2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺復(fù)合物殺菌效果的研究及中和劑選擇

羅文姬 許雅棋 樂曉光 傅 鵬 張麗蓉 鄧金花 宋金武

廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司，廣東韶關(guān)，512029

膜污染是反滲透膜在水處理應(yīng)用中的最大危害，不僅降低膜的運(yùn)行效率，縮短其使用壽命，還使得產(chǎn)水量降低，產(chǎn)水水質(zhì)不符合要求[1]。為此，膜系統(tǒng)運(yùn)行一段時(shí)間后，一般會(huì)進(jìn)行清洗消毒。目前常用的幾種殺菌劑有甲基異噻唑啉酮（MIT）、甲基氯異噻唑啉酮（CMIT）、2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺（DBNPA）、過氧化氫（H2O2）、過氧乙酸、含氯殺菌劑等。

DBNPA可有效殺滅引起植物枯萎的真菌[2]，是一種常見的廣譜殺菌劑，用于工業(yè)的防霉殺菌。因?yàn)樗姆茄趸再|(zhì)，殺菌時(shí)不容易損害膜元件，對(duì)精密度較高的膜元件非常友好[3]。DBNPA通常用來防止細(xì)菌和藻類在造紙、工業(yè)循環(huán)冷卻水、金屬加工用潤(rùn)滑油、紙漿、木材、涂料和膠合板中的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)可做黏泥控制劑，廣泛用于造紙廠紙漿和循環(huán)冷卻水系統(tǒng)。作為廣譜高效的殺菌劑，能迅速穿透微生物的細(xì)胞膜，并作用于一定的蛋白基團(tuán)，使細(xì)胞的正常氧化還原中止，從而引起細(xì)胞死亡。同時(shí)，它的分支還可以選擇性地溴化或氧化微生物的特殊酶代謝物，最終導(dǎo)致微生物死亡[4]。此外，DBNPA具有良好的剝離性能，使用時(shí)無泡沫，液體產(chǎn)品與水可任意比互溶，低毒[5-6]。

異噻唑啉酮類是一類廣譜高效殺菌防腐劑，對(duì)微生物生長(zhǎng)有很好抑制作用，可有效抑制細(xì)菌、霉菌及酵母菌的生長(zhǎng)[7]。尤其在皮革行業(yè)，其防霉效果比甲醛[8]優(yōu)。而甲基氯異噻唑啉酮（CMIT）和甲基異噻唑啉酮（MIT）以3∶1混合的凱松是常用的防腐殺菌劑[9]。但使用過多的CMIT、MIT會(huì)引起皮膚過敏，為此，可將其復(fù)配其他消毒劑，以降低使用濃度。

本研究以DBNPA為主要?dú)⒕煞謴?fù)合微量凱松作為復(fù)合殺菌劑，常規(guī)中和劑不能有效地中和該復(fù)合殺菌劑的作用，為此需要篩選出對(duì)本復(fù)合殺菌劑的有效中和劑，為殺菌效果評(píng)價(jià)提供有效的中和方法。實(shí)驗(yàn)探究根據(jù)主要?dú)⒕煞纸Y(jié)構(gòu)選擇不同中和劑組合，篩選有效的中和劑，探究不同作用時(shí)間和作用濃度的殺菌效果，并進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1.1 試劑材料

DBNPA（上海麥克林生化科技有限公司），CMIT/MIT（上海麥克林生化科技有限公司），D/E肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），甘氨酸（國(guó)藥集團(tuán)有限公司），硫代硫酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠），吐溫-80（廣州化學(xué)試劑廠），卵黃卵磷脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），磷酸二氫鉀（廣州化學(xué)試劑廠），磷酸氫二鈉（廣州化學(xué)試劑廠），牛血清白蛋白（上海源葉生物科技有限公司），氯化鈉（廣州化學(xué)試劑廠），鹽酸半胱氨酸鹽酸鹽（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），胰蛋白胨（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），純水。

超凈工作臺(tái)DL-CJ-2N，恒溫培養(yǎng)箱DNP-9277，分析天平AUT220，計(jì)時(shí)器。

1.1.2 中和劑的準(zhǔn)備

因?yàn)閺?fù)合膜殺菌劑主要消毒成分是DBNPA，其含有兩個(gè)溴基團(tuán)和一個(gè)次氮基作為端基，溴基團(tuán)是鹵素，參考二氧化氯、次氯酸鈉、聚維酮碘等含鹵素元素的消毒劑以及季銨鹽類消毒劑的中和劑，得到下面幾種中和劑組合。

（1）中和劑A：0.5%硫代硫酸鈉+0.2%卵黃卵磷脂+1%吐溫-80的PBS溶液。

（2）中和劑B：1%硫代硫酸鈉+0.5%卵黃卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐溫-80的PBS溶液。

（3）中和劑C：0.3%卵黃卵磷脂+3%吐溫-80+0.01%組氨酸+0.1%鹽酸半胱氨酸鹽酸鹽+0.85%氯化鈉的PBS溶液。

（4）中和劑D：1%硫代硫酸鈉+0.5%卵黃卵磷脂+1%吐溫-80的PBS溶液。

（5）中和劑E：0.5%硫代硫酸鈉+0.5%卵黃卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐溫-80的PBS溶液。

（6）中和劑F：0.5%卵黃卵磷脂+3%吐溫-80+0.05%組氨酸+0.3%鹽酸半胱氨酸鹽酸鹽+0.85%氯化鈉的PBS溶液。

1.1.3 中和產(chǎn)物配制

取消毒劑按1∶9分別與中和劑A-F混合，反應(yīng)10 min，得到中和產(chǎn)物A-F待用。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)指示菌

試驗(yàn)用金黃色葡萄球菌（ATCC 6538，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、大腸桿菌（ATCC 25922，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、白色念珠菌（ATCC 10231，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液配制

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版）2.1.1.2.3及2.1.1.9.3要求，取菌種第4～14代的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮菌落（18～24 h），配制菌懸液，使得最終細(xì)菌菌落數(shù)為1×108～5×108cfu/ml，真菌菌落數(shù)為1×107～5×107cfu/ml。

1.2.2 中和劑鑒定

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟

按照實(shí)驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量的試管和平皿并編號(hào)。配制125 mg/ml的DBNPA溶液。取2.0 ml菌懸液于試管中，加入2.0 ml有機(jī)干擾物質(zhì)，得到含有機(jī)干擾物的菌懸液。其余步驟參照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版）2.1.1.5.5進(jìn)行。

1.2.2.2 評(píng)價(jià)規(guī)定

按《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）2.1.1.5.7要求，中和劑合格需要滿足：

（1）第1組無實(shí)驗(yàn)菌，或僅有極少數(shù)實(shí)驗(yàn)菌落生長(zhǎng)。

（2）第2組有較第1組為多，但較第3、4、5（組）為少的實(shí)驗(yàn)菌菌落生長(zhǎng)。

（3）第3、4、5組有相似量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，懸液實(shí)驗(yàn)在1×107～5×107cfu/ml，其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過15%。第3、4、5組間菌落數(shù)誤差率計(jì)算見公式（1）。

（4）第6組無菌落生長(zhǎng)。

（5）連續(xù)3次試驗(yàn)取得合格。

1.2.3 懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)

使用無菌硬水配制1.25倍評(píng)價(jià)濃度（0.03‰、0.05‰、0.1‰）的殺菌劑0.038‰、0.063‰、0.125‰的DBNPA溶液。

取0.5 ml步驟1.2.1配制好的菌懸液加入無菌大試管中，再加入0.5 ml有機(jī)干擾物質(zhì)，震蕩搖勻。用無菌吸管吸取上述濃度消毒劑4.0 ml，震蕩均勻并立刻計(jì)時(shí)。作用時(shí)間分別為45 min、60 min、90 min、135 min。

待實(shí)驗(yàn)菌和消毒劑作用至規(guī)定時(shí)間后，分別吸取0.5 ml實(shí)驗(yàn)菌和消毒劑混合液，加入4.5 ml滅菌的中和劑中，混勻，作用10 min。

隨后，根據(jù)菌落生長(zhǎng)實(shí)際情況，進(jìn)行系列10倍稀釋后，分別吸取1.0 ml樣液，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種2個(gè)平皿。

同時(shí)用稀釋液代替消毒劑，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，作為陽性對(duì)照組。

所有實(shí)驗(yàn)樣本均在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組活菌濃度（cfu/ml）,并換算為對(duì)數(shù)值（N），然后按公式（2）計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值，精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

1.2.4 現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

選擇反滲透膜系統(tǒng)作為現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，根據(jù)反滲透膜清洗消毒步驟，對(duì)反滲透膜進(jìn)行堿洗和酸洗后。往反滲透膜系統(tǒng)添加一定濃度DBNPA，循環(huán)30 min。停機(jī)浸泡60 min，隨后排出消毒劑，用無菌水沖洗反滲透膜。取殺菌前后產(chǎn)水端水樣500 ml，經(jīng)過滅菌的濾膜過濾后，置于固體培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行37 ℃恒溫培養(yǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 中和劑鑒定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表1、表2），中和劑C、F的1、2、4組均不長(zhǎng)銅綠假單胞菌，即中和劑C、F不能有效中和DBNPA的殘留作用。而中和劑A、D、E的1、2組不長(zhǎng)菌，3、4、5組銅綠假單胞菌、白色念珠菌的菌落誤差均大于15%，即表明，中和劑A、D、E未能有效中和DBNPA的殘留作用。使用中和劑B結(jié)果表明，第1、2組沒有菌落生長(zhǎng)，3、4、5組菌的含量相近，誤差值滿足＜15%的要求。

表1 六種中和劑中和復(fù)方膜殺菌劑對(duì)銅綠假單胞菌的殘留作用

表2 六種中和劑中和復(fù)方膜殺菌劑對(duì)白色念珠菌的殘留作用

綜上所述，使用1%硫代硫酸鈉+0.5%卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐溫-80的PBS溶液可有效中和DBNPA對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的殘留作用。同時(shí)，中和劑對(duì)實(shí)驗(yàn)菌和培養(yǎng)基沒有不良影響，為此，本研究采用此中和劑。

2.2 懸液定量殺菌

從表3可知，作用時(shí)間為45 min時(shí)，0.03‰、0.05‰、0.1‰的復(fù)合膜殺菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的KL＜5.0，對(duì)白色念珠菌的KL＜4.0。當(dāng)作用時(shí)間調(diào)整為60 min時(shí)（表4），濃度為0.05‰以上的復(fù)合膜殺菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌3種菌KL＞4.0，對(duì)白色念珠菌KL＞3.0。當(dāng)作用時(shí)間增加至90 min時(shí)（表5），濃度為0.05‰以上的復(fù)合膜殺菌劑對(duì)3種細(xì)菌的KL＞5.0，對(duì)白色念珠菌KL＞4.0。當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)至135 min時(shí)（表6），3種濃度復(fù)合膜殺菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的KL＞5.0，對(duì)白色念珠菌的KL＞4.0。

表3 復(fù)合膜殺菌劑作用45 min殺菌效果

表4 復(fù)合膜殺菌劑作用60 min殺菌效果

表5 復(fù)合膜殺菌劑作用90 min殺菌效果

表6 復(fù)合膜殺菌劑作用135 min殺菌效果

2.3 現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)DBNPA的懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)，選擇濃度為0.05‰的DBNPA對(duì)膜進(jìn)行消毒，最終比較消毒前后產(chǎn)水的菌含量。結(jié)果顯示，消毒前，系統(tǒng)菌落對(duì)數(shù)為4.13消毒后，膜系統(tǒng)菌含量為0，即DBNPA對(duì)該水處理系統(tǒng)的自然菌落有明顯殺滅效果。

3 結(jié)論

通過作用基團(tuán)入手篩選，最終得到了可以有效抵消復(fù)合膜殺菌劑消毒作用的中和劑，1%硫代硫酸鈉+0.5%卵黃卵磷脂+1%甘氨酸+8%吐溫-80的PBS溶液。通過不同作用時(shí)間的懸液定量殺菌試驗(yàn)，比較不同濃度下殺菌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，作用時(shí)間為90 min時(shí)，復(fù)合膜殺菌劑濃度0.05‰以上，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的KL＞5.0，對(duì)白色念珠菌KL＞4.0。結(jié)合工藝流程，現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)合膜殺菌劑濃度0.05‰對(duì)水處理自然菌落有明顯殺滅效果。