血制品，如輸注紅細胞或（和）血小板視為復(fù)發(fā)AA。同期選取對照組14 例（缺鐵性貧血7 例，正常骨髓7 例），其中女6 例，男8 例，中位年齡25（11～62）歲。本研究經(jīng)南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)1）心、肝、肺、腎功能不全；2）合并其他嚴(yán)重并發(fā)癥；3）合并惡性腫瘤；4）不能耐受骨穿者；5）對研究藥物過敏者。

1.3 研究方法

1.3.1 中藥試劑 黃芪多糖（CAS：89250-26-0；規(guī)格：20 mg/瓶）、淫羊藿甙（CAS：489-32-7；規(guī)格：50 mg/瓶）、三七總皂甙（CAS：88105-29-7；規(guī)格：50 mg/瓶）、人參二醇（CAS：7755-01-3；規(guī)格：20 mg/瓶）均由南京景竹生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量分數(shù)分別為：70%、≥85%、90%及95%；巴戟天多糖（CAS：59432-60-9；規(guī)格：50 mg/瓶）、菟絲子黃酮（CAS：190801；規(guī)格：20 mg/瓶）、黃精多糖（CAS：S27804；規(guī)格：50 mg/瓶）、當(dāng)歸多糖（CAS：A22001；規(guī)格：20 mg/瓶）均由陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量分數(shù)分別為≥95%、90%、85%、90%。

1.3.2 骨髓采集與分組處理 在無菌條件下采集受試者骨髓液5 mL，緩慢注入含肝素抗凝無菌試管中，并搖勻。將對照組、初發(fā)AA、復(fù)發(fā)/難治AA 3 組受試者骨髓標(biāo)本分別置于24 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)本底組（空白組）、雷帕霉素組和補腎健脾化瘀中藥組。雷帕霉素組加入終濃度25 nmol/L的雷帕霉素；中藥組加入當(dāng)歸多糖、淫羊藿甙、巴戟天多糖、黃芪多糖、三七總皂甙、黃精多糖各100 μg/mL及菟絲子黃酮、人參二醇各50 μg/mL；空白組加入生理鹽水。每孔1 mL，每組設(shè)3 個復(fù)孔。每孔分別加入含10%胎牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)基至1 mL，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育48 h。

1.3.3 p-mTOR、p-S6、IFN-γ水平檢測 用免疫磁珠分選對照組、初發(fā)AA、復(fù)發(fā)/難治AA各組藥物處理前后（培養(yǎng)箱孵育48 h）骨髓單個核細胞的CD3+T 淋巴細胞，各組加入破膜劑進行T 淋巴細胞破膜，分別加入抗p-mTOR、抗p-S6與FITC-IFN-γ，以CD3+T 淋巴細胞為橫坐標(biāo)，細胞計數(shù)為縱坐標(biāo)，形成直方圖，獲得5000 個以上CD3+T 淋巴細胞數(shù)，上流式細胞儀分析CD3+T 細胞胞漿內(nèi)的p-mTOR、p-S6及IFN-γ表達，以陽性細胞百分數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 11.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以D表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用成組設(shè)計t檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR 表達實驗中CD3+T 淋巴細胞的純度均為94%以上，藥物處理前，復(fù)發(fā)/難治AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR表達均高于初發(fā)AA及對照組（P＜0.01），而初發(fā)AA與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。藥物處理后，復(fù)發(fā)/難治AA 組中雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥均能降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR 表達（P＜0.01），雷帕霉素與補腎健脾化瘀組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；初發(fā)AA 與對照組中，雷帕霉素、補腎健脾化瘀中藥降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR 表達不明顯（P＞0.05）。見表1及圖1。

表1 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR的表達（D）%

表1 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR的表達（D）%

注：*表示與對照組比較，P＜0.01；△表示與復(fù)發(fā)/難治AA組藥物處理前比較，P＜0.01

圖1 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR的表達（流式細胞）

2.2 CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-S6 的表達藥物處理前，復(fù)發(fā)/難治AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-S6 表達均高于初發(fā)AA 及對照組（P＜0.01），而初發(fā)AA與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。藥物處理后，復(fù)發(fā)/難治AA組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥能降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-S6 表達（P＜0.01），雷帕霉素與補腎健脾化瘀中藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；初發(fā)AA與對照組中，雷帕霉素、補腎健脾化瘀中藥降低CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-S6 表達不明顯（P＞0.05）。見表2及圖2。

圖2 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-S6的表達（流式細胞）

表2 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-S6的表達（D）%

表2 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-S6的表達（D）%

注：*表示與對照組比較，P＜0.01；△表示與復(fù)發(fā)/難治AA組藥物處理前比較，P＜0.01

2.3 CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ 表達藥物處理前，復(fù)發(fā)/難治AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ表達均高于初發(fā)AA及對照組（P＜0.01），初發(fā)AA 患者IFN-γ表達高于對照組（P＜0.01）。藥物處理后，復(fù)發(fā)/難治AA 組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥能降低CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ表達（P＜0.01）；初發(fā)AA 組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥均能降低CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ表達（P＜0.01），雷帕霉素與補腎健脾化瘀中藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；對照組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ表達作用不明顯（P＞0.05）。見表3及圖3。

圖3 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ的表達（流式細胞）

表3 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ的表達（D）%

表3 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)IFN-γ的表達（D）%

注：*表示與對照組比較，P＜0.01；▲表示與初發(fā)AA組藥物處理前比較，P＜0.01；△表示與復(fù)發(fā)/難治AA組藥物處理前比較，P＜0.01

3 討論

腎主骨生髓，藏精，精血互化，腎精虧虛，骨髓失于充養(yǎng)，不能化生氣血，以致唇甲淡白、面色萎黃、氣短、心悸、乏力，腦失滋養(yǎng)，導(dǎo)致耳鳴、頭暈、健忘；骨髓空虛，腰府失養(yǎng)，致使氣虛無力推動血脈運行，腰膝酸軟；血虛則血行不暢，導(dǎo)致離經(jīng)之血不去，瘀阻絡(luò)脈，致使皮膚瘀點或瘀斑；瘀血不去，新血不能生，致病情纏綿難愈。因此腎精虧虛、氣血不足、瘀血內(nèi)阻是AA 的重要病機，治療宜采用補腎中藥。研究顯示，補腎陰、補腎陽及健脾化瘀中藥治療AA已取得一定療效［7］。臨床用于治療AA 的補腎陽中藥包括菟絲子、淫羊藿、巴戟天等，菟絲子黃酮可通過補腎促進幼年大鼠睪丸支持細胞增殖和分化［8］；用于治療AA 的補腎陰中藥有熟地黃、黃精等，熟地黃多糖、黃精多糖均具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用［9］；淫羊藿苷具有雌激素樣作用，有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、壯陽等功效［10］；巴戟天多糖具有增強機體免疫，改善生殖功能等作用［11］；用于治療AA 的益氣養(yǎng)血中藥有人參、當(dāng)歸、黃芪等，人參二醇能有效促進造血功能，改善AA 患者骨髓抑制，加快造血功能恢復(fù)，升高外周血象，同時通過恢復(fù)AA 小鼠失衡的Th1/Th2/Treg 細胞比例而調(diào)節(jié)免疫功能［12］；黃芪多糖對小鼠有免疫功能調(diào)節(jié)作用，還可刺激B 細胞的活化與增殖來增高機體體液免疫能力［13］。當(dāng)歸多糖可防護X 線損傷大鼠骨髓及脾臟，促進血細胞增殖［14-15］；用于治療AA的活血藥物有三七等，三七總皂甙通過促進骨髓與骨髓間充質(zhì)細胞分化，促進血細胞與間充質(zhì)細胞生成［16］。

本研究采用補腎健脾化瘀中藥（當(dāng)歸多糖、淫羊藿甙、巴戟天多糖、黃芪多糖、三七總皂甙、黃精多糖，菟絲子黃酮、人參二醇）兼補腎陰、腎陽，健脾化瘀。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理前，復(fù)發(fā)/難治AA患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達均高于初發(fā)AA 及對照組；藥物處理后，在難治/復(fù)發(fā)AA 組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥均能降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達，雷帕霉素組與補腎健脾化瘀中藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。既往研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)/難治AA 患者對CsA 耐藥與CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR/p-S6/IFN-γ異常活化有關(guān)，對雷帕霉素敏感與雷帕霉素靶向抑制CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR/p-S6/IFN-γ異常活化有關(guān)，雷帕霉素通過不同的機制作用環(huán)孢菌素治療免疫介導(dǎo)的AA［17-18］。本研究結(jié)果進一步證實了補腎健脾化瘀中藥與雷帕霉素均能通過抑制復(fù)發(fā)/難治AA患者CD3+T淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達，抑制T 淋巴細胞活性，降低造血負調(diào)控因子，促進造血功能重建。此研究結(jié)果在國內(nèi)外未見相關(guān)報道，與雷帕霉素比較未顯示明顯優(yōu)勢，但補腎健脾化瘀中藥可以減少雷帕霉素不良反應(yīng)，為補腎健脾化瘀中藥臨床治療復(fù)發(fā)/難治AA 患者提供了一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，補腎健脾化瘀中藥通過抑制難治/復(fù)發(fā)AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內(nèi)p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達，進而抑制T 淋巴細胞異常激活，改善骨髓造血功能。今后將進一步研究補腎健脾化瘀中藥聯(lián)合CsA治療難治/復(fù)發(fā)AA，判斷補腎健脾化瘀中藥克服CsA 耐藥后的療效是否明顯提高，且具體作用機制及是否通過其他途徑發(fā)揮作用也有待進一步研究。