線粒體靶向抗氧化劑SS31對家兔卵巢組織冷凍效果的影響研究

范雪梅，何麗冰，曾琴，欒宗檜,，劉如月,，韓長利，曾玖芝，劉偉信,*

卵巢組織冷凍和移植是一種重要的生育力保存方式，但冷凍復蘇過程中伴隨著大量卵泡損傷及凋亡，限制了其臨床應用。研究發(fā)現(xiàn)線粒體靶向抗氧化劑SS31(D-Arg-2,6-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)是一種小分子可滲透細胞的肽家族，能夠靶向定位和聚集在活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的部位——線粒體內膜，含量可高達5 000倍，具有內在的抗氧化活性，能減少細胞凋亡，降低生理及病理條件下ROS水平[1-2]，對于保護線粒體功能、抗氧化應激以及預防和治療小鼠的缺血再灌注損傷有明顯作用[3-5]。除了抗氧化活性，SS31還具有改善線粒體呼吸和促進ATP合成的作用[6]。通過大量的離體器官研究和氧化應激相關疾病模型的研究證實SS31對細胞的保護作用顯著，能有效避免細胞因氧化應激反應凋亡[7]。目前尚不清楚其對卵巢組織冷凍復蘇效果的影響。本研究將不同濃度SS31添加于冷凍液和復蘇液中用于家兔卵巢組織冷凍保存，探討SS31對于卵巢組織冷凍是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

線粒體靶向抗氧化劑SS31，由上海強耀生物科技公司生產(chǎn)；PBS溶液由美國Gibco公司生產(chǎn)；TUNEL試劑盒由瑞士羅氏公司生產(chǎn)；胰蛋白酶K(proteinase K)由美國Merck Millipore公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物

自成都達碩實驗動物有限公司購買15只健康成熟雌性家兔，4～5月齡，體重1.8～2.2 kg。普通飼料飼養(yǎng)，自由攝水，光照周期12 h，動物房溫度24℃左右，飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.3 實驗模型制作及分組

切除家兔雙側卵巢，保留卵巢皮質部分，修剪成5×3×1 mm3大小的組織塊，將30個卵巢皮質片段，隨機分成6組(n=5)。FRESH組：新鮮卵巢皮質片段；CONTROL組：常規(guī)冷凍復蘇，卵巢冷凍保護液和復蘇液中無SS31；5 μM-SS31組、10 μM-SS31組、20 μM-SS31組、40 μM-SS31組：在卵巢冷凍保護液和復蘇液中分別加入5、10、20、40 μM SS31。

1.4 卵巢組織冷凍與復蘇

采用汪翔等[8]報道的玻璃化冷凍方法對卵巢皮質片段進行冷凍，一周后解凍卵巢組織。復蘇完成后，一部分經(jīng)固定、石蠟包埋、切片后用于HE染色和TUNEL檢測，一部分經(jīng)3%戊二醛固定制作電鏡標本。

1.5 卵巢組織HE檢測

卵巢組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，切片機3 μm連續(xù)切片，每間隔10張選取一張切片經(jīng)HE染色后，于光學顯微鏡下進行卵巢組織學檢測。隨機選擇1個視野(非壞死及出血、非特異性染色的邊緣區(qū))，觀察各組卵巢組織結構的改變、卵泡形態(tài)的變化。

1.6 卵泡凋亡檢測

每間隔10張選取一張卵巢組織切片行TUNEL檢測，觀察卵泡DNA損傷情況。光學顯微鏡下細胞核固縮深染、棕黃色或棕褐色的細胞核、背景呈紫藍色的為凋亡卵泡。隨機從每個標本中取出3張切片，在隨機選取的10個視野內對凋亡卵泡進行計數(shù)，計算凋亡百分比。TUNEL陽性率=TUNEL陽性細胞數(shù)(棕色信號)/總細胞數(shù)(藍色)×100%，即卵泡凋亡率=卵泡凋亡數(shù)/總卵泡數(shù)×100%。

1.7 卵巢組織電鏡檢測

組織經(jīng)固定、干燥、滲透與包埋、切片、染色等處理后制成電鏡樣本，用JEM-1400PLUS透射電鏡對銅網(wǎng)進行圖像采集，每張銅網(wǎng)于15 000、25 000倍下觀察超微結構。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 SS31對冷凍卵巢的組織學特性影響

FRESH組(圖1A)各級卵泡未見明顯異常，間質細胞、顆粒細胞排列規(guī)則、緊密。CONTROL組(圖1B)卵泡皺縮、塌陷，胞核固縮，卵母細胞形態(tài)不規(guī)則，顆粒細胞排列紊亂、稀疏，形態(tài)結構模糊，胞質部分溶解，透明帶不規(guī)則，放射冠排列紊亂。5 μM-SS31組、10 μM-SS31組、20 μM-SS31組、40 μM-SS31組中(圖1C～F)隨著添加SS31濃度的升高，冷凍卵巢組織形態(tài)結構越趨于新鮮卵巢組織，其中40 μM-SS31組卵泡結構相對規(guī)則完整，卵泡數(shù)目較多，與FRESH組結構最為相近。見圖1(彩插1)。

2.2 SS31對冷凍卵巢組織各級卵泡數(shù)量的影響

CONTROL組的原始卵泡、初級卵泡數(shù)目較FRESH組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 μM-SS31組、40 μM-SS31組中原始卵泡數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著SS31濃度增加，F(xiàn)RESH組與40 μM-SS31組中初級卵泡數(shù)量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組次級卵泡、竇狀卵泡數(shù)目的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見下頁圖2。

圖2 各組不同時期卵泡個數(shù)的比較

2.3 SS31對冷凍卵巢各級卵泡數(shù)量占比的影響

各組卵巢組織中的原始卵泡占比最高，初級卵泡間占比的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。各組原始卵泡占比、次級卵泡占比、竇狀卵泡占比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 各組卵巢組織中各級卵泡數(shù)量占比的比較

2.4 SS31對冷凍卵巢組織卵泡損傷率的影響

FRESH組卵泡損傷率最低(P<0.05)；隨著SS31濃度的增加，卵泡損傷率降低(P<0.05)。各組卵泡損傷率的比較見圖3。

圖3 各組損傷卵泡占比的比較

2.5 SS31對冷凍卵巢組織卵泡凋亡的影響

TUNEL測定各組卵巢組織中卵母細胞凋亡情況如下圖(圖4A～F，彩插1)。FRESH組卵泡凋亡率平均百分比最低，CONTROL組最高，隨著SS31濃度增加卵泡凋亡率平均百分比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 各組卵泡凋亡百分比的比較

2.6 SS31對冷凍卵巢組織超微結構的影響

FRESH組細胞形態(tài)正常，各細胞器結構完整清晰，可見豐富的細胞器，其余凍融組見不同程度的細胞器形態(tài)改變。CONTROL組中線粒體數(shù)量顯著減少，大量線粒體腫脹，甚至呈空泡狀。5 μM-SS31組、10 μM-SS31組、20 μM-SS31組、40 μM-SS31組中，隨著SS31濃度的增長，線粒體腫脹程度減輕，數(shù)量增多，見下頁圖6。

圖6 卵巢組織電鏡觀察

3 討論

卵巢組織冷凍常用的方法有慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍。迄今為止，全球通過卵巢組織冷凍和移植技術出生的嬰兒已超過200例[9]，其中大多數(shù)采用慢速程序化冷凍，通過移植玻璃化冷凍保存的人卵巢組織獲得的活產(chǎn)嬰兒不超過5個[10]。慢速程序化冷凍所需冷凍保護劑少，細胞毒性小，但所需設備昂貴，耗時長，步驟繁瑣，冷凍過程易產(chǎn)生冰晶造成細胞損傷，因此臨床應用受到限制。反之，玻璃化冷凍方法簡便易行，不需要昂貴的儀器設備，但冷凍過程應用高濃度的冷凍保護劑可能存在潛在的細胞毒性。因此何種方法更具優(yōu)勢仍有爭議，一些研究認為慢速程序化冷凍在保存原始卵泡方面更優(yōu)于玻璃化冷凍[11-12]。但更多的研究認為玻璃化冷凍和慢速程序化冷凍之間沒有顯著差異[13-15]，甚至玻璃化冷凍還更優(yōu)于慢速程序化冷凍[16]，能更好地保存卵泡形態(tài)[17-18]。

冷凍保存的卵巢組織在合適的時機經(jīng)解凍復蘇后移植回女性體內，凍融卵巢組織中存活的卵泡數(shù)量對移植后卵巢組織生殖內分泌功能的恢復具有重要影響。卵巢在冷凍復蘇過程中不可避免地面臨卵泡損傷、細胞凋亡，如何減少凍融后卵巢組織中卵泡的損傷，提高冷凍保存的有效率成為改進生育力保存技術的關鍵問題之一。研究認為卵泡凋亡的根本原因與線粒體氧化損傷和ROS水平升高有關[19]。當卵泡遭受缺血、缺氧、氧化應激時，線粒體釋放大量ROS，細胞通透性增加，大量凋亡因子釋放，卵泡細胞損傷凋亡[20]。線粒體靶向抗氧化劑SS31可以靶向定位和聚集于產(chǎn)生ROS的場所——線粒體內膜，減少線粒體ROS的產(chǎn)生，減少細胞凋亡[21]。與其他抗氧化劑不同，SS31可以不依賴膜轉運蛋白及受體自由滲透細胞，穿越線粒體膜，SS31攝取不受線粒體電位的驅動，甚至可以被去極化的線粒體攝取[22]。由于其抗氧化、抗凋亡特性，SS31在阿爾茨海默氏病[23]、帕金森氏病[24]、動脈粥樣硬化[25]、缺血再灌注損傷[26]、阻塞性腎病[27]等方面的研究均顯示具有積極作用。本實驗研究SS31對于卵巢組織冷凍復蘇的影響。

本試驗在卵巢組織冷凍復蘇液中分別添加5 μM SS31、10 μM SS31、20 μM SS31、40 μM SS31。在HE染色中觀察到，隨著添加SS31濃度的升高，卵巢組織學形態(tài)變化可見一定改善，當SS31濃度達40 μM時差異最顯著。與此同時，本試驗中各組卵巢組織中原始卵泡數(shù)量最多，占比最大，一方面可能與它本身數(shù)量龐大有關，另一方面由于原始卵泡體積小，代謝低，對于缺血缺氧的耐受力更強，更不易受冷凍復蘇的影響。各組中次級卵泡和竇卵泡數(shù)目的差異無統(tǒng)計學意義，這可能由于卵巢組織冷凍保存時，組織中不同類型的細胞對降溫和復蘇速率及冷凍保護劑的濃度有不同需求，從而導致影響程度不同。盡管對于次級卵泡和竇卵泡數(shù)量的影響并不顯著，但仍然反映了在目前的技術條件下，冷凍損傷難以避免。而如何避免冷凍損傷，目前還沒有最優(yōu)的玻璃化冷凍方案。下一步還需要通過反復建立卵巢組織冷凍的模型來進一步探討不同冷凍方案的效果。

TUNEL檢測中，新鮮卵巢組織雖未經(jīng)冷凍復蘇過程，但由于卵巢離體后的缺血缺氧和氧化應激損傷，也呈現(xiàn)一定程度的細胞凋亡。凍融卵巢組織隨著SS31濃度的增加，卵泡損傷率、卵泡凋亡率下降，差異具有統(tǒng)計學意義，說明SS31在卵巢組織冷凍復蘇過程中可能具有降低卵泡凋亡、提高卵泡存活率的作用。

不同發(fā)育階段的卵泡是由多個細胞器構成，包括線粒體、內質網(wǎng)、高爾基體等，這些細胞器具有不同功能，是細胞代謝和細胞活力的形態(tài)支柱。其中，線粒體作為一個重要的細胞器，其完整的形態(tài)是維持功能的前提。研究顯示，SS31可抑制線粒體膜通透性的改變和線粒體膜電位的降低，防止線粒體腫脹[28]。同時，SS31還可以快速干預老齡小鼠骨骼肌線粒體能量代謝狀態(tài)，增強線粒體功能[29]?；赟S31對其他器官和組織線粒體結構和功能的改善作用，在本試驗中，我們利用透射電鏡技術觀察組織超微結構發(fā)現(xiàn)，不含SS31的CONTROL組中線粒體數(shù)量顯著減少，大量線粒體腫脹，甚至呈空泡狀，隨著SS31濃度的增長，線粒體腫脹程度逐漸減輕，數(shù)量逐漸增多，當SS31濃度達40 μM時這種改善最為明顯。遺憾的是，在本實驗中，對于線粒體功能的改善情況未進行測定，需要后續(xù)實驗進一步驗證。

本實驗結果表明SS31可減輕凍融家兔卵巢組織中卵泡的損傷，對于玻璃化冷凍和復蘇過程具有一定的保護作用。但本研究還存在一定的局限性，例如SS31的濃度梯度設置較小，未探究到最佳干預濃度，我們將在下一步實驗中探究SS31的最佳干預濃度和其作用機制。