毫針針刺足三里對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠穴區(qū)電阻、溫度和能量代謝變化的影響*

張 婷，吳永強(qiáng)，王 鼎，陳 波，賴(lài) 清，司原成，莫曦雅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

毫針針刺是醫(yī)者借助毫針在人體特定部位施以一定的手法操作，以防治疾病的一種中醫(yī)臨床外治法，具有疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽(yáng)、扶正祛邪的作用?，F(xiàn)代研究認(rèn)為針刺療效受患者生理基礎(chǔ)、情志狀態(tài)、腧穴性質(zhì)、針刺手法、針具選擇等多方面的影響[1]，其中機(jī)能狀態(tài)是針刺療效發(fā)揮的基礎(chǔ)[2]。但目前對(duì)針刺機(jī)理的研究多集中于臨床治療，針刺對(duì)穴區(qū)局部激活作用的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究仍較為缺乏。因此，本研究選取電學(xué)特性、生物熱學(xué)特性和能量代謝3方面，探討佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)狀態(tài)下毫針針刺對(duì)穴區(qū)局部的影響，為毫針針刺的現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)機(jī)制提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(200±20)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。動(dòng)物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫(22±1)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，光照12 h明暗交替(明期8：00-20：00)，大鼠自由攝食進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠的各種處理遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 弗氏完全佐劑(SLBZ9884，美國(guó)Sigma-Aldrich)；水合氯醛(1113A20，北京雷根生物技術(shù)公司)；大鼠三磷酸腺苷(ATP)/二磷酸腺苷(ADP)ELISA試劑盒(ZK-R4622/ZK-R3711，深圳子科生物科技公司)。

電子天平(WT型，杭州萬(wàn)特衡器公司)；紅外體溫計(jì)(CK-T1503，深圳長(zhǎng)坤科技公司)；直流低電阻測(cè)試儀(YP2512，深圳永鵬儀器公司)；凍存管(607001，美國(guó)NEST)；液氮罐(YDS-20，青島海爾特種電器公司)；酶標(biāo)分析儀(Infinite F50，瑞士Tecan)；一次性無(wú)菌針灸針(0.30mm×25mm，190102/53，吳江云龍醫(yī)療器械公司)。

1.3 動(dòng)物分組與造模方法 將32只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組與AA組2個(gè)大組，每大組16只；各組再按窩別、體重、活躍度因素配對(duì)后隨機(jī)分為非針刺組與針刺組2個(gè)小組，每小組8只。AA模型采用CFA造模方法復(fù)制[3]：每只大鼠右足跖皮內(nèi)注射0.1 mL CFA以致炎。繼續(xù)飼養(yǎng)11 d后完成造模。

1.4 干預(yù)方法 各組大鼠稱(chēng)重后，于右側(cè)“足三里”穴周備皮，穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》附錄四，定位為：膝關(guān)節(jié)下外側(cè)，腓骨小頭下5 mm。各組大鼠稱(chēng)重備皮后分別用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，麻醉劑量(mL)=大鼠重量(g)×0.3 mL/100g。

針刺組麻醉后消毒右側(cè)“足三里”穴，毫針直刺5 mm，按(60±2)r/min的頻率均勻捻針，捻轉(zhuǎn)幅度為180°～360°，捻針5 min，留針10 min，然后再捻針5 min，以此類(lèi)推，共捻針3次，于第3次捻針完畢后出針，每天1次，共操作3 d。非針刺組麻醉后與針刺組做相同的抓取、固定，不施加其他處理。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 穴區(qū)溫度檢測(cè) 各組大鼠行末次刺激后俯臥位固定，用紅外體溫計(jì)溫度探頭置于穴區(qū)皮膚上3～5 cm處，每隔10 s記錄1次溫度值，記錄1 min，共記錄6次，取平均值為穴區(qū)溫度值。

1.5.2 穴區(qū)電阻檢測(cè) 溫度測(cè)量后，各組大鼠繼續(xù)俯臥位固定，以進(jìn)針點(diǎn)為中心，在直徑5mm范圍內(nèi)用75%酒精進(jìn)行涂擦，無(wú)關(guān)電極蘸生理鹽水后，固定在右側(cè)后肢足掌中，并將蘸少許生理鹽水溶液的探測(cè)電極分別置于被測(cè)穴位進(jìn)針點(diǎn)和其上下左右各1.5 mm 處共5個(gè)點(diǎn)觀測(cè)電阻，取平均值為穴區(qū)電阻值。

1.5.3 ELISA法檢測(cè)穴區(qū)ATP、ADP含量 于第3 d檢測(cè)完溫度、電阻后，將大鼠脫頸處死并立即取材。取材方法為：于大鼠右側(cè)后肢進(jìn)一步備皮、消毒，切開(kāi)皮膚后，以大鼠針刺點(diǎn)為圓心，直徑約5 mm、垂直深度約5 mm的區(qū)域內(nèi)取穴區(qū)皮下組織塊約200 mg。組織塊取下后用生理鹽水沖洗，置入凍存管后于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

ELISA法檢測(cè)組織塊ATP、ADP含量：組織勻漿后取上清液作為檢測(cè)標(biāo)本，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋為6個(gè)濃度梯度，稀釋后各孔加樣量都為50 μL，設(shè)空白孔及樣品孔。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外，并用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液洗滌，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置60 s后棄去，如此重復(fù)洗板5 次。顯色，加入底物A和B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度值，計(jì)算樣品含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 正常組大鼠正常飲食飲水，毛色光澤、大便正常。AA組大鼠與正常組相比，精神萎靡，活動(dòng)減少，毛發(fā)凌亂晦暗，糞便稀溏，有舔舐右后足行為。其造模后18 h，右足腫脹達(dá)高峰，持續(xù)約3 d后逐漸減輕，造模后8 d再度腫脹，11 d時(shí)右側(cè)足爪紅腫，右足趾部觸痛明顯，伴其余三足不同程度紅腫，耳廓血管充血，耳部、尾部可見(jiàn)炎性結(jié)節(jié)，提示造模成功。正常大鼠和AA大鼠針刺后，穴區(qū)進(jìn)針處均可見(jiàn)一暗紅色微小圓孔，余穴區(qū)局部無(wú)紅腫等改變。干預(yù)后，正常針刺組較正常非針刺組，大鼠一般情況無(wú)明顯變化。AA針刺組較AA非針刺組，大鼠活動(dòng)稍增加。

2.2 各組大鼠穴區(qū)電阻值比較 正常組、AA組針刺后，穴區(qū)電阻值均較各自的非針刺組降低(P<0.01)；但AA組穴區(qū)電阻降低幅度較正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 毫針針刺“足三里”對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠穴區(qū)電阻的影響

2.3 各組大鼠穴區(qū)溫度值比較 正常組、AA組針刺后，穴區(qū)溫度值均較各自的非針刺組降低(P<0.01)；且AA組穴區(qū)溫度降低幅度較正常組大(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 毫針針刺“足三里”對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠穴區(qū)溫度的影響

2.4 各組大鼠穴區(qū)ATP/ADP比值比較 正常針刺組較正常非針刺組，穴區(qū)ATP/ADP比值升高(P<0.01)；AA針刺組較正常針刺組，穴區(qū)ATP/ADP比值更低(P<0.05)；AA組較正常組，穴區(qū)ATP/ADP調(diào)節(jié)幅度偏小(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 毫針針刺“足三里”對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠穴區(qū)ATP/ADP的影響

3 討論

佐劑性關(guān)節(jié)炎以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征表現(xiàn)，屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，其主要病機(jī)是氣虛血瘀、脈絡(luò)瘀阻[4]。針刺具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]，能有效控制AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥?！鹅`樞》有云“著痹不去，久寒不已，卒取其三里為干”，《神灸經(jīng)綸》言“上中下三部痹痛，足三里”?！白闳铩毖ㄗ鳛樽汴?yáng)明胃經(jīng)的合穴、下合穴，對(duì)痹證有著良好的治療效果，同時(shí)是針刺治療AA疾病時(shí)選擇頻次最高的穴位[7]。

自“良導(dǎo)絡(luò)”理論提出后，大量學(xué)者對(duì)人體腧穴的電學(xué)特性開(kāi)展了研究工作，人體穴位存在電阻抗特性和伏安特性，呈現(xiàn)低電阻、高電位特征[8]，這與穴區(qū)組織一氧化氮與神經(jīng)一氧化氮合酶蛋白表達(dá)增高和去甲腎上腺素合成與釋放的改變相關(guān)[9]。針刺可以改變穴區(qū)局部表皮角質(zhì)層與結(jié)締組織形態(tài)，改變細(xì)胞內(nèi)液與細(xì)胞外液的電解質(zhì)梯度，從而引起穴位局部的導(dǎo)電性提升、電阻下降[10]。孫艷紅等[11]選取60例健康受試者的“足三里”和“上巨虛”穴分別行留針、補(bǔ)法、瀉法三種針刺手法，觀察到針刺操作后經(jīng)穴皮膚下電阻抗均降低。周丹等[12]運(yùn)用原絡(luò)配穴法和合募配穴法觀察手陽(yáng)明大腸經(jīng)腧穴針刺后的皮膚電阻，發(fā)現(xiàn)針刺后腧穴皮膚電阻值均較針刺前下降。本研究中，針刺正常組、AA組大鼠均可以降低腧穴的電阻值，AA組穴區(qū)電阻降低幅度較正常組無(wú)顯著差異，說(shuō)明AA狀態(tài)對(duì)毫針針刺的降電阻效應(yīng)無(wú)影響作用。

腧穴的熱敏特性以溫度為外在表現(xiàn)形式，針刺對(duì)穴區(qū)的溫度具有雙向調(diào)節(jié)作用。李璐等[13]通過(guò)比較健康者和腦出血患者“足三里”穴留針期間的穴區(qū)體表溫度，發(fā)現(xiàn)后者穴區(qū)升溫較前者幅度更低。紀(jì)青灼[14]利用醫(yī)用紅外熱像儀觀察針刺“沖陽(yáng)”穴對(duì)健康者皮膚溫度的影響，發(fā)現(xiàn)針刺即刻和針刺5 min時(shí)穴區(qū)溫度均較針刺前降低，而針刺5 min至出針前，穴位溫度持續(xù)上升，針刺15 min后穴區(qū)溫度較針刺前升高。蔣珞琦[15]對(duì)健康受試者“曲池”穴行不同針刺手法，證實(shí)了“燒山火”手法可使穴區(qū)皮溫升高，而“透天涼”手法使穴區(qū)皮溫降低。本研究中所采取的針刺方法對(duì)于大鼠“足三里”穴具有明顯降溫作用，AA組針刺后穴區(qū)溫度較非針刺狀態(tài)降低，且較正常組溫度調(diào)節(jié)幅度更大，說(shuō)明AA狀態(tài)對(duì)毫針針刺的降溫效應(yīng)有增效作用。

能量釋放、轉(zhuǎn)移、存儲(chǔ)和利用的過(guò)程被稱(chēng)作能量代謝，是細(xì)胞維持基礎(chǔ)生理活動(dòng)的基本特征。機(jī)體體內(nèi)各種能源物質(zhì)氧化所釋放的能量，一部分以高能磷酸鍵為載體貯存于ATP中[16]。1分子ATP和1分子AMP可以催化反應(yīng)生成2分子ADP[17]，ATP通過(guò)與ADP的相互轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了能量的儲(chǔ)存和釋放[18]。ATP/ADP比值反應(yīng)能量的代謝水平：ATP生成增多時(shí)，ATP/ADP比值升高；ATP水解增多時(shí)，ATP/ADP比值下降。針刺能促進(jìn)穴區(qū)局部A3受體拮抗劑、p38MAPK激酶、P-P50和P-P65的表達(dá)[19-20]，引起穴區(qū)局部能量代謝水平的提高。本研究中，針刺提高了正常組大鼠穴區(qū)ATP/ADP，AA組大鼠針刺降低了穴區(qū)ATP/ADP，AA狀態(tài)可明顯逆轉(zhuǎn)針刺對(duì)腧穴ATP/ADP的增調(diào)效應(yīng)。

綜上，毫針針刺能降低穴區(qū)局部的電阻與溫度，提高穴區(qū)局部能量代謝水平。AA狀態(tài)下毫針針刺激活腧穴的作用與正常機(jī)體狀態(tài)存在不同。AA狀態(tài)對(duì)毫針針刺的降電阻效應(yīng)無(wú)影響作用，對(duì)毫針針刺的降溫效應(yīng)有增幅作用，對(duì)毫針針刺的ATP/ADP增調(diào)效應(yīng)有逆轉(zhuǎn)作用。針刺對(duì)AA的治療作用除了通過(guò)增強(qiáng)腧穴電敏特性達(dá)到外，還可能主要通過(guò)降低穴區(qū)溫度和降低能量代謝實(shí)現(xiàn)。其它不同機(jī)能狀態(tài)下毫針針刺的局部效應(yīng)是否存在相同規(guī)律，有待于今后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。