TDI聯(lián)合血清miR-34a在CHD合并PAH患兒診斷中的應(yīng)用

徐姍姍， 曹仙英， 周 彬

1. 上饒市立醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科， 江西 上饒 334000； 2. 上饒市立醫(yī)院婦產(chǎn)科， 江西 上饒 334000

先天性心臟病(CHD)是新生兒中最常見(jiàn)的出生缺陷，可引起心力衰竭和肺動(dòng)脈高壓(PAH)，在我國(guó)具有較高的發(fā)病率[1,2]。如果不及時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療，只有30%～40%的患兒能存活10年以上[3]。CHD患者一旦發(fā)生PAH，將進(jìn)一步增加流向心臟的血流量，加重心臟負(fù)荷，可能導(dǎo)致心力衰竭或死亡。超聲心動(dòng)圖是診斷CHD的常見(jiàn)影像學(xué)檢查方法，傳統(tǒng)的射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率等心動(dòng)圖參數(shù)因無(wú)法反映患者的整體心室功能，因此臨床中存在誤診或漏診現(xiàn)象。組織多普勒成像(TDI)是從超聲心動(dòng)圖衍生的新技術(shù)，也稱組織多普勒超聲心動(dòng)圖，該技術(shù)主要通過(guò)檢測(cè)室壁運(yùn)動(dòng)速度和方向來(lái)判斷心功能[4,5]。Tei指數(shù)是一項(xiàng)評(píng)價(jià)心室整體收縮和舒張功能的時(shí)間指標(biāo)[6]，Z指數(shù)是一項(xiàng)評(píng)價(jià)心室整體功能的時(shí)間指標(biāo)，Z指數(shù)彌補(bǔ)了Tei指數(shù)在評(píng)價(jià)心室整體功能中的不足[7]，有文獻(xiàn)表明，TDI-Tei聯(lián)合TDI-Z對(duì)CHD患兒心室整體功能具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值[8]。miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNA，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[9]，miRNAs參與許多生物學(xué)過(guò)程和疾病，包括先天性心臟病[10]。循環(huán)miRNAs在各種病理過(guò)程中具有潛在的生物標(biāo)志物能力，包括心臟、心肌重構(gòu)、心肌梗死和心力衰竭[11]，萬(wàn)楠等[12]曾經(jīng)報(bào)道，外周血漿miR-324-5p診斷CHD的曲線下面積(AUC)為0.731，具有一定的診斷價(jià)值。microRNA-34a(miR-34a)是miRNAs的成員之一，屬于腫瘤抑制因子的miR-34家族(miR-34a、miR-34b、miR-34c)，其在心肌組織中具有一定的特異性[13]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-34a在冠心病、心肌缺血、高血壓、心力衰竭患者體內(nèi)異常表達(dá)[14]。本研究考察了TDI參數(shù)(TDI-Tei和TDI-Z)聯(lián)合血清miR-34a對(duì)CHD合并PAH患兒的診斷價(jià)值，旨在開(kāi)發(fā)出提高CHD患兒早期診斷PAH的有效方案，以便盡早實(shí)施有效治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為前瞻性研究。選擇2018年7月至2021年12月在我院確診的112例CHD患兒為研究對(duì)象，其中，男66例、女46例；年齡3～13歲，平均年齡(8.36±3.15)歲。根據(jù)是否發(fā)生PAH將患兒分為CHD組(71例)和CHD+PAH組(41例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：CHD組患兒均被診斷為CHD，CHD+PAH組患兒均被診斷為CHD合并PAH，PAH是指肺動(dòng)脈收縮壓>35 mmHg；患兒具有完整的臨床數(shù)據(jù)；患兒父母簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他惡性腫瘤、嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病、肝腎功能障礙或肺部疾病的患兒；臨床數(shù)據(jù)不完整的患兒。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1TDI-Tei和TDI-Z的測(cè)量

使用 GE vivid E90 超聲診斷儀，采用 M5Sc探 頭，進(jìn)行TDI檢查，探頭頻率為 1.4～ 4.6 MHz。所有患兒在安靜狀態(tài)下取仰臥位或左側(cè)臥位行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查，同步描記標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖。TDI模式的啟動(dòng)是在心尖標(biāo)準(zhǔn)四腔心切面下進(jìn)行的，取樣框置于三尖瓣與右室側(cè)壁環(huán)交界處，取樣容積為2～4 mm。啟動(dòng)脈沖TDI測(cè)量三尖瓣口血流頻譜A峰終止處至下一個(gè)心動(dòng)周期E峰開(kāi)始處的時(shí)間，心底短軸切面錄取右室射血時(shí)間。Tei指數(shù)是心室等容收縮時(shí)間與等容舒張時(shí)間之和與心室射血時(shí)間的比值[6]。Z指數(shù)是心室射血時(shí)間與舒張充盈時(shí)間之和與心電圖R-R間期的比值[7]。連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期取平均值計(jì)算TDI-Tei和TDI-Z。

1.2.2血清miR-34a的檢測(cè)

所有患兒在入院后第2天抽取空腹靜脈血5 mL，加入肝素抗凝，在4 ℃下1500×g離心5 min，取血清進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)血清miR-34a。在血清中加入TRIzol試劑提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA的純度和濃度。使用SYBR-Green Real-time PCR Master Mix嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后用PrimeScrip RT Master Mix Kit(TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：10 μL SYBR qPCR Mix，上下游引物各0.8 μL，cDNA產(chǎn)物2 μL，ROX參考染料0.4 μL，用無(wú)核糖核酸酶水配制成20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性35 s，94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s。所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：miR-34a：正向5′-GTCCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′和反向5′-GTGCGTGTTCGTGGAGTC-3′；U6：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

IBM SPSS Statistics 21.0用于統(tǒng)計(jì)分析。分類變量使用例數(shù)(n)進(jìn)行描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Shapiro-WilkW檢驗(yàn)連續(xù)變量數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用中位數(shù)和四分位間距進(jìn)行描述，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用帶有標(biāo)準(zhǔn)差的平均值進(jìn)行描述，組間比較采用t檢驗(yàn)。通過(guò)使用Spearman相關(guān)系數(shù)分析TDI-Tei、TDI-Z和miR-34a之間的相關(guān)性。受試者操作特征(ROC)曲線分析用于確定TDI-Tei、TDI-Z和miR-34a對(duì)CHD合并PAH的診斷價(jià)值。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHD組和CHD+PAH組患兒的臨床資料比較

表1顯示，兩組患者的年齡、性別、疾病類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 患兒的臨床資料

2.2 CHD組和CHD+PAH組患兒的TDI參數(shù)和血清miR-34a比較

表2顯示，CHD組的TDI-Tei顯著低于CHD+PAH組(P<0.001)。CHD組的TDI-Z顯著高于CHD+PAH組(P<0.001)。CHD組的血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量顯著低于CHD+PAH組(P<0.001)。

表2 兩組患兒的TDI參數(shù)和血清miR-34a水平

2.3 TDI-Tei、TDI-Z與血清miR-34a的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，TDI-Tei與TDI-Z呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.325，P<0.01)，TDI-Tei與血清miR-34a呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.260，P<0.01)，TDI-Z與血清miR-34a呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.386，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 TDI-Tei、TDI-Z與miR-34a的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4 TDI-Tei、TDI-Z和血清miR-34a診斷CHD合并PAH的價(jià)值

ROC曲線分析顯示，TDI-Tei、TDI-Z和血清miR-34a聯(lián)合診斷CHD合并PAH的AUC(0.923)和敏感性(87.80%)均高于各指標(biāo)單獨(dú)診斷，特異性為88.73%，僅低于miR-34a。見(jiàn)表3和圖2。

表3 TDI-Tei、TDI-Z和血清miR-34a診斷CHD合并PAH的ROC曲線分析結(jié)果

圖2 TDI-Tei、TDI-Z、血清miR-34a及三項(xiàng)聯(lián)合診斷CHD合并PAH的ROC曲線

3 討論

PAH是一種以肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈壓升高為主要特征的疾病，而CHD患者的心臟結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致PAH的發(fā)生。因此，CHD合并PAH是最常見(jiàn)的PAH類型之一。TDI是1989年首次描述的一種可重復(fù)使用的綜合超聲心動(dòng)圖技術(shù)，可以直接測(cè)量心肌和瓣膜環(huán)處的運(yùn)動(dòng)速度，對(duì)心肌運(yùn)動(dòng)進(jìn)行準(zhǔn)確和直接的定量評(píng)估[5,15]。在成人超聲心動(dòng)圖中，這項(xiàng)技術(shù)有助于在臨床前階段早期識(shí)別細(xì)微的心功能障礙，并可作為主要心臟疾病，如心力衰竭、急性心肌梗死和高血壓的預(yù)后工具[16]。例如，二尖瓣環(huán)血流速度峰值(PAV)、二尖瓣環(huán)與二尖瓣環(huán)舒張期血流速度之比(E/E′)和室內(nèi)不同步現(xiàn)象，已被證明可以預(yù)測(cè)死亡率和心血管事件[17]。因此，筆者認(rèn)為TDI可能是一種檢測(cè)CHD患兒心臟功能障礙的敏感工具。目前，許多學(xué)者評(píng)估了TDI在患兒心功能檢查中的應(yīng)用[8,15]。雖然傳統(tǒng)的超聲心動(dòng)圖技術(shù)是基于血流的，但TDI使用超聲波的頻移來(lái)計(jì)算心肌速度，其特點(diǎn)是速度較低、幅度較高[18]，具有更低的負(fù)荷依賴性。據(jù)報(bào)道，TDI-Tei和TDI-Z可反映心室整體功能[6,7]。在本研究中，CHD患兒的TDI-Tei顯著低于CHD合并PAH患兒，而TDI-Z顯著高于CHD合并PAH患兒。相關(guān)性分析顯示，TDI-Tei與TDI-Z顯著負(fù)相關(guān)。Grapsa等[19]報(bào)道，PAH患者的右室TDI-Tei明顯升高，并且與心臟損傷程度正相關(guān)。另外，Dyer等[20]報(bào)道，原發(fā)性PAH患兒的右室TDI-Tei與肺動(dòng)脈壓呈正相關(guān)，患兒治療后TDI-Tei明顯降低。陳圖敏等[8]報(bào)道，TDI-Z隨著左向右分流型CHD患兒的肺動(dòng)脈收縮壓增加而減低，且右心TDI-Tei與TDI-Z呈負(fù)相關(guān)，本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。

本研究考察了兩項(xiàng)TDI參數(shù)診斷CHD合并PAH的價(jià)值。結(jié)果表明，單獨(dú)診斷時(shí)，TDI-Tei診斷CHD合并PAH的敏感性低于TDI-Z，而特異性高于TDI-Z。分析其原因，可能是雖然與普通超聲心動(dòng)圖參數(shù)相比，TDI-Tei在評(píng)價(jià)心功能中的價(jià)值更高，但是，當(dāng)患者僅僅存在單純性舒張功能不全時(shí)，TDI-Tei可能與正常人無(wú)明顯差異[21]。而TDI-Z代表了整個(gè)心動(dòng)周期中血液進(jìn)出心室的百分比，只要舒張或收縮功能有一項(xiàng)發(fā)生障礙，則TDI-Z都會(huì)降低。這可能是診斷CHD合并PAH時(shí)，TDI-Tei敏感性低而TDI-Z特異性低的原因，因此TDI-Tei聯(lián)合TDI-Z可彌補(bǔ)TDI-Tei評(píng)價(jià)心室整體功能中的不足。此外，TDI-Tei和TDI-Z均是時(shí)間間期的比值，因此可以消除年齡和心率的影響[22]，可能在嬰幼兒中具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

由于早期CHD合并PAH沒(méi)有典型的臨床癥狀，因此，尋找一種特異的標(biāo)志物對(duì)其診斷和治療具有重要意義。有研究認(rèn)為，miRNAs在PAH的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，可參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的血管生成、增殖和凋亡[23]。本研究考察了血清miR-34a與PAH發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果顯示，CHD患兒的血清miR-34a相對(duì)表達(dá)量顯著低于CHD合并PAH患兒。此外，ROC曲線分析顯示，單獨(dú)診斷時(shí)，血清miR-34a診斷CHD合并PAH的AUC和特異性均高于TDI-Tei和TDI-Z，說(shuō)明血清miR-34a有望成為早期診斷CHD合并PAH的潛在生物標(biāo)志物。一項(xiàng)關(guān)于CHD小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究顯示，miR-34a通過(guò)下調(diào)Notch-1來(lái)增加CHD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[24]。Notch-1基因突變可導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣疾病，而主動(dòng)脈瓣鈣化是心臟病的第三大原因[25]，據(jù)報(bào)道，心內(nèi)膜中Notch信號(hào)通路的突變會(huì)導(dǎo)致先天性結(jié)構(gòu)畸形，這可能會(huì)導(dǎo)致成人和新生兒心臟疾病[26]。此外，Notch信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)心肌再生、保護(hù)缺血心肌、誘導(dǎo)血管生成、同時(shí)負(fù)向調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在心肌損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用[27]。此外，miR-34a的上調(diào)可加劇內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[28]，可誘導(dǎo)血管炎癥、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)血管鈣化[29,30]。因此，miR-34a可能通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、炎癥等機(jī)制來(lái)參與CHD合并PAH的進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，TDI-Tei與血清miR-34a呈正相關(guān)關(guān)系，TDI-Z與血清miR-34a呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步研究證實(shí)，TDI-Tei、TDI-Z、血清miR-34a聯(lián)合診斷CHD合并PAH患兒的AUC和敏感性高于單獨(dú)診斷，特異性僅低于miR-34a單獨(dú)診斷。因此，TDI聯(lián)合血清miR-34a在診斷CHD合并PAH患兒中具有較高的價(jià)值，該聯(lián)合診斷方法可有效降低臨床中的漏診和誤診情況，有望提高CHD患兒發(fā)生PAH的早期檢出率，值得臨床推廣。