孤獨癥譜系障礙患兒不同血清總25-羥維生素D水平與腸道菌群的差異性研究

羅 欣，龐 琨，陳建雄，王泓哲，徐新杰，李 兵，賈鑫淼，尤 欣

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 1風(fēng)濕免疫科 風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點實驗室 國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心

4醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，北京 100730

2溫州醫(yī)科大學(xué)基因組醫(yī)學(xué)研究院，浙江溫州 325000

3對外經(jīng)濟貿(mào)易大學(xué)信息學(xué)院，北京 100029

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)簡稱孤獨癥，是一組發(fā)病于兒童早期的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其主要特征為社交溝通障礙、興趣狹隘和重復(fù)刻板行為[1]。除神經(jīng)系統(tǒng)癥狀外，ASD患兒亦存在許多共患病，特別是便秘、腹痛等胃腸道癥狀高發(fā)，提示其存在胃腸道功能失調(diào)[2]，且有證據(jù)表明ASD患兒的胃腸道問題與神經(jīng)精神癥狀嚴重程度顯著相關(guān)[3]。雖然目前ASD的病因尚不明確，但腸道菌群在ASD發(fā)病中的作用近年來受到高度關(guān)注[4]。腸道微生態(tài)重建對ASD的核心癥狀和胃腸道癥狀均具有明顯改善作用，進一步支持腸道菌群紊亂可能是ASD的重要潛在發(fā)病機制之一[5]。

維生素D是人體內(nèi)重要的微量元素，除調(diào)節(jié)鈣磷代謝進而影響骨骼健康外，活性維生素D還可通過維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝和免疫系統(tǒng)的作用[6]，VDR不僅存在于多種免疫細胞[7]，亦在小腸和結(jié)腸中高表達[8]。腸道菌群通過調(diào)節(jié)維生素D的吸收和羥化，與維生素D相互影響，維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)[9]。

ASD患兒普遍存在維生素D缺乏情況，研究發(fā)現(xiàn)補充維生素D可改善ASD患兒的臨床癥狀[10]。為進一步研究維生素D缺乏對ASD患兒腸道菌群的影響，本研究將探討ASD患兒維生素D正常與缺乏狀態(tài)下的腸道菌群差異，以及血清總25-羥維生素D[total 25-hydroxyvitamin D，T-25(OH)D]水平與腸道菌群的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2019年10月至2022年2月于北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診就診的1～12歲ASD患兒臨床資料。納入標準：由經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)生采用美國精神病學(xué)會發(fā)布的精神疾病診斷統(tǒng)計手冊第五版(Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders-fifth edition，DSM-5)[11]ASD診斷標準，以及兒童孤獨癥評定量表(childhood autism rating scale，CARS)對患兒進行評估，明確診斷為ASD。排除標準：(1)同時診斷為其他神經(jīng)精神疾病或嚴重軀體性疾病；(2)糞便采樣前1個月內(nèi)使用各類抗生素及其他對腸道微生物有影響的藥物或干預(yù)措施；(3)血清T-25(OH)D檢測前近3個月內(nèi)補充維生素D治療；(4)血清T-25(OH)D檢測和糞便樣本采樣時間間隔超過14 d；(5)病史資料不完整或缺少宏基因組數(shù)據(jù)。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會審批(審批號：ZS-1393)，并豁免患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 ASD嚴重程度及共患病的評估

根據(jù)CARS評分將ASD患兒分為輕—中度(CARS 30～35分)和重度(CARS≥36分)，并由門診醫(yī)生評估患兒是否存在以下情況：(1)胃腸道癥狀：便秘、腹痛、噯氣、腹瀉和大便惡臭等，除外腸道感染、免疫異常、炎癥性腸病、腸易激綜合征、結(jié)腸疾病等；(2)挑食：僅吃某些種類食物，抗拒新種類食物；(3)興奮：很難保持靜止、集中注意力等；(4)過敏：過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、哮喘、特應(yīng)性皮炎等病史；(5)情緒問題：易激惹、攻擊行為、焦慮障礙等。

1.2.2 血清維生素D水平檢測及分組

通過靜脈穿刺將空腹血樣采集至含有促凝劑的試管中，樣品采集后送至北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科進行檢測。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血清T-25(OH)D水平[14]。根據(jù)血清T-25(OH)D水平將研究對象分為維生素D正常組[T-25(OH)D>30 μg/L]、不足組[20 μg/L≤T-25(OH)D≤30 μg/L]和缺乏組[T-25(OH)D<20 μg/L][12-13]。

1.2.3 糞便樣本宏基因組測序

留取患兒新鮮糞便樣本，立即置于干冰中保存，之后轉(zhuǎn)運凍存于-80 ℃冰箱，集中進行糞便宏基因組測序。

根據(jù)MO-BIO PowerSoil DNA提取試劑盒(Carlsbad，CA，U.S.)操作流程從糞便樣本中提取DNA。在50 μL 洗脫緩沖液中洗脫，采用凝膠電泳方法進行樣本質(zhì)檢和質(zhì)量級別的判定。所有DNA文庫的構(gòu)建均根據(jù)NEB Next Ultra DNA library prep kit (New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)試劑盒(根據(jù)DNA起始量大于100 ng的步驟進行)的實驗操作流程進行。每個樣本加上可識別標簽，并將等量的標簽文庫用于測序。所有提取出來的樣本DNA均置于-80 ℃冰箱保存以便進一步使用。

運用Agilent 2100 High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)驗證文庫質(zhì)量。采用ABI 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems，Waltham，MA，USA)對文庫進行定量分析。應(yīng)用Illumina Hiseq X Ten測序系統(tǒng)(Illumina，CA，U.S.)對制備好的文庫進行雙端PE×150 bp測序，并從原始數(shù)據(jù)中丟棄有測序接頭污染的序列及低質(zhì)量序列。采用的質(zhì)量等級為Sanger/phred33/Illumina 1.8+。

1.2.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

應(yīng)用Trim galore(版本0.6.2)[15]去除接頭和低質(zhì)量reads(質(zhì)量得分低于 Q30)。質(zhì)量控制后，采用Bowtie2(版本2.3.5.1)[16]與SAMtools(版本1.15.1)[17]和Bedtools(版本2.30.0)[18]識別和去除宿主人DNA序列(參考人hg38基因組)[19]，并將非宿主序列用于下游分析。

1.2.5 腸道菌群分析

采用MetaPhlAn(Metagenomic Phylogenetic Analysis) 3.0[20]進行腸道微生物群落組成分析，參數(shù)stat_q設(shè)置為0.1，其余使用默認參數(shù)。MetaPhlAn為一種計算工具，依賴于從約17 000個參考基因組(約13 500個細菌和古細菌、約3500個病毒和約110個真核基因組)中鑒定獨特的進化枝特異性標記基因，該計算工具以物種級分辨率提供每個微生物進化枝的相對豐度。過濾后的讀數(shù)被映射至所有參考基因組序列，以確定人類糞便樣本中存在的不同分類群及各分類群的豐度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

1.3.1 一般臨床資料

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和百分數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

α多樣性分析采用R軟件的vegan包計算物種豐度(Richness)和香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)并繪制箱線圖，通過Wilcoxon秩和檢驗比較組間差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。β多樣性分析采用Metaphlan 3.0軟件儲存庫中的UniFrac.R(metaphlan/utils/calculate_UniFrac.R)計算加權(quán)UniFrac距離，再采用主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)降維。采用vegan包中的adonis函數(shù)進行置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA)(置換999次)。R2越大說明該分組方案對差異的解釋度越高，P<0.05說明本次檢驗的可信度高。對超過50%樣本量且相對豐度>0.01%的分類群進行下游分析。線性判別分析效應(yīng)大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)[21]用于識別細菌分類群中的生物標志物(LDA score閾值設(shè)定>2)。物種豐度與血清T-25(OH)D水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，fdr<0.1(Benjamini-Hochberg法)說明兩檢驗變量具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

2019年10月至2022年2月于北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診就診的1～12歲ASD患兒共148例，其中血清T-25(OH)D檢測和糞便樣本采樣時間間隔超過14 d的患兒85例，3個月內(nèi)補充維生素D的患兒11例，病史資料不完整或缺少宏基因組數(shù)據(jù)的患兒6例，排除以上不符合納入標準的病例，最終納入ASD患兒共46例。按照血清T-25(OH)D水平將其分為3組，維生素D正常組、不足組、缺乏組患兒分別為15例、16例、15例。血清T-25(OH)D均值在維生素D正常組為(35.940±3.503)μg/L，維生素D不足組為(25.513±2.852)μg/L，維生素D缺乏組為(14.880±4.056)g/L。輕-中度ASD患兒14例(30.4%)，重度32例(69.6%)。3組患兒在性別、年齡、病情嚴重程度和共患病方面的詳細資料見表1。

表1 ASD患兒一般臨床資料

2.2 菌群多樣性分析

采用MetaPhlAn 3.0在46份糞便樣本中鑒定出516種細菌，屬于172個屬、70個科、38個目、23個綱和11個門。在α多樣性分析中，將維生素D正常組、不足組和缺乏組的物種豐度和香農(nóng)指數(shù)進行兩兩比較，差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1)。在β多樣性分析中，基于加權(quán)UniFrac距離的PCoA(圖2)，并采用PERMANOVA進行統(tǒng)計檢驗，發(fā)現(xiàn)3組間物種組成亦無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，詳見表2。

表2 孤獨癥譜系障礙患兒腸道菌群β多樣性分析

圖1 孤獨癥譜系障礙患兒腸道菌群物種豐度和香農(nóng)指數(shù)箱線圖

圖2 基于加權(quán)UniFrac距離的β多樣性分析PCoA：主坐標分析

ASD:孤獨癥譜系障礙；CARS：兒童孤獨癥評定量表

2.3 菌群差異性分析

將低豐度分類群過濾后進行下游分析，經(jīng)LEfSe

分析，發(fā)現(xiàn)除門水平外，在綱、目、科、屬、種水平共發(fā)現(xiàn)了差異性分類群19個，其中綱水平2個、目水平2個、科水平3個、屬水平6個、種水平6個(圖3)。在種水平上，維生素D缺乏組沃氏嗜膽菌(Bilophilawadsworthia)、Asaccharobactercelatus、Adlercreutziaequolifaciens、大腸埃希菌(Escherichiacoli)豐度顯著升高；而脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)、Hungatellahathewayi豐度顯著降低(圖4)。

圖3 孤獨癥譜系障礙患兒腸道菌群差異分類進化樹

圖4 孤獨癥譜系障礙患兒腸道菌群物種水平的線性判別分析

注：由內(nèi)至外輻射的圓點代表了菌群由界至種的分類水平，不同水平上的每個圓點代表了該水平上的一個分類群，每個圓點的大小與該分類群的相對豐度成正比，紅色圓點代表維生素D缺乏組中顯著升高的分類群，綠色圓點代表維生素D正常組中顯著升高的分類群，黃色圓點為無顯著差異的分類群

注：LDA Score閾值為2

2.4 菌種與維生素D相關(guān)性分析

將包括門、綱、目、科、屬、種在內(nèi)的197個分類群與血清T-25(OH)D水平進行Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis，r=0.42，fdr=0.073，P=0.004)與血清T-25(OH)D水平呈正相關(guān)；而沃氏嗜膽菌(Bilophilawadsworthia，r=-0.45，fdr=0.055，P=0.002)、Adlercreutziaequoli-faciens(r=-0.44，fdr=0.055，P=0.003)與血清T-25(OH)D水平呈負相關(guān)(圖5)。

圖5 血清總25-羥維生素D水平與物種相對豐度關(guān)系

3 討論

3.1 維生素D與腸道菌群的關(guān)系

維生素D對免疫系統(tǒng)影響廣泛，也與人體腸道菌群變化相關(guān)。繼往研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可從以下兩個方面影響腸道微環(huán)境：一是影響腸道黏膜上皮細胞的通透性，二是影響免疫細胞的分化和功能，進而影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。首先，活性維生素D[1，25-(OH)2D3]與VDR作用，通過claudin2和claudin12調(diào)節(jié)緊密連接蛋白ZO1、ZO2水平，有助于維持上皮屏障結(jié)構(gòu)的完整性[22]。其次，1，25-(OH)2D3可刺激多種細胞(包括單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和上皮細胞)產(chǎn)生抗菌肽，還可增強巨噬細胞的吞噬反應(yīng)。除此之外，1，25-(OH)2D3對適應(yīng)性免疫具有調(diào)節(jié)作用，可促進Treg細胞分化，還可抑制Th1和Th17細胞因子的產(chǎn)生、抑制B細胞增殖和分化[22-24]。因此，維生素D具有維持腸道屏障功能和免疫調(diào)節(jié)的作用。部分維生素D來源于食物，經(jīng)腸道吸收和羥化[25]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物通過成纖維細胞生長因子23調(diào)節(jié)維生素D代謝[26]。因此，維生素D與腸道菌群關(guān)系密切，二者相互影響。

3.2 ASD患兒臨床資料分析

本研究為回顧性分析，并非所有患者在采集糞便樣本時，同步采集血樣本檢測血清T-25(OH)D?？紤]腸道清洗期大約2周左右[27]，故從148例就診患兒中，排除了血、便采樣時間間隔超過14 d的患兒85例。本研究聚焦于ASD患兒不同基線T-25(OH)D水平下的菌群構(gòu)成，故排除了血樣本采集前3個月內(nèi)補充維生素D的患兒。

有研究表明，維生素D缺乏的ASD患兒癥狀更重，而補充維生素D可改善部分癥狀[28-29]。由于本研究納入的患兒中，重度ASD占大多數(shù)(69.6%)，且無補充維生素D相關(guān)病史，故未顯現(xiàn)這一結(jié)果。在共患病評估方面，由于共患病在ASD患兒中較常見，尚無法從癥狀出現(xiàn)比例上發(fā)現(xiàn)差異。在未來研究中，建議采用量化共患病嚴重程度的問卷對患兒進行評估，如采用兒科胃腸道癥狀問卷評估ASD患兒的胃腸道癥狀等[30-31]。

3.3 ASD患兒腸道菌群分析

α多樣性和β多樣性分析提示，維生素D正常組、不足組和缺乏組的ASD患兒腸道菌群組內(nèi)物種多樣性和組間物種構(gòu)成均無顯著差異。提示影響ASD患兒的腸道菌種豐度和組成結(jié)構(gòu)改變的因素更為復(fù)雜，而維生素D可能影響某些菌種的組成。

為尋找低維生素D水平的標記性物種，本研究僅對維生素D缺乏組與正常組進行LEfSe分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在維生素D缺乏組中，致病菌沃氏嗜膽菌的相對豐度顯著升高，且其所屬的進化分支嗜膽菌屬(Bilophila)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)的相對豐度亦顯著升高。δ-變形菌綱是一類硫酸鹽還原菌，參與碳硫循環(huán)[32]。ASD患兒的腸道脫硫菌科豐度顯著高于正常兒童[33-34]。有研究

指出，ASD患兒的脫硫弧菌科豐度與糞便中的丙酸(propanoic acid，PPA)呈正相關(guān)[35]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌能夠產(chǎn)生PPA，PPA可通過血腦屏障，調(diào)節(jié)多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)誘導(dǎo)ASD樣行為[36]。此外，脫硫弧菌科還可產(chǎn)生有毒的硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)，H2S可減少腸黏液層的二硫鍵，從而破壞黏液屏障，導(dǎo)致上皮細胞暴露于細菌和毒素，可能導(dǎo)致腸道炎癥[37]。更嚴重的是，沃氏嗜膽菌在無特定病原體的小鼠中可引起全身炎癥[38]，證實沃氏嗜膽菌等脫硫弧菌可促發(fā)炎癥反應(yīng)。

此外，維生素D缺乏組中Adlercreutziaequolifaciens和Asaccharobactercelatus顯著升高。有研究指出，Adlercreutziaequolifaciens與ASD患兒較差的社會行為之間存在關(guān)聯(lián)[39]。Adlercreutziaequolifaciens和Asaccharobactercelatus能夠產(chǎn)生植物激素雌馬酚，雌馬酚可能干擾正常的小膠質(zhì)細胞功能[39-40]，提示其對神經(jīng)系統(tǒng)存在潛在致病性。在體外實驗中，雌馬酚可誘導(dǎo)細胞內(nèi)游離鈣升高，進而使結(jié)腸癌細胞VDR表達增強[41]。但這兩種細菌豐度升高是否引起腸道內(nèi)雌馬酚升高，進而增強維生素D的作用，或雌馬酚通過“腸-腦軸”對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響均尚未可知。維生素D缺乏組的大腸埃希菌亦顯著升高，動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，維生素D缺乏易導(dǎo)致粘附侵襲性大腸桿菌誘導(dǎo)的腸上皮損傷[42]，提示維生素D缺乏情況下，大腸埃希菌的潛在致病性。

維生素D缺乏組中脆弱擬桿菌和Hungatellahathewayi顯著降低。脆弱擬桿菌具有調(diào)節(jié)腸道炎癥的作用[24]，作為一種益生菌在ASD患兒中顯著減少[43]，給母體免疫激活后代口服脆弱擬桿菌，可改善其ASD相關(guān)的胃腸道癥狀和/或行為異常[44]。既往研究發(fā)現(xiàn)，補充維生素D與腸道脆弱擬桿數(shù)量增加相關(guān)[45]，但其與維生素D是否具有協(xié)同抗炎作用，目前尚缺乏相關(guān)研究支持。Hungatellahathewayi為革蘭氏染色陽性、專性厭氧菌[46]，目前對其研究較少，益生或致病尚未可知[47-48]。

有趣的是，將所有水平菌群的相對豐度與血清T-25(OH)D水平進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，與血清T-25(OH)D水平存在相關(guān)性的均為LEfSe分析中的標記性物種。沃氏嗜膽菌和Adlercreutziaequolifaciens與血清T-25(OH)D水平呈負相關(guān)；而脆弱擬桿菌與血清T-25(OH)D水平呈正相關(guān)。在既往研究中，不能產(chǎn)生1，25(OH)2D3的基因敲除小鼠腸道脫硫弧菌科的數(shù)量較多[49]，補充維生素D可增加腸道脆弱擬桿數(shù)量[45]，與本研究結(jié)果一致。因此，推測血清維生素D水平可能影響這些菌群在腸道內(nèi)的定植。

4 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏的ASD患兒腸道沃氏嗜膽菌、Adlercreutziaequolifaciens、Asaccharobactercelatus、大腸埃希菌豐度顯著升高，而脆弱擬桿菌、Hungatellahathewayi豐度顯著降低，提示ASD伴維生素D缺乏狀態(tài)可能加重ASD患兒的腸道菌群紊亂。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果，血清T-25(OH)D水平降低可使?jié)撛诘挠泻ㄖ苍黾?、益生菌定植減少，提示補充維生素D可能改善ASD患兒的腸道菌群紊亂，并治療相關(guān)癥狀。但本研究樣本量較小，未來可擴大樣本量進一步驗證，并深入挖掘維生素D對ASD患兒腸道菌群功能的潛在影響。

作者貢獻：羅欣負責(zé)數(shù)據(jù)處理和論文撰寫；龐琨、陳建雄、王泓哲負責(zé)數(shù)據(jù)處理；徐新杰、李兵負責(zé)研究指導(dǎo)；賈鑫淼和尤欣負責(zé)研究設(shè)計、論文修訂與審核。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突