摩羅丹(濃縮丸)對慢性非萎縮性胃炎模型大鼠的影響

于澤玥 郝莉雨 陳紅映 李宗源 孫建輝 霍海如 李洪梅

(中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京，100700)

慢性非萎縮性胃炎(Chronic Non-Atrophic Gastritis，CNAG)是臨床常見胃部疾病，目前尚無特效療法[1]。CNAG是由各種因素聯(lián)合誘發(fā)的慢性胃黏膜炎性疾病，其中幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，Hp)超標是其主要誘因之一。CNAG患者胃黏膜層以淋巴細胞和漿細胞浸潤為主，其致病機制主要為防御因子和/或攻擊因子失衡[2]。如若不盡早介入治療，后期極有可能會出現(xiàn)胃穿孔、胃潰瘍、胃出血等癥狀，進而發(fā)展為萎縮性胃炎，甚至胃癌，危及生命。摩羅丹(濃縮丸)是由百合、茯苓、玄參、烏藥、麥冬、澤瀉、當歸、茵陳、白術(shù)、白芍、石斛、九節(jié)菖蒲、三七、川芎、地榆、蒲黃、延胡索、雞內(nèi)金等18味中藥飲片組成的中藥制劑，其中百合可以養(yǎng)津護胃，烏藥可以促進消化液分泌，雞內(nèi)金能提高胃液分泌量、酸度、促進胃排空和防止膽汁反流，三七可止血、減輕胃黏膜炎癥，當歸具有抑菌作用，白術(shù)和茯苓可提高機體免疫功能，茵陳可利膽，川芎、延胡索具有行氣止痛的作用[3-4]。多味藥合用，具有和胃健脾、理氣消脹、通絡止痛的功效。臨床上常將其用于治療各種胃部疾病，如慢性胃炎、萎縮性胃炎等。本項研究通過觀察摩羅丹對CNAG大鼠胃黏膜損傷的修復情況，和對血清胃動素、胃泌素的含量影響，以及胃液pH值、胃蛋白酶含量來評價摩羅丹對CNAG大鼠胃黏膜的保護及修復作用，闡明其相關藥理機制，為摩羅丹在CNAG方面的作用提供藥效學研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級SD大鼠，80只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)在中國中醫(yī)科學院屏障環(huán)境下，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，明暗交替12/12 h。實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2019-0003。本研究所涉及動物實驗通過中國中醫(yī)科學院中藥研究所動物福利倫理委員會審批(倫理審批號：2020B025)。

1.1.2 藥物 摩羅丹(濃縮丸)(邯鄲制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：S00518003)；枸櫞酸鉍鉀顆粒(麗珠集團麗珠制藥廠，生產(chǎn)批號：2003034)。

1.1.3 試劑與儀器 無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，生產(chǎn)批號：20181210)；氨水(北京化工廠，生產(chǎn)批號：20180808)；甲醛(天津市大茂化學試劑廠，生產(chǎn)批號：20171111);水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，生產(chǎn)批號：20130201)；去氧膽酸鈉[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，美國，生產(chǎn)批號：#SLCC4936]；胃泌素(Gastrin)ELISA Kit試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，生產(chǎn)批號：L200724640)；胃動素(Motilin)ELISA Kit試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，生產(chǎn)批號：L200724647)；0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號：1908263201)；電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，型號：Sartorius BSA323S-CW]；電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：PL203 METTLER TOLEDO]；pH計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：FE20]；酶標儀(伯騰儀器有限公司，美國，型號：Bio Tek Epoch)；自動脫水機(徠卡公司，德國，型號：TP1020)；石蠟包埋機(徠卡公司，德國，型號：EG1140H)；生物顯微鏡(徠卡公司，德國，型號：DM2500)；全自動輪轉(zhuǎn)式切片機(美康公司，德國，型號：HM355S)；自動染色機(徠卡公司，德國，型號：XL5010)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取健康SPF級80只SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機選取12只大鼠作為正常大鼠，其余大鼠制備CNAG模型[5]。除正常組外，造模大鼠空腹灌胃60%乙醇溶液，每周2次(周二、周五)，每日在非空腹狀態(tài)下灌胃20 mmol/L的去氧膽酸鈉溶液。第1～6周，以0.05%氨水作為大鼠飲用水，自由飲用；第7～12周，以0.1%氨水作為大鼠飲用水，自由飲用；且采用2 d足量喂食，1 d禁食(周一、周四)，連續(xù)造模12周；正常對照組動物不限食物，自由飲用純凈水。于第8周時，隨機從正常大鼠中取2只大鼠，從造模動物中取8只大鼠，雌雄各半，取胃，進行組織病理學檢查，待慢性胃炎模型復制成功后，再按體質(zhì)量隨機分為5組，即模型組、枸櫞酸鉍鉀顆粒組，摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量組，每組12只，雌雄各半，繼續(xù)造模12周

1.2.2 給藥方法 各組分別灌胃枸櫞酸鉍鉀顆粒(0.72 g/kg，臨床等效劑量的2倍)、摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量(1.00 g/kg、0.50 g/kg、0.25 g/kg，臨床等效劑量的0.5、1、2倍)，灌胃正常組與模型組等體積純凈水，1次/d，連續(xù)4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 一般生理狀況和體質(zhì)量 觀察大鼠一般生理狀況(精神、攝食量、毛發(fā)、行為)和體質(zhì)量變化，記錄大鼠給藥前與給藥后每周的體質(zhì)量。

1.2.3.2 標本采集 末次給藥后，各組大鼠禁食16 h，實驗當天所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，并結(jié)扎幽門下0.3 cm處，縫合腹腔。待5 h后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血，靜置2 h后，離心半徑16.7 cm，3 500 r/min,離心15 min，分離血清，于-80 ℃冰箱保存；剪開結(jié)扎處收集胃液，3 000 r/min,離心15 min，取上清液待測。

1.2.3.3 胃黏膜組織病理學檢查 取出胃，收集胃液后，沿胃大彎剪開，用冰生理鹽水沖洗，并迅速置于10%甲醛中固定24 h。24 h后取出流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片3.5 μm，蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、照相。光學顯微鏡下觀察大鼠胃的病理形態(tài)學改變，進行組間比較。

1.2.3.4 胃液pH和胃蛋白酶活性測定 取胃液上清液，用pH計測定其pH值。并按試劑盒說明書測定胃蛋白酶活性。

1.2.3.5 血清胃動素、胃泌素測定 取血清，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗說明書測定血清中胃動素、胃泌素的含量。

2 結(jié)果

2.1 摩羅丹對大鼠一般狀況和體質(zhì)量的影響 實驗過程中，正常組大鼠精神狀態(tài)良好，動作敏捷，攝食正常，被毛無明顯脫落。造模期間，與正常組比較，造模大鼠精神萎靡，懶食少動，蜷縮，攝食量減少，體質(zhì)量呈降低趨勢。給藥期間，與模型組動物比較，各給藥組動物精神狀態(tài)及活動狀態(tài)變好，攝食量增加，體質(zhì)量未見明顯差異。見圖1～2。

圖1 摩羅丹對雄性大鼠體質(zhì)量影響

圖2 摩羅丹對雌性大鼠體質(zhì)量影響

2.2 摩羅丹對胃組織病理形態(tài)學的影響 正常組大鼠胃黏膜未見有充血、水腫，淺層黏膜未見有脫落，黏膜下肌層未見有水腫，血管未見有充血，組織結(jié)構(gòu)正常。模型組可見胃黏膜大面積、階段性脫落，黏液滲出較多，脫落的黏膜內(nèi)有淋巴細胞、少量漿細胞滲出，并有嗜酸性細胞出現(xiàn)，黏膜炎癥細胞浸潤，黏膜下肌層充血、淤血，間質(zhì)充血水腫，組織明顯水腫。與模型組比較，枸櫞酸鉍鉀顆粒組、摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量組大鼠胃黏膜僅有少量脫落，炎癥細胞浸潤、間質(zhì)滲出和水腫、肌層充血和淤血，以及腺細胞嗜酸性變等病變癥狀均有不同程度的減輕。通過對病理學情況進行半定量統(tǒng)計，經(jīng)秩和檢驗，得出正常組、各給藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1，圖3。

表1 摩羅丹對CNAG組織形態(tài)學的影響方法

病理學判斷標準與分級標準：1)“-”：大鼠胃黏膜未見有水腫、滲出，黏膜未見有脫落，黏膜下肌層未見有水腫，血管內(nèi)未見有明顯充血，結(jié)構(gòu)正常；2)“+”：大鼠胃黏膜未見明顯水腫，有輕度充血、滲出，小片狀病變，有個別腺細胞輕度水腫，肌層有少量嗜酸性細胞滲出，未見有明顯組織水腫；3)“++”：大鼠胃黏膜有小面積水腫、充血，黏膜淺層有節(jié)段性脫落，有少部分腺細胞有水腫、嗜酸樣變，細胞個體較大，胞質(zhì)被染成粉色。肌層有少量炎癥、充血，組織輕度水腫；4)“+++”：大鼠胃黏膜淺層有脫落，黏膜間質(zhì)有充血、滲出性黏液及水腫；部分胃腺細胞腫大，胞質(zhì)粉染，黏膜層有淋巴細胞、漿細胞滲出，黏膜下肌層有大量嗜酸性細胞浸潤及少量漿細胞滲出，肌層組織有大面積水腫，血管內(nèi)淤血、充血較嚴重；5)“++++”：大鼠胃黏膜有大面積節(jié)段性脫落，淺層較重，黏液較多，脫落的黏膜內(nèi)有少量淋巴細胞、漿細胞滲出，并有少量嗜酸性細胞；胃黏膜間質(zhì)有水腫，黏膜上層有部分腺細胞腫大；黏膜下肌層有大面積充血、淤血，嗜酸性細胞浸潤，組織水腫。

2.3 摩羅丹對胃液pH和胃蛋白酶活性的影響 模型組大鼠較正常組大鼠胃蛋白酶含量有所下降，胃液pH值顯著降低(P<0.05)。各給藥組較模型組胃液pH值、胃蛋白酶含量有不同程度的升高。其中，摩羅丹(濃縮丸)高劑量組、枸櫞酸鉍鉀顆粒組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4～5。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織病理學結(jié)果(HE染色，×200)

圖4 各組胃液pH值

圖5 各組胃液胃蛋白酶含量

2.4 摩羅丹對血清胃動素、胃泌素含量的影響 模型組較正常組胃泌素含量上升，胃動素含量下降。各給藥組較模型組胃動素含量有不同程度的上升，胃泌素含量有不同程度的下降。其中，摩羅丹中劑量組、低劑量組胃動素表達水平與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖6～7。

圖6 各組胃泌素含量

圖7 各組胃動素含量

3 討論

中醫(yī)學將CNAG歸屬于“胃痛”“嘈雜”“胃痞”等病證范疇[6]。中成藥干預是我國CNAG治療的重要組成部分，一項發(fā)表于2017年的《慢性非萎縮性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見》中將香砂六君丸、三九胃泰顆粒等11種中成藥作為治療慢性萎縮性胃炎的推薦藥物[7]。目前，已有研究證明摩羅丹對萎縮性胃炎、慢性胃炎有顯著的治療效果[8-12]。摩羅丹能夠顯著降低萎縮性胃炎患者表皮生長因子及其受體的表達，以調(diào)節(jié)胃黏膜細胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)胃酸分泌，修復胃黏膜；摩羅丹與常規(guī)西藥合用(如莫法替丁、奧美拉唑等)治療萎縮性胃炎見效更快；摩羅丹與葉酸、維生素E聯(lián)用，可以治療萎縮性胃炎，甚至逆轉(zhuǎn)輕、中度胃上皮內(nèi)瘤病情的進展。且摩羅丹治療慢性胃炎的急性毒性和長期毒性實驗證明其安全有效，無不良反應[13]。截止到目前，在國家不良反應監(jiān)測中心未出現(xiàn)任何藥物不良反應報告。本實驗主要研究摩羅丹對CNAG的治療作用，為摩羅丹在非萎縮性胃炎方面的藥效學研究提供實驗依據(jù)。

CNAG的主要癥狀為胃黏膜損傷，在動物實驗中，CNAG模型大鼠常采用饑飽失常、低濃度氨水溶液與水楊酸鈉溶液或去氧膽酸鈉溶液聯(lián)合制備[14-16]。本實驗采用饑飽失常法聯(lián)合低濃度氨水溶液、去氧膽酸鈉溶液，使大鼠胃防御屏障與刺激因素失衡，模擬Hp感染狀態(tài)下高濃度的氨對胃黏膜的毒性損害，進而引起慢性或急性炎癥損傷，來制備CNAG鼠模型，且其表現(xiàn)與臨床癥狀相似。模型組胃黏膜病理檢查結(jié)果顯示胃黏膜大面積脫落，脫落的黏膜內(nèi)有淋巴細胞、少量漿細胞滲出，并有嗜酸性細胞出現(xiàn)，黏膜下肌層充血、淤血，組織水腫等，與正常組胃組織病理學結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示本實驗CNAG大鼠模型制備成功。

CNAG大鼠分別經(jīng)過摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低劑量治療后，病理結(jié)果顯示與模型組大鼠比較，各給藥組胃黏膜組織均有不同程度的改善和修復(P<0.01)，提示摩羅丹(濃縮丸)可以保護和修復CNAG的胃黏膜組織，摩羅丹(濃縮丸)高劑量、中劑量、低3個劑量組與2倍臨床等效劑量的陽性對照藥治療效果相當。此外，胃酸pH過低會引起空腹胃痛、損傷胃黏膜組織[17]。本實驗結(jié)果顯示摩羅丹(濃縮丸)可以通過恢復CNAG模型大鼠胃液pH值至正常水平來維持、保護胃黏膜組織。但此次給藥組相較于模型組胃液中胃蛋白酶的含量差異無統(tǒng)計學意義。

胃動素又名腦-腸肽激素，對胃腸運動與胃腸電活動都有較大影響。胃動素可刺激胃蛋白酶的分泌，使胃黏膜血流量增加，維持胃酸pH值正常水平，對胃組織不同區(qū)域的肌細胞有明顯的收縮作用[18-19]。故而胃動素釋放含量降低時，胃蠕動能力下降，胃酸pH值易失衡。胃泌素主要由胃竇部G細胞合成，其主要生物學功能包括：促進胃黏膜上皮細胞生長、增殖和分化，刺激胃酸分泌，促進胃黏膜修復等，但當其分泌過多時，會損傷胃黏膜組織[20]。本實驗中，模型組大鼠血清胃動素含量較正常組下降，枸櫞酸鉍鉀顆粒組、摩羅丹高劑量、中劑量、低劑量組大鼠胃動素含量有不同程度的上升，其中摩羅丹中劑量組和低劑量組較模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，這提示摩羅丹(濃縮丸)治療CNAG可能與調(diào)節(jié)胃動素的分泌有關。本次實驗中，各給藥組血清胃泌素含量與模型組比較，未見明顯差異。

綜上所述，摩羅丹(濃縮丸)能夠減輕CNAG大鼠的胃黏膜損傷，其作用機制可能與維持胃液pH值，調(diào)節(jié)胃動素的分泌的有關，表明摩羅丹(濃縮丸)對CNAG有較好的治療作用，并對胃黏膜有修復損傷和保護作用。