急性胰腺炎患者腸道微生態(tài)及其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性:一項(xiàng)前瞻性橫斷面研究

韓梓瑩，宋 鍇，范正陽，宋 曉，胡曉敏，吳 東,4

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 1消化內(nèi)科 2急診科 3醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心 4疑難重癥及罕見病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種常見的消化系統(tǒng)急癥，主要表現(xiàn)為持續(xù)性上腹部疼痛，伴惡心嘔吐癥狀，隨病情進(jìn)展可出現(xiàn)胰腺壞死并繼發(fā)全身癥狀。AP全球發(fā)病率約為34/10萬，近年來呈明顯增高趨勢[1]。重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是AP的加重期，病情危重、進(jìn)展迅速且并發(fā)癥多，常需轉(zhuǎn)入ICU治療，短期死亡率高達(dá)10%～25%[2]。AP發(fā)病機(jī)制涉及胰蛋白酶異常激活、鈣超載、線粒體功能受損、自噬受損等多方面因素，全身炎癥風(fēng)暴造成器官功能障礙是病情進(jìn)展的標(biāo)志[3-4]。近年來，腸道菌群與AP的關(guān)系引起了臨床高度重視。Yu等[5]針對AP患者腸道菌群組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相較健康人群，AP患者腸道菌群中腸球菌、大腸桿菌的比例明顯增加。多個納入不同病情AP患者的研究均發(fā)現(xiàn)，輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)、中度重癥急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis,MSAP)和SAP患者的腸道菌群構(gòu)成存在顯著差異[6-7]。研究認(rèn)為，腸道微生態(tài)變化可能參與了AP患者的腸屏障損傷，以致腸黏膜通透性增加和腸道菌群易位，進(jìn)而加重了AP病情[8-9]。但目前腸道菌群與AP的相關(guān)性分析仍較少，尤其缺乏病情嚴(yán)重程度及預(yù)后標(biāo)志物的相關(guān)研究。本研究基于腸道菌群 16S rRNA 基因測序及生物信息分析結(jié)果，探究AP患者腸道菌群變化及其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性研究。以2018年6月至2022年1月北京協(xié)和醫(yī)院住院的AP患者和健康志愿者為研究對象。其中AP診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]：(1)出現(xiàn)AP特征性腹痛和腹部壓痛；(2)血清淀粉酶/脂肪酶值超過正常上限3倍；(3)影像學(xué)資料符合AP特征性改變。滿足其中任意2條可診斷為AP。其中不伴器官衰竭者為MAP，伴一過性器官衰竭者(≤48 h)為MSAP，伴持續(xù)性器官衰竭者(>48 h)為SAP。AP組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)臨床檢查、血液學(xué)指標(biāo)及影像學(xué)結(jié)果，AP診斷明確；(2)均為首次發(fā)病且發(fā)病48 h內(nèi)入院治療；(3)同意進(jìn)行腸道菌群檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<16歲；(2)有慢性胰腺炎病史；(3)發(fā)病前2個月內(nèi)有抗生素、益生菌、中草藥等藥物服用史；(4)中途退出或自行離院者。

健康志愿者來自北京協(xié)和醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院招募人員，并根據(jù)性別比例與AP患者進(jìn)行匹配。健康志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自覺體健，無身體不適，體檢證實(shí)無代謝性、心腦血管和腸道等疾??；(2)年齡18～65歲；(3)非妊娠期/哺乳期女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期服用益生菌、抗生素、中藥等影響腸道功能藥物的治療者；(2)為減重或其他特殊目的而節(jié)食者。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會審批(審批號：JS1826)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集與標(biāo)本采集

收集健康志愿者和AP患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)以及AP病因、嚴(yán)重程度評分(入院24 h內(nèi))、并發(fā)癥、器官衰竭情況、住院時間、預(yù)后信息等臨床資料。通過直腸拭子留取新鮮糞便標(biāo)本。取樣前需禁食12 h，AP患者取樣距發(fā)病的時間(以腹痛發(fā)作為起始)不應(yīng)超過48 h。標(biāo)本采集前需以肥皂、清水和75%酒精充分清潔肛門周圍，使用無菌拭子插入肛門深處4～5 cm，輕輕旋轉(zhuǎn)以獲取糞便標(biāo)本，立即置于無菌管中[5]，-80 ℃冰箱保持。

1.2.2 DNA提取與16S rRNA 基因擴(kuò)增、測序

采用E.Z.N.A?Soil DNA Kit試劑盒(美國Omega公司)完成基因組DNA提取，并對細(xì)菌核糖體16S rRNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物：5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應(yīng)體系：FastPfu緩沖液4 μL，dNTP混合物2 μL，BSA 0.2 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，上下游引物各0.8 μL，基因組DNA 10 ng，加ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃初始變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用Illumina Miseq平臺進(jìn)行文庫構(gòu)建并進(jìn)行高通量測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

采用Fastp軟件對原始序列進(jìn)行質(zhì)控，采用FLASH軟件對序列進(jìn)行拼接。采用Uparse 7.0.1090對質(zhì)控合格的序列進(jìn)行分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行微生物分類學(xué)分析:(1)α多樣性(通過Mothur 1.30.2軟件完成)：以Chao指數(shù)評估菌群豐度，Shannon指數(shù)評估菌群多樣性；(2)β多樣性(采用R軟件的Vegan程序包完成)：采用主坐標(biāo)分析法(principal coordinates analysis,PCoA)評估菌群β多樣性；(3)差異菌群鑒別：以群落Bar圖(R軟件的Ggplot2程序包)、線性判別分析效應(yīng)大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)評估AP患者與健康志愿者的菌群組成差異(設(shè)置LDA評分>2為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；(4)差異菌群功能分析：對于存在差異的菌群，采用PICRUSt2與BugBase進(jìn)行功能預(yù)測，以評估該菌群的潛在作用；(5)AP患者與轉(zhuǎn)入ICU的AP患者(AP-ICU)識別：通過隨機(jī)森林算法篩選AP患者與健康志愿者之間腸道菌群差異的重要標(biāo)記，選取前3個重要標(biāo)記計(jì)算疾病概率(probability of disease,POD)指數(shù)。由于AP-ICU患者病情更重、并發(fā)癥更多、預(yù)后更差，早期識別并提前干預(yù)，有助于改善此類患者的臨床預(yù)后。進(jìn)一步計(jì)算AP-ICU與AP非ICU患者(AP-non-ICU)的POD指數(shù)，進(jìn)行亞組分析。采用受試者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線下面積(area under the curve,AUC)評估POD指數(shù)識別AP、AP-ICU患者的效果。

1.3 樣本量估算

由于目前文獻(xiàn)中缺乏AP患者平均OTU數(shù)量相關(guān)數(shù)據(jù)，暫無法進(jìn)行樣本量估算。根據(jù)研究目的，選取AP患者糞便中OTU值進(jìn)行效應(yīng)量計(jì)算以評估樣本是否滿足需求。本研究預(yù)計(jì)納入AP患者60例，健康人群20例。AP患者的OTU均值為186.05±61.20，健康人群為204.10±33.52。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，把握度 1-β=0.80，經(jīng)計(jì)算效應(yīng)量為44.8，即假設(shè)檢驗(yàn)可區(qū)分的OTU均數(shù)改變的最小差異為24%。參考既往文獻(xiàn)，認(rèn)為該效應(yīng)量符合要求[11]。效應(yīng)量分析由PASS 15.0軟件分析完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。年齡、住院時間、急性生理學(xué)及慢性健康狀況Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)等正態(tài)分布計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；序貫器官衰竭評分(sequential organ failure assessment，SOFA)不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。菌群相對豐度的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。性別、病因、并發(fā)癥等計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。采用Spearman法分析腸道菌群相對豐度與臨床特征的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共入選符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的AP患者60例、健康志愿者20名。AP患者中MAP、MSAP、SAP各20例；病因?yàn)槟懺葱?6例、脂源性29例、酒精源性5例；AP-ICU 22例；住院時間為(26.2±9.7)d；ICU住院時間為(9.3±5.4)d；院內(nèi)死亡1例。

AP患者年齡[(46.3±15.2)歲比(37.2±12.0)歲，P=0.017]、BMI[(26.6±3.3) kg/m2比(22.8±2.9)kg/m2，P<0.001]均高于健康志愿者，男性比例(51.7%比55.0%，P>0.999)與健康志愿者無顯著差異。

2.2 腸道菌群多樣性分析

α多樣性分析顯示，AP患者腸道菌群Shannon指數(shù)低于健康志愿者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Chao指數(shù)亦低于健康志愿者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示AP患者的腸道菌群豐富度降低(圖1A，1B)。β多樣性分析顯示，兩組腸道菌群在PCoA1、PCoA2之間分離，形成兩個不同的群落，提示兩組菌群結(jié)構(gòu)存在差異(圖1C)。

圖1 AP患者與健康志愿者腸道菌群多樣性比較

2.3 菌群組成及其差異

門水平上，厚壁菌門(d_Firmicutes)為AP患者和健康志愿者的主要組成菌門。相較健康志愿者，AP患者厚壁菌門的相對豐度明顯減少，擬桿菌門(d_Bacteroidetes)和變形菌門(d_Proteobacteria)的相對豐度明顯升高(圖2A)；科水平上，AP患者毛螺菌科(f_Lachnospiraceae)、雙歧桿菌科(f_Bifidobacteriaceae)的相對豐度明顯減少，腸球菌科(f_Enterococcaceae)、腸桿菌科(f_Enterobacteria-ceae)、擬桿菌科(f_Bacteroidaceae)的相對豐度明顯增加(圖2B)；屬水平上，AP患者大腸志賀菌屬(g_Escherichia-Shigella)與腸球菌屬(g_Enterococ-cus)的相對豐度明顯增加，布勞特氏菌屬(g_Blautia)與雙歧桿菌屬(g_Bifidobacterium)的相對豐度明顯降低(圖2C)；種水平上，AP患者大腸桿菌(Escherichia_coli)與耐久腸球菌(Enterococcus_dur-ans)的相對豐度顯著增加(圖2D)。

圖2 AP患者與健康志愿者群腸道菌群組成比較

LEfSe分析結(jié)果顯示，包括大腸志賀菌屬、腸球菌屬和腸球菌科在內(nèi)的多個菌群在AP患者中呈優(yōu)勢分布，布勞特氏菌屬和雙歧桿菌屬等菌群在健康志愿者中呈優(yōu)勢分布(圖3)。

圖3 LEfSe分析結(jié)果LEfSe：線性判別分析效應(yīng)大小；AP:同圖1

2.4 差異菌群功能分析

PICRUSt2功能分析顯示，相較健康志愿者，AP患者腸道菌群的賴氨酸、組氨酸、異亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸合成通路明顯受阻(圖4A)。BugBase表型預(yù)測顯示，AP患者腸道需氧菌與兼性厭氧菌相對豐度均顯著高于健康志愿者，菌群致病潛力、移動元件含量、氧化耐受能力亦明顯高于健康志愿者(P均<0.05)，提示AP患者腸道菌群可能具備更強(qiáng)的致病性與遷移能力(圖4B)。

圖4 AP患者與健康志愿者差異菌群功能預(yù)測

A.α多樣性Chao指數(shù)分析；B.α多樣性Shannon指數(shù)分析；C.β多樣性分析；AP:急性胰腺炎

A.門水平；B.科水平；C.屬水平；D.種水平；AP:同圖1

2.5 AP患者識別

經(jīng)隨機(jī)森林算法篩選后發(fā)現(xiàn)，納入3個差異菌群的重要標(biāo)記可達(dá)到最優(yōu)的模型分類效果。前3個重要標(biāo)記分別為真桿菌屬未培養(yǎng)株(uncultured_bacterium_g_Eubacterium_halli)、真桿菌屬未分類株(unclassified_g_Eubacterium_hallii)與大芬戈?duì)柕戮磁囵B(yǎng)株(uncultured_bacterium_g_Finegoldia)，基于該標(biāo)記計(jì)算POD指數(shù)。與健康志愿者比較，AP患者的POD指數(shù)均值顯著增加(P<0.001)。ROC曲線顯示，POD指數(shù)區(qū)分AP患者與健康志愿者的AUC為0.996 (95%CI:0.988～1.000)，提示糞便微生物標(biāo)志物POD指數(shù)對AP患者具有較高的識別能力(圖5)。

圖5 腸道菌群對AP患者的識別效果

2.6 腸道菌群與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

與AP-non-ICU患者比較，AP-ICU患者中SAP比例、SOFA評分、APACHE Ⅱ 評分、全身感染、局部并發(fā)癥與器官衰竭發(fā)生率均更高，住院時間更長(P均<0.05)，提示AP-ICU患者病情更嚴(yán)重(表1)。

表1 住院期間AP-ICU與AP-non-ICU患者臨床資料比較

2.6.1 AP-ICU與AP-non-ICU患者腸道菌群組成與功能比較

屬水平上，相較于AP-non-ICU患者，AP-ICU患者腸球菌屬的相對豐度顯著增加，擬桿菌屬的相對豐度明顯減少(圖6A)；種水平上，AP-ICU患者耐久腸球菌的相對豐度明顯增加，多氏擬桿菌(Bacteroides_dorei)的相對豐度明顯減少(圖6B)。

PICRUSt2功能分析顯示，相較于AP-non-ICU患者，AP-ICU患者腸道菌群的萬古霉素耐藥相關(guān)通路、多個糖代謝相關(guān)通路的功能均明顯增強(qiáng)(圖6C)。

圖6 AP-ICU與AP-non-ICU患者腸道菌群組成及功能比較

2.6.2 AP-ICU患者識別

隨機(jī)森林算法篩選的前3個重要標(biāo)記分別為耐久腸球菌、厭氧球菌屬未培養(yǎng)株(uncultured_organism_g_Anaerococcus)與厚壁菌門未分類株(unclassified_p_Firmicutes)。基于此標(biāo)記，進(jìn)一步計(jì)算POD指數(shù)。與AP-non-ICU患者比較，AP-ICU患者POD指數(shù)均值顯著增加(P=0.0019)。ROC曲線分析顯示，POD指數(shù)區(qū)分AP-ICU與AP-non-ICU的AUC為0.743(95% CI:0.605～0.880)，提示糞便微生物標(biāo)志物亦可識別轉(zhuǎn)入ICU的AP患者(圖7)。

圖7 腸道菌群對轉(zhuǎn)入AP-ICU患者的識別效果

通過對比發(fā)現(xiàn)，AP患者與健康志愿者、AP-ICU患者與AP-non-ICU患者存在共同的差異菌群，即腸球菌屬、耐久腸球菌，此兩個指標(biāo)的相對豐度在健康志愿者、AP-non-ICU患者、AP-ICU患者中呈逐漸升高的趨勢(圖8A、8B)。臨床特征相關(guān)性分析提示，耐久腸球菌與AP患者局部并發(fā)癥、器官衰竭、全身感染、住院時間、ICU住院時間等均呈正相關(guān)，尤其與全身感染發(fā)生率的相關(guān)性最強(qiáng)(圖8C)。

圖8 差異菌群水平變化及其與臨床特征的相關(guān)性分析

AP-ICU：轉(zhuǎn)入ICU的AP患者；AP-non-ICU：未轉(zhuǎn)入ICU的AP患者；BMI：體質(zhì)量指數(shù)；MAP:輕癥AP；MSAP：中度重癥AP；SAP：重癥AP；SOFA：序貫器官衰竭評分；APACHE Ⅱ：急性生理學(xué)及慢性健康狀況Ⅱ；AP:同圖1

A.PICRUSt2功能分析；B.BugBase表型預(yù)測

M00016：賴氨酸合成(琥珀酸-二氨基庚二酸通路)；M00026：組氨酸合成通路；M00527：賴氨酸合成(二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶通路)；M00570：異亮氨酸合成通路；M00019：纈氨酸、異亮氨酸合成通路；M00855：糖原降解通路；M00845：精氨酸合成通路；M00432：亮氨酸合成通路；M00532：光呼吸作用；M00010：檸檬酸循環(huán)(2-羥戊二酸合成通路)；M00535：異亮氨酸合成通路；M00116：半醌合成通路；M00025：酪氨酸合成通路;AP:同圖1

A.疾病概率指數(shù)均值比較；B.疾病概率指數(shù)識別AP患者的受試者操作特征曲線圖;AP:同圖1

A.屬水平；B.種水平；C.PICRUSt2功能分析；AP:同圖1；AP-ICU、AP-non-ICU：同表1

M00165：還原磷酸戊糖循環(huán)通路(卡爾文循環(huán))；M00017：甲硫氨酸生物合成通路：M00126：四氫葉酸生物合成通路；M00144：NADH-醌氧化還原酶通路；M00167：磷酸戊糖還原循環(huán)通路；M00854：糖原合成通路；M00345：甲醛同化(核酮糖單磷酸途徑)；M00549：核苷酸糖生物合成通路；M00844：精氨酸合成通路；M00344：甲醛同化(木酮糖單磷酸通路)：M00554：核苷酸糖生物合成通路；M00168：景天酸代謝通路；M00652：萬古霉素耐藥相關(guān)通路

A.疾病概率指數(shù)均值比較；B.疾病概率指數(shù)識別AP-ICU患者的受試者操作特征曲線圖;AP:同圖1；AP-ICU、AP-non-ICU：同表1

A.腸球菌屬在不同人群中的變化；B.耐久腸球菌在不同人群中的變化；C.差異菌群與臨床特征的相關(guān)性分析結(jié)果(紅色為正相關(guān)，藍(lán)色為負(fù)相關(guān));AP-ICU、AP-non-ICU、APACHE Ⅱ、SOFA：同表1

3 討論

本研究對健康志愿者與AP患者糞便標(biāo)本中腸道菌群16S rRNA 進(jìn)行了基因測序與生物信息學(xué)分析，以探究腸道菌群與AP的相關(guān)性。結(jié)果顯示，相較于健康志愿者，AP患者腸道菌群多樣性降低，菌群豐度亦存在不同，主要表現(xiàn)為大腸志賀菌屬、腸球菌屬和腸球菌科等多個菌群的相對豐度增多，布勞特氏菌屬與雙歧桿菌屬等菌群的相對豐度降低；且其多種氨基酸合成通路受阻，菌群致病性增高。在對AP-ICU與AP-non-ICU患者的亞組分析中得到了類似結(jié)果，二者的菌群組成亦存在明顯差異，且AP-ICU患者腸道菌群對抗生素耐藥、糖代謝相關(guān)通路的功能增強(qiáng)。基于差異菌群計(jì)算的POD指數(shù)，區(qū)分AP患者與健康志愿者的AUC為0.996，區(qū)分AP-ICU與AP-non-ICU患者的AUC為0.743，提示腸道菌群有望作為早期識別AP、病情較重AP的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物，輔助臨床決策。

3.1 AP患者腸道菌群變化

本研究菌群多樣性分析顯示，AP患者腸道菌群多樣性明顯降低，提示AP患者腸道菌群呈特異性改變。既往研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上人類腸道菌群的主要組成成分為厚壁菌門和擬桿菌門，其次為放線菌門和變形菌門[12]。本研究健康志愿者腸道菌群分布符合上述特點(diǎn)，但AP患者擬桿菌門與變形菌門的比例明顯增加?？扑缴希珹P患者毛螺菌科、雙歧桿菌科的占比明顯減少，腸球菌科、腸桿菌科、擬桿菌科的占比明顯增加，提示AP患者腸道菌群構(gòu)成紊亂。屬水平與種水平上，大腸志賀菌與腸球菌為AP患者的優(yōu)勢菌群，而布勞特氏菌與雙歧桿菌則為健康志愿者的優(yōu)勢菌群，與在AP小鼠模型中的檢測結(jié)果一致[6-7,13-15]。大腸志賀菌屬和腸球菌屬被認(rèn)為是AP的潛在致病菌，與器官衰竭、膿毒癥等并發(fā)癥相關(guān)[7]。大腸志賀菌屬參與腸上皮侵襲、菌群與內(nèi)毒素移位等感染相關(guān)通路的調(diào)節(jié)[7]。腸球菌屬是腸道條件致病菌，亦被證實(shí)與尿路、腸道感染有關(guān)。Mei等[16]研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性給予SAP小鼠寡糖可改善腸道菌群失調(diào)，減輕病情嚴(yán)重程度，其作用機(jī)制與給藥后大腸志賀菌屬和腸球菌屬得到清除有關(guān)。基于體外培養(yǎng)與分子技術(shù)，在半數(shù)以上AP患者的胰液引流液和外周血中鑒定出包括大腸志賀菌屬與腸球菌屬在內(nèi)的多種易位菌群，提示腸道菌群可通過破壞腸屏障功能加重AP病情[17-19]。

布勞特氏菌屬、雙歧桿菌屬具有益生菌的特性，其中布勞特氏菌屬可逆轉(zhuǎn)抗生素耐藥，在炎癥性腸病、結(jié)直腸癌、腸易激綜合征、糖尿病等多種炎癥和代謝性疾病中其豐度顯著減少[20-21]。Zhu等[7]比較了不同病情AP患者的腸道菌群組成差異，發(fā)現(xiàn)SAP患者的布勞特氏菌屬豐度顯著低于MAP和MSAP患者。作為益生菌制劑的主要成分之一，雙岐桿菌屬有助于維持正常的腸黏膜屏障，對炎癥性腸病、肝硬化、幽門螺桿菌感染、抗生素相關(guān)腹瀉等疾病具有緩解作用[13,22]。丁酸鹽是雙岐桿菌的分泌物，被證實(shí)可逆轉(zhuǎn)高脂飲食造成的小鼠菌群紊亂，減輕SAP相關(guān)器官損害[23-25]。此外，炎癥因子在AP病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[26]。腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等多種炎癥因子含量與腸球菌屬水平呈正相關(guān)，與雙岐桿菌屬水平呈負(fù)相關(guān)，提示大腸志賀菌屬、腸球菌屬增多以及布勞特氏菌屬、雙岐桿菌屬減少可能參與AP發(fā)病的調(diào)控[7,13-14]。

3.2 差異菌群功能預(yù)測

既往研究發(fā)現(xiàn)，AP患者血液與骨骼肌中多種氨基酸及總體氨基酸水平均明顯降低，尤其合并膿毒癥與多器官衰竭的AP患者此現(xiàn)象更為明顯[27-28]。動態(tài)監(jiān)測后發(fā)現(xiàn)，AP發(fā)病初期賴氨酸、組氨酸、酪氨酸呈先升高后降低的趨勢，而異亮氨酸、亮氨酸水平則存在先降低后升高的趨勢，總體而言AP發(fā)病期多種氨基酸水平低于康復(fù)期[29]。慢性胰腺炎患者中，賴氨酸、酪氨酸、組氨酸等多種氨基酸亦出現(xiàn)明顯減少的現(xiàn)象[30]。AP患者體內(nèi)氨基酸水平變化除了與發(fā)病后禁食導(dǎo)致的攝入不足相關(guān)外，亦與腸內(nèi)菌群變化導(dǎo)致炎癥消耗增多以及腸黏膜破壞導(dǎo)致吸收不良相關(guān)[30]。

本研究在菌群組成比較結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過PICRUSt2與BugBase對差異菌群的功能進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示AP患者腸道菌群的賴氨酸、組氨酸、異亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸合成通路明顯受阻。適當(dāng)補(bǔ)充腸內(nèi)營養(yǎng)可降低SAP患者死亡率，預(yù)防并發(fā)癥發(fā)生[31]。賴氨酸可減輕炎癥反應(yīng)，對藥物誘導(dǎo)的AP具有保護(hù)作用[32]。額外補(bǔ)充賴氨酸可降低AP小鼠血淀粉酶水平，改善組織學(xué)評分[33]。需注意的是，攝入過量氨基酸亦可能加重AP[34]，如大量補(bǔ)充精氨酸、組氨酸可誘發(fā)AP，精氨酸注射被應(yīng)用于AP動物模型誘導(dǎo)[34-36]。因此，氨基酸水平與AP的關(guān)系仍需深入研究。

3.3 ICU患者亞組分析

本研究結(jié)果顯示，與AP-non-ICU患者比較，AP-ICU患者擬桿菌屬的相對豐度明顯減少，進(jìn)一步在種水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)AP-ICU患者擬桿菌屬中的多氏擬桿菌顯著下降。既往多項(xiàng)研究認(rèn)為，AP患者腸道菌群中擬桿菌屬水平更高，且其水平與多種炎癥因子呈正相關(guān)[6,13-14]。本研究AP患者的擬桿菌屬水平亦高于健康志愿者，其在AP-ICU患者中降低的原因尚不清楚。在差異菌群功能性分析中，AP-ICU患者腸道菌群的萬古霉素耐藥通路功能增強(qiáng)?？股啬退幙稍黾又委熾y度，影響患者預(yù)后[37]，亦提示腸道菌群與AP關(guān)系密切。

本研究AP-ICU患者腸球菌屬，尤其耐久腸球菌豐度顯著高于AP-non-ICU患者，與AP患者高于健康志愿者的結(jié)果一致。腸球菌屬、耐久腸球菌在健康志愿者、AP-non-ICU患者、AP-ICU患者中呈逐漸增加趨勢，且耐久腸球菌與AP患者局部并發(fā)癥、全身感染、器官衰竭、住院時間均具有相關(guān)性，提示腸球菌屬不僅參與AP發(fā)病，亦可能是AP病情加重的驅(qū)動因子之一。

3.4 AP患者與AP-ICU患者識別

本研究基于差異菌群計(jì)算的POD指數(shù)識別AP患者、AP-ICU患者的AUC分別為0.996、0.743。提示腸道菌群不僅識別AP的能力極高，對重癥AP患者亦具有良好的識別能力。腸道菌群有望作為早期識別AP、病情較重AP的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物，輔助臨床決策。此外，作為預(yù)測森林算法篩選出的重要菌群標(biāo)記，耐久腸球菌亦參與了AP-ICU患者的識別，進(jìn)一步驗(yàn)證了該菌與AP的相關(guān)性，但其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究創(chuàng)新性：不僅比較了AP與健康人群腸道菌群的差異，且對是否轉(zhuǎn)入ICU進(jìn)行了亞組分析，并通過隨機(jī)森林模型篩選了相關(guān)差異標(biāo)記，驗(yàn)證了腸道菌群與AP的相關(guān)性。本研究局限性：(1)AP患者與健康志愿者在年齡、BMI方面存在顯著差異，且未納入飲食、生活習(xí)慣等因素，可能存在未被平衡的混雜因素，影響分析結(jié)果；(2)雖然文獻(xiàn)報(bào)道，采用直腸拭子替代糞便進(jìn)行AP菌群研究具有可行性[38]，但理論上糞便比直腸拭子標(biāo)本更有利于菌群分析。本研究以直腸拭子的方式獲取糞便標(biāo)本，原因在于部分AP患者腸道功能較弱，病程初期很難直接獲取糞便。(3)雖然AP患者與健康志愿者以及不同嚴(yán)重程度AP患者之間腸道菌群存在差異，但本研究為橫斷面分析，無法判定腸道菌群與AP發(fā)病的因果關(guān)系。

綜上所述，本研究通過16S rRNA測序及生物信息分析，比較了健康人群與AP患者的腸道菌群差異，結(jié)果顯示AP患者腸道菌群大腸志賀菌、腸球菌表達(dá)增多，而布勞特氏菌與雙歧桿菌表達(dá)減少。轉(zhuǎn)入ICU的AP患者亦表現(xiàn)出類似的變化，進(jìn)一步佐證了腸道菌群在AP發(fā)病和病情進(jìn)展中的作用。隨著研究的不斷深入，腸道菌群有望成為識別重癥AP的新型生物標(biāo)志物。

作者貢獻(xiàn)：韓梓瑩負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)采集與論文撰寫；宋鍇、范正陽、宋曉負(fù)責(zé)患者入組、數(shù)據(jù)采集；胡曉敏指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析與論文修訂；吳東指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)、論文修訂。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突