利用微滴數(shù)字PCR進行BRAF V600E突變與PD-L1表達的相關性分析

段芳芳，樊金星，易麗君，徐紅艷，楊文萍，杜香平，李 紅

朗格漢斯細胞組織細胞增生癥(Langerhans cell histiocytosis, LCH)是一種罕見的血液系統(tǒng)腫瘤，以朗格漢斯細胞異?？寺⌒栽錾鸀樘卣?。兒童期發(fā)病率為4.1/100萬，嬰兒期發(fā)病率可高達15.3/100萬[1]。接受聯(lián)合化療方案的患者5年復發(fā)率高達30%～40%[2]，BRAF V600E突變引起的RAF/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路異常活化是致病的主要原因[3]，應用BRAF V600特異性抑制劑(維羅非尼和達拉非尼)進行靶向治療，對嬰兒期伴有重要器官損傷的患者收效甚微[4-6]。有研究顯示LCH微環(huán)境中也存在T細胞耗竭現(xiàn)象[7]，PD-1/PD-L1免疫檢查點是導致T細胞功能喪失的主要因素，從而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[8-11]。通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路，可以逆轉T細胞功能的耗竭[12]。本實驗重點分析ddPCR技術檢測LCH組織中BRAF V600E突變的效果，旨在探討兒童LCH組織中BRAF V600E突變與PD-L1表達的相關性，為聯(lián)合藥物應用靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2012年1月～2020年6月南昌大學附屬兒童醫(yī)院/江西省兒童醫(yī)院診治的100例LCH患兒，診斷及療效標準依照《兒科學》及《血液病診斷及療效標準》[13-14]。選取不超過3年且保存完好的石蠟組織切片34例。

1.2 主要試劑免疫組化抗體購自福州邁新生物公司。石蠟包埋切片提取DNA試劑盒購自QIAGEN公司(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，貨號56404)。檢測BRAF V600E突變試劑盒購自廈門艾德生物公司(貨號8.0120301X024A)。石蠟包埋切片提取RNA試劑盒購自OMEGA公司(EZNA FFPE RNA Kit，貨號R6954-01)。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，免疫組化染色采用EnVision兩步法，所用抗體包括CD1a、Langerin、S-100、CD20、CD68、CD3、Ki-67(均購自福州邁新公司)，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.2PCR 提取石蠟包埋切片DNA，使用qRT-PCR法定量BRAF V600E突變水平，提取切片組織RNA，并用微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法進行BRAF V600E絕對定量分析，所用引物和探針序列如下。BRAF-F：5′-TACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA-3′，BRAF-R：5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3′；探針：BRAF-V600E-wt 5′-VIC-CTAGCTACAGTGAAATC-NFQ-3′，BRAF-V600E-mt 5′-FAM-TAGCTACAGAGAAATC-NFQ-3′。

1.3.3PD-L1共表達分析 在34例LCH樣本中選取保存完好且適宜行PD-L1免疫組化染色分析的石蠟切片27例，使用Image J軟件進行光密度值(optical density, OD)分析PD-L1蛋白表達，PD-L1表達越多DAB著色越深，OD值就越大。為校正面積因素對OD值結果的誤差影響，本實驗均采用平均光密度(average optical density, AOD)值分析。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。一致性分析使用Kappa一致性檢驗和配對χ2檢驗，雙變量相關性檢驗采用Pearson檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征34例LCH患兒中男童18例，女童16例，男女比為1.12 ∶1，年齡28天～1歲者1例，1～3歲者7例，3～9歲者22例，大于9歲者8例，平均發(fā)病年齡5歲。單系統(tǒng)性LCH 19例，多系統(tǒng)性LCH 15例，多數(shù)患兒伴支氣管肺炎(表1)。

表1 34例LCH臨床特征及BRAF V600E突變檢測結果

2.2 病理檢查本組皮膚活檢標本8例，淋巴結活檢標本3例，骨組織活檢標本21例，頭部包塊活檢標本2例。所選標本免疫組化檢測結果示CD1a(圖1A)、Langerin(圖1B)、S-100(圖1C)陽性率為100%，Ki-67增殖指數(shù)為5%～40%。

ABC

2.3 PCR檢測qRT-PCR檢測顯示，34例LCH組織中76.47%(26/34)病例檢測出BRAF V600E突變(圖2A)；ddPCR檢測BRAF V600E突變率為82.35%(28/34)(圖2B、C)；兩種方法檢測結果一致率為94.12%(32/34)，且一致性高(Kappa=0.82，P<0.001)。本實驗中男童和女童BRAF V600E突變分別占83%和69%；在病變部位為骨骼受損的LCH患兒中，BRAF V600E突變占62.5%；在BRAF V600E陽性組中男女比為15 ∶11，皮膚損傷占26.9%，骨損傷占53.8%，其中股骨損傷占26.9%(左側股骨占15.4%，右側股骨占11.5%)(表1)。

圖2 qRT-PCR法與ddPCR法檢測BRAF V600E基因表達圖：A.qRT-PCR檢測LCH BRAF V600E陽性圖譜；B.ddPCR檢測LCH BRAF V600E陽性FAM通道圖譜；C.ddPCR檢測LCH BRAF V600E陽性VIC通道圖譜

2.4 BRAF V600E與PD-L1共表達的相關性分析27例PD-L1免疫組化平均AOD值為0.45～0.72；將PD-L1的表達量與ddPCR的BRAF V600E陽性微滴數(shù)進行聯(lián)合分析，結果顯示BRAF V600E陰性組中有2例PD-L1高表達，BRAF V600E陽性組中有21例PD-L1高表達，差異有顯著性(P<0.01)。隨著BRAF V600E陽性微滴數(shù)比例的增加，PD-L1表達呈上調趨勢，Pearson雙變量相關性檢測相關系數(shù)為0.44，兩者呈現(xiàn)一定的相關性且差異有顯著性(P<0.05，圖3)。

圖3 BRAF V600E與PD-L1共表達的相關性：A.BRAF V600E陽性微滴比值與PD-L1表達的相關性；B.BRAF V600E陰性和陽性表達組中PD-L1的表達

3 討論

34例LCH患兒多見于皮膚組織損害和骨損害；本實驗中BRAF V600E突變比例在男童和女童中分別為83%和69%；在病變部位為骨骼受損的LCH患兒中，BRAF V600E突變占62.5%；在BRAF V600E陽性組中男女比為15 ∶11，皮膚損傷占26.9%，骨損傷占53.8%，其中股骨損傷占26.9%(左側股骨占15.4%，右側股骨占11.5%)。BRAF V600E突變與病變部位皮膚、骨骼之間差異均無顯著性(P>0.05)；患兒性別與LCH損害病變部位皮膚、骨骼差異均無顯著性(P>0.05)。本實驗中BRAF V600E突變與LCH患者發(fā)病年齡、性別、病變部位無關，與文獻報道一致[15]，但LCH發(fā)病率低，本實驗選取樣本量少，后續(xù)還需收集更多病例進一步分析。據(jù)文獻報道25%～70%的LCH是BRAF V600E突變所引起[3, 16-18]，不排除其他基因突變導致LCH的可能，未來需要更多樣品的特異性篩查基因，完善LCH基因變異譜庫。

PD-L1表達水平受多種因素調控[19]，BRAF V600E與PD-L1表達的相關性存在爭議。有文獻報道兒童低級別惡性膠質瘤中BRAF V600E突變與PD-L1表達無相關性[20]，而在皮膚黑色素瘤[21]及結腸癌[22]中兩者呈正相關。兒童LCH中BRAF V600E與PD-L1表達的相關性尚未見文獻報道。本實驗證實LCH中BRAF V600E突變與PD-L1表達呈正相關。BRAF基因是MAPK通路的成員之一，臨床上單層次使用靶向藥物BRAF V600E抑制劑具有很多不確定性[7,23]，聯(lián)合應用免疫療法可能對減少副作用、提高治愈率、降低復發(fā)具有重要意義，未來尚需要大規(guī)模的臨床研究來證實。

攜帶BRAF V600E的LCH患者復發(fā)或低痊愈率的可能性約是未突變患者的2倍[24]，且BRAF V600E攜帶者具有更高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(central nervous system diseases, CND)患病風險[25]。BRAF V600E突變是預測LCH預后及CND是否受累的重要獨立分子標志物，是非常有價值的預測參數(shù)[3]。如何從組織或者外周血中快速有效且靈敏的檢出BRAF V600E突變非常關鍵，ddPCR是基于單分子PCR法來進行計數(shù)的核酸定量方法，靈敏度高于qRT-PCR技術[26-27]，ddPCR技術的出現(xiàn)為精準診斷提供了解決方案。本實驗結果顯示，ddPCR表現(xiàn)出更高的檢測靈敏度和可靠性，其中2例qRT-PCR檢測陰性的樣本均可用ddPCR檢測，顯示ddPCR相比傳統(tǒng)的qRT-PCR技術可提供更穩(wěn)定、更高靈敏度的微小殘留病灶檢測結果，后續(xù)我們將進一步探究ddPCR技術在兒童腫瘤微小殘留病灶監(jiān)控中的應用價值，協(xié)助臨床醫(yī)師更早地發(fā)現(xiàn)疾病的復發(fā)。