響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌抽提物的制備工藝研究

劉依盟，鮑正好，馬 倩，李雨晴，王春婷，金銀玉，閆志鵬，賈麗娜，齊 威

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱[1]，其廣泛分布于人體、動(dòng)物體、植物以及發(fā)酵食品中，部分已經(jīng)被列入可用于食品的菌種名單[2-3]。它們不僅是研究生化、遺傳、分子生物學(xué)和基因工程的理想對(duì)象，同時(shí)在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值也極高[4-6]。乳酸菌在自溶過(guò)程中，會(huì)釋放胞內(nèi)蛋白酶、肽酶、酯酶等多種酶類，能夠?qū)⒌鞍?、多肽和脂肪分解成不同的風(fēng)味成分或風(fēng)味前體成分[7]。乳酸菌自溶物含有多種風(fēng)味物質(zhì)、胞內(nèi)代謝物，可能具有潛在的營(yíng)養(yǎng)、保健功能、調(diào)香調(diào)味等作用和用途。

目前，對(duì)以乳酸菌為原料，將乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等進(jìn)行降解及后加工的純天然乳酸菌抽提物的研究報(bào)道較少。因此本試驗(yàn)以自溶率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究NaCl、溶菌酶、超聲、蛋白酶對(duì)乳酸菌自溶的影響，進(jìn)一步利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌抽提物制備工藝參數(shù)，并對(duì)乳酸菌抽提物的氨基酸態(tài)氮、蛋白質(zhì)、總酚、抗氧化能力、揮發(fā)性風(fēng)味成分等營(yíng)養(yǎng)和功能指標(biāo)進(jìn)行分析研究。以期明確乳酸菌抽提物含有的營(yíng)養(yǎng)成分、香氣物質(zhì)和保健功能，為乳酸菌抽提物應(yīng)用于食品添加劑和保健食品等領(lǐng)域提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC8198：由本實(shí)驗(yàn)室保存；中性蛋白酶（50 000 U/mL）、酸性蛋白酶（100 000 U/mL）、堿性蛋白酶（300 000 U/mL）、胰蛋白酶（250 U/mg）：山東隆科特酶制劑有限公司；溶菌酶（20 000 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜-5977B質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；SpectraMAX 190酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；FE20 pH計(jì)：瑞士Mettler Toledo公司；Scientz-1200E超聲破碎儀：寧波新芝公司；50/30 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）復(fù)合萃取頭：美國(guó)Sigma公司；HP-5極性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌抽提物制備工藝流程及操作要點(diǎn)

乳酸菌培養(yǎng)→離心收集乳酸菌泥→配制乳酸菌懸液→自溶（超聲、自溶促進(jìn)劑、蛋白酶等）→加熱滅酶活→離心分離→收集上清液→冷凍干燥成粉狀

乳酸菌培養(yǎng)：①活化：挑取L.plantarumCGMCC8198小菌落接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。②一級(jí)種子液：以10%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。③二級(jí)種子液：以10%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期。④乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)：以10%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

離心收集乳酸菌泥：將乳酸菌在離心機(jī)中以4 500～5 000 r/min離心分離15～20 min。

配制乳酸菌懸液：用pH 6.8～7的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersaline，PBS）溶液重懸乳酸菌泥，懸液濃度為10%。

自溶：在適宜的溫度和pH條件下，利用超聲處理、添加一定濃度的氯化鈉、溶菌酶和蛋白酶等，使乳酸菌溶解。

加熱滅酶活：在85～95 ℃條件下保溫15 min，使溶菌酶和蛋白酶等失活。

離心分離，收集上清液：將乳酸菌在離心機(jī)中以4 500～5 000 r/min離心分離15～20 min。

冷凍干燥：上清液樣品放置冷凍干燥機(jī)物料盤(pán)內(nèi)，開(kāi)機(jī)設(shè)置溫度為-40 ℃，預(yù)凍樣品4 h。凍干條件為真空度10 Pa，冷阱溫度-55 ℃。上清液通過(guò)低溫冷凍干燥制得粉狀乳酸菌抽提物。

1.3.2 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

超聲功率對(duì)乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液（pH7），超聲破碎（0 ℃，工作時(shí)間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），超聲功率分別設(shè)置為90 W、190 W、285 W、380 W、475 W，測(cè)定乳酸菌自溶率。

NaCl添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（超聲功率285 W、工作時(shí)間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），分別添加2%、6%、10%、14%和18%（W/W）的NaCl，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，測(cè)定乳酸菌自溶率。

溶菌酶添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（超聲功率285 W、工作時(shí)間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），添加2%（W/W）的NaCl，分別添加1 000 U/g、3 000 U/g、5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g的溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，85～95 ℃加熱15 min滅酶，測(cè)定乳酸菌自溶率。

蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（超聲功率285 W、工作時(shí)間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），添加2%的NaCl，添加3 000 U/g溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h后，再分別加入5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g、11 000 U/g、13 000 U/g的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，分別在最適酶活的條件下自溶24 h，85～95 ℃加熱15 min滅酶活，測(cè)定乳酸菌自溶率。

復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（285 W、工作時(shí)間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），添加2%（W/W）的NaCl，添加3 000 U/g的溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h后，再分別加入2 000 U/g、6 000 U/g、10 000 U/g、14 000 U/g、18 000 U/g復(fù)合蛋白酶（胰蛋白酶∶中性蛋白酶=1∶1），45 ℃條件下自溶24 h，測(cè)定乳酸菌自溶率。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原則，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率（X1）、溶菌酶添加量（X2）、復(fù)合蛋白酶添加量（X3）為自變量，以乳酸菌自溶率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation process optimization of lactic acid bacteria extract

1.3.4 測(cè)定方法

乳酸菌自溶率：紫外分光光度計(jì)（OD600nm值）檢測(cè)乳酸菌細(xì)胞密度，計(jì)算乳酸菌自溶率[8]：

式中：R為乳酸菌自溶率；a為反應(yīng)前的OD600nm值；b為反應(yīng)后的OD600nm值。

pH：pH計(jì)測(cè)定；還原糖測(cè)定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[9]；總酸的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[10]的方法；抗氧化能力測(cè)定：使用DPPH自由基清除能力試劑盒；總酚含量測(cè)定：Folin-酚比色法[11]；總黃酮含量測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[12]的方法；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[13]的方法。

頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜分析：乳酸菌抽提物用生理鹽水配制10%的溶液，15 mL頂空瓶裝入待測(cè)樣品5 mL，置于45 ℃恒溫水浴中平衡10 min。然后將萃取頭插入頂空瓶中，萃取頭距樣品液面距離約5 mm。萃取30 min后將萃取頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，解吸3 min。色譜柱為HP-5極性毛細(xì)管柱；升溫程序：柱溫60 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；氫氣流速47.0 mL/min，分流比10∶1，氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度260 ℃，進(jìn)樣口溫度260 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度220 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲時(shí)間3 min，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～500 amu。

定性及定量方法：采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜庫(kù)檢索對(duì)比分析進(jìn)行定性，采用面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)乳酸菌自溶的影響

超聲波是最常見(jiàn)的用于細(xì)胞破碎的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，不同超聲功率對(duì)乳酸菌自溶的影響如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)超聲破碎功率為285 W，乳酸菌自溶率最高，達(dá)到42.3%。隨著超聲功率的增加，乳酸菌的自溶率沒(méi)有顯著提升。因此，選擇285 W作為后續(xù)超聲破碎處理?xiàng)l件。

圖1 超聲功率對(duì)乳酸菌自溶的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on autolysis of lactic acid bacteria

2.1.2 NaCl添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285 W超聲處理后，分別添加2%、6%、10%、14%和18%（W/W）NaCl，自溶處理24 h后，不同NaCl添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響如圖2所示。

圖2 NaCl添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響Fig.2 Effect of NaCl addition on autolysis of lactic acid bacteria

由圖2可知，NaCl添加量為14%時(shí)乳酸菌自溶率最高，達(dá)到了51.44%。NaCl添加量為2%時(shí)乳酸菌自溶率可以達(dá)到48.82%。說(shuō)明添加NaCl可以一定程度上促進(jìn)乳酸菌自溶，但是對(duì)乳酸菌自溶率的影響不顯著。在保證自溶率的同時(shí)，為了避免引入過(guò)多的鹽離子影響后續(xù)添加的酶活。因此，選擇NaCl添加量2%來(lái)促進(jìn)自溶。

2.1.3 溶菌酶添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285 W超聲和2%的NaCl處理后，分別添加1 000 U/g、3 000 U/g、5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g的溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，不同溶菌酶添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響如圖3所示。由圖3可知，溶菌酶添加量為5 000 U/g時(shí)，乳酸菌自溶效率最高，可達(dá)78.18%。溶菌酶添加量＞5 000 U/g，自溶率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)溶菌酶添加量為3 000 U/g時(shí)，乳酸菌自溶率達(dá)到77.17%，與溶菌酶添加量5 000 U/g差異不大，從產(chǎn)品成本方面考量，后續(xù)試驗(yàn)選擇溶菌酶添加量為3 000 U/g。

圖3 溶菌酶添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響Fig.3 Effect of lysozyme addition on autolysis of lactic acid bacteria

2.1.4 蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285W超聲和2%的NaCl處理后，添加3000 U/g溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，再分別加入5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g、11 000 U/g、13 000 U/g的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，分別在最適酶活的條件下自溶24 h。酸性蛋白酶，堿性蛋白酶，中性蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響如表2所示。

由表2可知，中性蛋白酶促乳酸菌自溶效果優(yōu)于酸性蛋白酶和堿性蛋白酶，中性蛋白酶添加量為5 000 U/g時(shí)，乳酸菌自溶率最高，可以達(dá)到81.77%。這可能是由于乳酸菌胞內(nèi)pH環(huán)境接近中性，中性蛋白酶在此環(huán)境下酶解作用更加充分。乳酸菌的胞內(nèi)蛋白可被胰蛋白酶水解成小分子肽及游離的氨基酸，其中包括多種呈味氨基酸。呈味肽是指從食物中提取或由氨基酸合成得到的對(duì)食品風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)的分子質(zhì)量低于3 000 Da的寡肽類，包括特征滋味肽和風(fēng)味前體肽。呈味肽能夠賦予酶解物一定的風(fēng)味。因此，為了增加乳酸菌抽提物的風(fēng)味成分和提高乳酸菌自溶率，接下來(lái)進(jìn)一步考察中性蛋白酶和胰蛋白酶等比例混合的復(fù)合蛋白酶對(duì)乳酸菌自溶的影響。

表2 蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響Table 2 Effect of protease addition on autolysis of lactic acid bacteria

2.1.5 復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285W超聲和2%的NaCl處理后，添加3000 U/g溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，再分別加入2 000 U/g（胰蛋白酶∶中性蛋白酶=1∶1）、6000U/g、10000U/g、14000U/g、18 000 U/g復(fù)合蛋白酶，45℃條件下自溶24 h，復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶率的影響如圖4所示。由圖4可知，復(fù)合蛋白酶添加量為6 000 U/g時(shí)，乳酸菌自溶效果最高，可達(dá)83.88%。復(fù)合蛋白酶添加量為2 000～18 000 U/g時(shí)，自溶率均能達(dá)到80%以上。復(fù)合蛋白酶最適添加量為6 000 U/g。

圖4 復(fù)合蛋白酶添加量對(duì)乳酸菌自溶的影響Fig.4 Effect of compound protease addition on autolysis of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，利用Design Expert軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，以超聲功率（X1）、溶菌酶添加量（X2）、復(fù)合蛋白酶添加量（X3）為自變量，以乳酸菌自溶率（Y）為因變量建立回歸方程：Y=81.30+0.850 0X1+0.861 3X2-1.06X3-0.595 0X1X2+0.510 0X1X3+1.49X2X3+2.11X12+2.67X22+3.46X32?；貧w模型方差分析見(jiàn)表4。

表3 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for preparation process optimization of lactic acid bacteria extract

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

從表3及圖5可知，一次項(xiàng)X3，交互項(xiàng)X2X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)乳酸菌自溶率影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)X1、X2對(duì)乳酸菌自溶率影響顯著（P＜0.05）。其中，失擬項(xiàng)P=0.109＞0.05，表明該方程可以預(yù)測(cè)最優(yōu)的乳酸菌自溶率。

圖5 各因素交互作用對(duì)乳酸菌自溶率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of interaction between each factor on autolysis of lactic acid bacteria

由響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可知，乳酸菌自溶的最佳理想條件為超聲功率474.997 W，溶菌酶添加量3 000.024 U/g，復(fù)合蛋白酶添加量2 000.036 U/g，在此條件下，乳酸菌自溶率的預(yù)測(cè)值為95.215%；根據(jù)實(shí)際操作的限制性，修正最佳工藝條件為超聲功率475 W，溶菌酶添加量3 000 U/g，復(fù)合蛋白酶添加量2 000 U/g，在此條件下，得到乳酸菌自溶率為94.68%，略低于預(yù)測(cè)值（95.215%），說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃侠?，該結(jié)果也合理可靠。

2.3 乳酸菌抽提物主要成分分析

2.3.1 營(yíng)養(yǎng)和功能指標(biāo)分析

由表5可知，乳酸菌抽提物pH為6.57。乳酸菌抽提物具有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還原糖含量為55.16 mg/g，蛋白質(zhì)含量為7 mg/g，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到3.85 mg/g，總酸含量為2 mg/g。乳酸菌抽提物還富含多種生物活性物質(zhì)，其中總酚含量1.40 mg/g，總黃酮含量0.15 mg/g，對(duì)DPPH自由基清除能力達(dá)到46.16%。基于此，乳酸菌抽提物兼具潛在的營(yíng)養(yǎng)性及功能性。

表5 乳酸菌抽提物營(yíng)養(yǎng)和功能指標(biāo)Table 5 Nutritional and functional indexes of lactic acid bacteria extract

2.3.2 揮發(fā)性成分分析

乳酸菌抽提物檢測(cè)到24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（表6），主要包括醇類、醛類、酮類、酯類、烯烴類和芳香環(huán)類化合物。苯乙醇、反-2-壬烯-1-醇、α-松油醇、4-十二醇、苯乙醛、月桂酸、吲哚呈現(xiàn)不同種類的花香[14-16]；葉醇呈現(xiàn)青香、綠葉香[17]；苯乙醛、α-丙基苯乙醇、己酸己酯、γ-松油烯、香橙烯、肉桂酸甲酯、3-羥基己酸乙酯、壬酸具有水果甜香味[18-20]；二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪等吡嗪類物質(zhì)呈現(xiàn)烘烤香氣，是一類對(duì)食品很重要的香氣成分[21-24]。其中月桂酸（十二酸）、2,4-二甲基苯甲醛含量最高，對(duì)乳酸菌抽提物主體風(fēng)味呈現(xiàn)起顯著作用，賦予乳酸菌抽提物芳香風(fēng)味。

表6 乳酸菌抽提物揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 6 Volatile flavor substances of lactic acid bacteria extract

續(xù)表

月桂酸和壬酸等中鏈脂肪酸具有抑菌和抗氧化等功能[25-27]。蒼術(shù)酮具有抑菌、保護(hù)肝臟、降血糖等作用[28]。α-松油醇具有抑菌作用。由此可見(jiàn)，乳酸菌抽提物具有增香調(diào)味的作用，同時(shí)兼具有保健功能[29]。

3 結(jié)論

本研究在超聲波、溶菌酶、蛋白酶單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)乳酸菌抽提物制備工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并采用多元線性回歸分析。得到乳酸菌抽提物制備最佳工藝參數(shù)：超聲功率475 W，NaCl添加量2%，溶菌酶添加量3 000 U/g，復(fù)合蛋白酶添加量2 000 U/g，在此條件下，乳酸菌的自溶率達(dá)到94.68%。乳酸菌抽提物具有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含有3.85 mg/g氨基酸態(tài)氮，7 mg/g蛋白質(zhì)，55.16 mg/g還原糖。乳酸菌抽提物還具有生理活性物質(zhì)，含有1.40 mg/g總酚，0.15mg/g總黃酮，對(duì)DPPH自由基清除能力可以達(dá)到46.16%。

乳酸菌抽提物揮發(fā)性風(fēng)味成分富含多種營(yíng)養(yǎng)和功能性物質(zhì)，芳香性成分以月桂酸、2,4-二甲基苯甲醛含量最高，形成了復(fù)雜的香氣。乳酸菌抽提物兼具有營(yíng)養(yǎng)、保健功能、調(diào)香等潛在用途。