益氣活血方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜增殖、黏附、侵襲能力的影響

胡攀偉，李火明，解海博，陳靜，萬(wàn)怡婷，楊紅

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071；2.上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)醫(yī)院，上海 201611

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種雌激素依賴性子宮內(nèi)膜炎性疾病。其特征是位于子宮內(nèi)膜的功能性腺體、基質(zhì)、組織等移位到宮腔外，主要臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、異常子宮出血、不孕癥等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。EMs在婦科疾病中發(fā)病率較高，影響全球超過(guò)10%的婦女，目前認(rèn)為，經(jīng)血逆流可能是其發(fā)病原因，異位子宮內(nèi)膜通過(guò)黏附、侵襲、血管生成等作用種植于宮腔外。西醫(yī)治療EMs主要采用抗雌激素療法，但常誘發(fā)月經(jīng)不調(diào)、不孕、免疫系統(tǒng)紊亂等不良反應(yīng)。

根據(jù)其臨床表現(xiàn)，EMs可屬中醫(yī)學(xué)血瘀證范疇。益氣活血方是上海市名中醫(yī)齊聰教授防治EMs復(fù)發(fā)的經(jīng)驗(yàn)方，通過(guò)多年臨床觀察與總結(jié)，齊聰教授認(rèn)為，正氣不足、痰瘀互結(jié)是EMs復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。課題組前期研究表明，益氣活血方能治療EMs術(shù)后復(fù)發(fā)，同時(shí)明顯改善痛經(jīng)、神疲乏力、非經(jīng)期腹痛、月經(jīng)失調(diào)等癥狀。本研究通過(guò)觀察益氣活血方對(duì)EMs大鼠內(nèi)膜增殖、黏附、侵襲能力的影響，探討其可能的調(diào)控機(jī)制，為益氣活血方的深入研究提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)雌性SD未孕大鼠60只，6～7周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～24℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜節(jié)律12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

益氣活血方（黃芪18 g，黨參30 g，麩炒白術(shù)9 g，水蛭9 g，三棱15 g，莪術(shù)15 g，夏枯草18 g，牡蠣30 g，九香蟲12 g，川牛膝18 g，炙甘草6 g），免煎顆粒購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司。取適量免煎顆粒，加純水配制成濃度分別為0.63、1.25、2.5 g/mL藥液。孕三烯酮膠囊，北京紫竹藥業(yè)公司，2.5 mg/片，批號(hào)53190506。取1粒孕三烯酮膠囊內(nèi)容物，加50 mL純水溶解，配制成0.05 g/mL藥液。苯甲酸雌二醇注射液，四川金科藥業(yè)公司，批號(hào)20200402，1 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

氯仿，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)10006818；Trizol，美 國(guó)ThermoFisher公 司，貨 號(hào)15596026；Prime ScriptMaster Mix，日本Takara公司，貨號(hào)RR036A；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號(hào)Q131-02；上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2抗體、MMP9抗體、金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP1）抗體、Ki-67抗體、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體，英國(guó)Abcam，貨號(hào)分別為ab76319、ab76003、ab92536、ab216432、ab156956、ab92552。HMIAS-2000全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)，武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司；小型垂直電泳儀，美國(guó)Bio-Rad；ABI ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ThermoFisher公司；UV-2450紫外光度儀，日本Shimadzu；5424R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、孕三烯酮組和益氣活血方低、中、高劑量組，每組10只。參照文獻(xiàn)[7-8]造模并加以改進(jìn)，手術(shù)前2日肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg，對(duì)大鼠陰道涂片進(jìn)行觀察，選擇動(dòng)情周期大鼠進(jìn)行造模。2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部剪毛后碘伏消毒，無(wú)菌條件下于尿道口上方約1 cm處開(kāi)腹，切口約2 cm，進(jìn)入腹腔后找到左側(cè)子宮和卵巢，在距離卵巢1 cm處結(jié)扎子宮兩端，剪取中間約2 cm子宮組織，縱向剖開(kāi)，剝離子宮內(nèi)膜，將剝離的子宮內(nèi)膜縫合于腹膜壁層，術(shù)畢關(guān)腹。空白組僅剪取子宮組織，不進(jìn)行縫合。術(shù)后連續(xù)3 d皮下注射慶大霉素2000 U預(yù)防感染。造模后第3周再次剖腹檢查，見(jiàn)移植的子宮內(nèi)膜體積增大、呈透明結(jié)節(jié)狀或囊狀，內(nèi)有液體積聚，表面有結(jié)締組織覆蓋及血管形成，并與大網(wǎng)膜、腸管、腹壁廣泛黏連，取少許內(nèi)膜組織行病理檢測(cè)，鏡下可見(jiàn)子宮內(nèi)膜腺體或上皮、間質(zhì)細(xì)胞，提示EMs造模成功，同時(shí)測(cè)量并記錄異位病灶組織長(zhǎng)、寬、高。

2.2 干預(yù)及取材

造模成功后開(kāi)始給藥，根據(jù)成人與大鼠體表面積換算給藥量。益氣活血方低、中、高劑量組每日分別予0.63、1.25、2.5 g/mL益氣活血方藥液灌胃，給藥體積10 mL/kg；孕三烯酮組予孕三烯酮藥液0.26 mg/kg灌胃，每周2次，每次1 mL，其余時(shí)間點(diǎn)予生理鹽水10 mL/kg灌胃；空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)4周。

給藥結(jié)束后，皮下注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，開(kāi)腹，用眼科剪剪取異位子宮內(nèi)膜組織及空白組大鼠右側(cè)子宮內(nèi)膜，取部分內(nèi)膜組織立即放入10%中性福爾馬林中固定，剩余內(nèi)膜組織迅速放入液氮中速凍，置于-80℃冰箱保存。

2.3 異位子宮內(nèi)膜體積計(jì)算

根據(jù)測(cè)量的異位子宮內(nèi)膜組織長(zhǎng)、寬、高，計(jì)算大鼠干預(yù)前后異位病灶體積（0.5×長(zhǎng)×寬×高）。

2.4 免疫組化檢測(cè)

將固定于福爾馬林的子宮內(nèi)膜組織按常規(guī)方法石蠟包埋、切片（厚度6 μm），65℃烤片20 min，進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)操作，用10%山羊血清室溫封閉1 h，分別滴加Ki-67、PCNA一抗（均為1∶200），4℃孵育過(guò)夜，第2日孵育酶標(biāo)二抗，滴加DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，酒精脫水后中性樹(shù)膠封片。圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黑色顆粒，計(jì)算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)

取10 mg異位子宮內(nèi)膜組織加入RIPA裂解液，機(jī)械研磨后，4℃、14000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×loading buffer制備蛋白樣品，依次經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入E-cadherin、TIMP-1、MMP2、MMP9一 抗（均 為1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，滴加二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色液曝光，掃描圖像后用Image J 1.8.0計(jì)算各條帶光密度。

2.6 熒光定量PCR檢測(cè)

子宮內(nèi)膜組織樣本放于冰上滴加Trizol和氯仿，4℃、14000 r/min離心30 min，取上清液，加入異丙醇和無(wú)水乙醇后14000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用DEPC水溶解，配制反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR。采用2法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 益氣活血方對(duì)模型大鼠異位子宮內(nèi)膜體積的影響

干預(yù)前，各造模大鼠異位子宮內(nèi)膜體積較空白組顯著增加（＜0.01）；干預(yù)后，與空白組比較，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，益氣活血方高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積顯著減少（＜0.05）；與益氣活血方低劑量組比較，孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積顯著減少（＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜體積比較（±s，mm3）

4.2 益氣活血方對(duì)模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Ki-67和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響

Ki-67主要表達(dá)于腺上皮和腺體的細(xì)胞核及細(xì)胞間質(zhì)中，PCNA主要表達(dá)于正常子宮內(nèi)膜腺上皮及腺體胞漿中，胞核少量表達(dá)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Ki-67表達(dá)（免疫組化染色，×200）

圖2 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PCNA表達(dá)（免疫組化染色，×200）

與空白組比較，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，益氣活血方中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Ki-67增殖指數(shù)顯著降低（＜0.01），益氣活血方低、中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織PCNA增殖指數(shù)顯著降低（＜0.01）；與孕三烯酮組比較，益氣活血方低、中劑量組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著升高（＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)比較（±s，每組10只）

4.3 益氣活血方對(duì)模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織黏附、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，益氣活血方高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織E-cadherin和TIMP1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01），益氣活血方中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與孕三烯酮組比較，益氣活血方低、中、高劑量組E-cadherin和TIMP1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01），益氣活血方低劑量組MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖4、表3。

圖4 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織E-cadherin、MMP2、TIMP1、MMP9蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織E-cadherin、TIMP1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)比較（xˉ±s，每組10只）

4.4 益氣活血方對(duì)模型大鼠異位子宮內(nèi)膜組織黏附、侵襲相關(guān)基因表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織E-cadherin和TIMP1基因表達(dá)顯著降低（＜0.01），MMP2和MMP9基因表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，益氣活血方中、高劑量組和孕三烯酮組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織E-cadherin和TIMP1基因表達(dá)顯著升高（＜0.01），MMP2和MMP9基因表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與孕三烯酮組比較，益氣活血方低、中劑量組E-cadherin和TIMP1基因表達(dá)顯著降低（＜0.01），MMP2和MMP9基因表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織E-cadherin、TIMP1、MMP2、MMP9基因表達(dá)比較（±s，每組10只）

5 討論

EMs是一種慢性良性炎性疾病，但其具有類似腫瘤侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)性高的特點(diǎn)，治療以手術(shù)為主，但易復(fù)發(fā)，需長(zhǎng)期孕激素干預(yù)，且價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)多，不能長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)應(yīng)用，導(dǎo)致患者依從性低，臨床上迫切需要替代療法，改善患者生活質(zhì)量。

活血化瘀類中藥在改善EMs方面具有顯著效果，能夠發(fā)揮改善炎性內(nèi)環(huán)境、誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡、抑制血管生成等作用。益氣活血方以黨參、黃芪通陽(yáng)補(bǔ)氣為君；麩炒白術(shù)健脾，三棱、莪術(shù)、水蛭活血化瘀，共為臣；川牛膝引經(jīng)通脈，夏枯草、牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)，九香蟲理氣止痛，共為佐；炙甘草調(diào)和諸藥，為使；全方攻補(bǔ)兼施。本研究通過(guò)建立EMs大鼠模型，發(fā)現(xiàn)高劑量益氣活血方能明顯縮小異位子宮內(nèi)膜體積，提示益氣活血方能有效改善EMs。子宮內(nèi)膜異位增殖是引起EMs的病理基礎(chǔ)，Ki-67與PCNA是調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)升高提示細(xì)胞分裂增多，增殖活性升高。本研究模型組大鼠異位子宮內(nèi)膜組織Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著升高，表明細(xì)胞分裂旺盛，增殖進(jìn)程加快，而益氣活血方高劑量組與孕三烯酮組Ki-67和PCNA增殖指數(shù)顯著降低，提示益氣活血方能夠發(fā)揮與孕三烯酮激素相似的抑制異位內(nèi)膜增殖作用。E-cadherin是一種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，參與維持細(xì)胞形態(tài)，具有調(diào)節(jié)免疫、炎癥等作用。研究表明，E-cadherin在EMs中低表達(dá)，從而增加EMs基質(zhì)細(xì)胞黏附能力，誘發(fā)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖。對(duì)比模型組，益氣活血方高劑量組和孕三烯酮組E-cadherin基因和蛋白表達(dá)均顯著升高，提示益氣活血方能明顯降低異位子宮內(nèi)膜黏附、侵襲能力。TIMP1是MMPs的內(nèi)源性抑制劑，正常情況下TIMPs與MMPs處于動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解。在EMs模型中，MMP2與MMP9基因和蛋白呈高表達(dá)，TIMP1呈低表達(dá)，從而使基底膜破壞，細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解，異位內(nèi)膜得以侵襲和遷移。益氣活血方干預(yù)后，能明顯逆轉(zhuǎn)EMs下TIMP1和MMP2/9基因及蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而抑制異位病灶侵襲。另外，益氣活血方高劑量組在抑制異位內(nèi)膜形成、增殖、遷移中與孕三烯酮組作用相當(dāng)，提示益氣活血方有望替代激素防治EMs。

綜上所述，益氣活血方能通過(guò)抑制異位子宮內(nèi)膜增殖、侵襲、黏附，縮小異位病灶體積，改善大鼠EMs。今后本課題組將繼續(xù)深入探索益氣活血方調(diào)控細(xì)胞侵襲和黏附作用的具體機(jī)制，為益氣活血方治療EMs提供依據(jù)。