固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素和安普霉素殘留

欒楓婷 龔 蘭 王 冉 朱 磊 何 濤 魏瑞成

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室－省部共建國家重點實驗室培育基地，南京 210014）

氨基糖苷類藥物（Aminoglycosides，AGs）是由氨基糖分子和苷元通過醚鍵連接而成，主要分為天然和半合成兩類。其中，鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素和安普霉素均是在鏈霉菌屬培養(yǎng)液中提取獲得的，屬于天然來源的AGs。AGs易在細菌的核糖體中與蛋白體結(jié)合，對細菌蛋白質(zhì)合成起抑制作用，并且破壞細胞膜的完整性，從而殺滅細菌或抑制其生長[1]。上述4種AGs具有殺菌活性強、臨床療效好、廣譜抗菌性等特點，被廣泛用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。但為維護我國動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在發(fā)布的第194號公告中規(guī)定，自2020年7月起禁止抗菌類藥物作為飼料添加劑使用。因此，飼料中添加氨基糖苷類等藥物屬于違禁行為。雙氫鏈霉素和鏈霉素有相同的母體結(jié)構(gòu)，當側(cè)鏈基團是－CH2OH時為雙氫鏈霉素，是－CHO時為鏈霉素。安普霉素為單組分藥物?？敲顾刂饕蠥、B、C 3種組分，B的耳毒性和腎毒性比A高1～1.5倍，國內(nèi)外是將B作為雜質(zhì)進行控制，市售產(chǎn)品中卡那霉素A的含量占95%以上，B的含量則控制在5%內(nèi)，C含量極少。因此，監(jiān)測飼料中卡那霉素違禁添加時，實際測定卡那霉素A。

AGs是高度極性化合物，以多離子形式存在于水溶液，很難實現(xiàn)萃取或預濃縮，且該類藥物相互作用小，在傳統(tǒng)的反相色譜柱滯留量小。因此，開發(fā)AGs的分析方法具有挑戰(zhàn)性[2]。目前，對飼料中AGs殘留檢測方法主要有微生物法、離子色譜法和高效液相色譜法等。美國分析化學家協(xié)會的AOAC 973.81、AOAC 971.49和AOAC 998.02標 準 采 用微生物法分別測定了飼料中大觀霉素、鏈霉素、新霉素，但該方法操作繁瑣、靈敏度低、重現(xiàn)性差，僅適用于定性實驗[3]。LIU等[4]、ZHOU等[5]采用高效液相色譜法測定飼料中的AGs，因AGs分子結(jié)構(gòu)缺少紫外和熒光吸收基團[6]，待測樣品需進行柱前或柱后衍生化，操作繁瑣，易造成目標物損失，導致測定結(jié)果偏低。近年來，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法因定量準確、靈敏度高、抗背景干擾力強且無需衍生化等優(yōu)點被廣泛應用[7]。目前，飼料檢測的方法標準或文獻報道了在流動相中加入離子對試劑（如七氟丁酸、庚烷磺酸鈉等）[6，8～11]，使目標物易于在反向色譜柱上保留，但離子對試劑對質(zhì)譜負離子模式的抑制作用極大地限制了方法的應用，如何在多殘留測定的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法中規(guī)避使用離子對試劑是測定方法開發(fā)面臨的關鍵難題。本文避免使用離子對試劑，通過優(yōu)化前處理過程和色譜分析條件，研究建立同時測定飼料中鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素和安普霉素殘留的固相萃?。合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法，旨在為農(nóng)業(yè)農(nóng)村主管部門安全監(jiān)管飼料中氨基糖苷類藥物殘留提供方法支持。

一、材料與方法

（一）儀器LC－20A液相色譜儀（日本島津公司）；Triple QuadTM6500+三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；ME104E型電子分析天平（瑞士Mettler－Toledo公司）；VORTEX 3型渦旋混勻器（德國IKA公司）；5810R型高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；KQ－500E型超聲波清洗機（昆山超聲波儀器有限公司）；N－EVAP－24型氮吹儀（美國Organomation公司）。

（二）材料與試劑Oasis HLB固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE）柱 （500 mg/6 mL，美國Waters公司）；異丙醇（色譜級，德國Merck公司）；乙腈和甲醇 （色譜級，美國Honeywell公司）；甲酸和乙酸銨（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉、純氨水、三氯乙酸和甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素和安普霉素標準品（純度≥92%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

（三）實驗方法

1.樣品提取。準確稱取2 g樣品于50 mL離心管內(nèi)，準確加入30 mL 10%三氯乙酸溶液（含0.002 mol/L EDTA－2Na、0.01 mol/L磷酸二氫鉀，pH為7.5±0.2），渦旋混勻，超聲提取15 min，振蕩5 min，以10 000 r/min離心10 min。準確移取15 mL上清液于另一50 mL離心管內(nèi)，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.5±0.1，作為備用液。

2.樣品凈化。HLB固相萃取柱預先用5 mL甲醇、水活化，取備用液全部過柱，用水和10%甲醇水溶液各5 mL依次淋洗，抽干。準確加入5.0 mL甲酸－異丙醇－0.002 mol/L乙酸銨水溶液（10∶5∶85，體積比，pH 0.8）洗脫并收集，渦旋混勻后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.儀器條件。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫為35℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為4 μL。流動相A為1%甲酸，流動相B為含1%甲酸的乙腈，均含0.002 mol/L乙酸銨，梯度洗脫程序為0～2.5 min，20%A；2.6～4.0 min，20%A→65%A；4.1～5.5 min，65%A→90%A；5.6～6.7 min，90%A；6.8～7.5 min，90%A→20%A；7.6～12.0 min，回到20%A的初始條件。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式（ESI+），氣簾氣壓力為206.8 kPa，碰撞氣壓力為55.2 kPa，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為550℃，霧化氣壓力為448.2 kPa，輔助加熱氣壓力為413.7 kPa，掃描方式為多反應監(jiān)測模式，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種AGs的質(zhì)譜參數(shù)

二、結(jié)果與討論

（一）色譜柱的選擇AGs含有氨基等堿性基團，水溶性較大，C18色譜柱為反相色譜柱，目標藥物保留較弱。有文獻報道在流動相中加入離子對試劑可實現(xiàn)對該類藥物的分離，如張靜等[8]和劉清穎[6]在流動相中添加0.02～0.05 mol/L七氟丁酸溶液測定AGs，王欽欽[9]在樣品溶液中加入1%七氟丁酸溶液測定AGs，均通過加入離子對試劑增強了目標物在反向色譜柱上的保留。但離子對試劑的使用會嚴重抑制質(zhì)譜儀的電噴霧離子化效果，大幅降低儀器靈敏度，尤其是對負離子模式的影響更為明顯。因此，為了規(guī)避離子對試劑在質(zhì)譜方法中的使用，本研究考察了OSAKA SODA SILICA、SiELC Obelisc R、BEH C18、HSS T3、BEH HILIC和BEH Amide等色譜柱對4種氨基糖苷類藥物的分離效果。結(jié)果表明，在沒有加入離子對試劑情況下，BEH Amide和Obelisc R色譜柱可對目標物進行分離洗脫，色譜峰和保留時間均符合要求，但Obelisc R色譜柱對醇敏感，影響色譜柱的活性，微量醇試劑會造成目標物峰形拖尾，對儀器管路系統(tǒng)要求嚴格[12～13]。BEH C18、HSS T3、OSAKA SODA SILICA、BEH HILIC色譜柱對目標物保留時間短、雜質(zhì)干擾大。因此，最終選擇使用BEH Amide色譜柱。

（二）提取條件的優(yōu)化

1.提取液的優(yōu)化。本研究選取富含多種礦物元素及微量元素等成分的豬預混合飼料優(yōu)化提取溶劑。比較了提取液的不同組成和pH對4種藥物回收率的影響，通過EDTA－2Na、三氯乙酸、pH 3因素交叉試驗，確定提取液組成為10%三氯乙酸、2 mmol/L EDTA－2Na、10 mmol/L磷酸二氫鉀，pH為7.5±0.2，此條件下4種藥物的回收率約80%，滿足要求（見圖1）。提取液中的EDTA－2Na可螯合金屬離子減少對目標藥物的影響[14]，其螯合能力受提取液pH影響。磷酸二氫鉀起到穩(wěn)定溶液酸堿度的作用，而三氯乙酸溶液可沉降樣品中的蛋白質(zhì)，起到樣品凈化作用。

圖1 提取液的不同組成和pH對豬預混合飼料中4種AGs回收率的影響 （添加水平為0.5 mg/kg）

2.不同提取液體積和提取時間的優(yōu)化。分別選擇10、20、30、40 mL提取液進行樣品提取，當提取液體積為10 mL和20 mL時上清液少，不利于移?。划斕崛∫后w積為30 mL和40 mL時4種藥物回收率增加不明顯（見圖2）。從節(jié)約試劑角度考慮，將樣品提取液體積定為30 mL。之后進一步比較了不同超聲提取時間（5、10、15、20 min）對4種藥物回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲15 min后目標藥物的回收率無明顯增加（見圖2），為節(jié)約操作時間，將樣品超聲提取時間定為15 min。

圖2 提取液體積及時間對豬預混合飼料中4種AGs回收率的影響 （添加水平為0.5 mg/kg）

（三）凈化條件的優(yōu)化

1.不同SPE柱的選擇。AGs屬于極性較強的堿性化合物，為增加目標物在SPE柱填料上的保留，張靜等[8]在固相萃取過程中添加0.02 mol/L七氟丁酸溶液。本研究為簡化凈化步驟，避免使用離子對試劑，比較了WCX（150 mg/6 mL）、MCX（500 mg/6 mL）和HLB（500 mg/6 mL）3種不同類型的SPE柱對4種藥物回收率的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，WCX柱（150 mg/6 mL）和MCX柱（500 mg/6 mL）對鏈霉素和雙氫鏈霉素基本無保留，HLB柱（500 mg/6 mL）對4種AGs保留穩(wěn)定，回收率為65.1%～87.9%。因此，選擇HLB柱（500 mg/6 mL）作為凈化SPE柱。

2.過柱備用液pH的優(yōu)化。過SPE柱的備用液中目標物的離子化程度將影響SPE柱填料對目標物的吸附率。由于精料補充料、配合飼料、濃縮飼料和預混合飼料4種飼料配料之間存在差異，本研究分別選取4種不同飼料，對比pH為3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.5的過柱備用液對各飼料中4種AGs固相萃取效率的影響。結(jié)果表明，pH對配合飼料、濃縮飼料和預混合飼料3種飼料基質(zhì)中目標物的固相萃取效率影響不大，添加回收率均在70.5%～100.1%范圍內(nèi)。精料補充料與其他3種飼料相比干物質(zhì)含量高，精料補充料中4種AGs回收率僅在過柱備用液pH為6.5時在90.5%～100.4%之間（見圖4），該回收率范圍滿足檢測要求。因此，選擇pH為6.5±0.1作為過柱備用液的pH。與蔡春燕等[15]開發(fā)的方法相比，本方法可同時滿足精料補充料、配合飼料、濃縮飼料和預混合飼料4種飼料的測定。

圖4 精料補充料中4種AGs在不同過柱備用液pH條件下的添加回收率（添加水平為0.5 mg/kg）

3.SPE柱洗脫液的優(yōu)化。異丙醇極性較強，在酸性溶液中加入一定濃度異丙醇可提高4種AGs在HLB柱（500 mg/6 mL）上的洗脫效果。本研究比較了5%異丙醇、甲酸－異丙醇－水（10∶10∶80，體積比）和甲酸－異丙醇－水（10∶5∶85，體積比）3種洗脫溶液的洗脫效率，發(fā)現(xiàn)甲酸－異丙醇－水（10∶5∶85，體積比）組洗脫溶液的效果明顯高于其他兩種，飼料中4種AGs回收率均在65%以上（見圖5）。

圖5 不同洗脫液組成對飼料中4種AGs回收率的影響（添加水平為0.5 mg/kg）

洗脫液中含有較高的水分，采用氮氣吹干將影響處理效率，本研究將洗脫后溶液直接上機測定以簡化前處理過程，提高分析效率。由于pH對目標物的響應值和安普霉素色譜峰峰形影響較大，分別比 較 了 洗 脫 液pH為0.8、1.2、1.6、2.0時4種AGs的色譜峰分離效果及峰形情況（預先添加0.002 mol/L乙酸銨穩(wěn)定洗脫液pH）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當洗脫液pH為0.8時，目標物響應值和安普霉素色譜峰峰形顯著改善（見圖6）。

圖6 不同洗脫液pH條件下安普霉素特征離子色譜圖對比

4.不同廠家HLB固相萃取柱的適用性研究。為進一步研究固相萃取凈化效果的穩(wěn)定性，本研究選取StrataTM－X（500 mg/6 mL）、Oasis HLB（500 mg/6 mL）、Copure HLB（500 mg/6 mL）、Poly－Sery HLB（500 mg/6 mL）等親水－親脂固相萃取柱凈化，以基質(zhì)匹配標準溶液進行結(jié)果校正，考察不同廠家固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各固相萃取柱的回收率和重現(xiàn)性普遍較好，說明不同廠家的固相萃取柱對4種AGs的凈化效果差異不明顯，均適用于本方法。

（四）方法學考察

1.方法的基質(zhì)效應評價。飼料產(chǎn)品種類繁多且本底復雜，含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪、維生素等，ESI離子源易受到上述物質(zhì)干擾[16]，產(chǎn)生基質(zhì)效應（Matrix effect，ME）。一般以基質(zhì)匹配標準曲線的斜率（A）和溶劑標準曲線的斜率（B）的比值評估基質(zhì)效應，若ME值為0.8～1.2，則表明基質(zhì)效應不明顯[17]。本研究按照實驗方法制備10、20、50、100、250、500、1 000 ng/mL溶劑標準溶液，以及配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、預混合飼料的空白基質(zhì)標準溶液來評估飼料的基質(zhì)效應。結(jié)果表明，4種AGs在上述飼料中均存在一定的基質(zhì)增強效應，ME值為1.0～2.4。為消除基質(zhì)效應帶來的定量偏差，采用基質(zhì)混合標準工作液進行定量。

2.方法的線性范圍、檢出限和定量限。選取配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和預混合飼料4種空白飼料樣品，按前處理方法得到空白基質(zhì)溶液，配制4種AGs的10、20、50、100、250、500、1 000 μg/L基質(zhì)匹配標準系列溶液，以定量離子的峰面積和相應的質(zhì)量濃度求出線性方程和相關系數(shù)（r），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種藥物在10～1 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（r）為0.995 9～0.999 9，特征離子色譜圖見圖7。用空白飼料制備0.05、0.1、0.2、0.3 mg/kg添加樣品，處理后測定，分別選取3倍和10倍信噪比為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[17]。計算得出，方法的LOD和LOQ分別為0.05 mg/kg和0.1 mg/kg。

表2 基質(zhì)匹配標準曲線的線性方程和相關系數(shù)

圖7 豬配合飼料基質(zhì)匹配標準溶液（20 μg/L）中4種AGs的多反應監(jiān)測色譜圖

3.方法的回收率和精密度。添加低、中、高濃度目標物至配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和預混合飼料空白樣品，考察加標回收率，每種添加水平做6次重復，連做3 d。結(jié)果表明，4種AGs的平均回收率均在69.8%～101.7%范圍內(nèi)，批間和批內(nèi)的相對標準偏差（RSD）均小于15%（見表3）。

表3 4種AGs在飼料樣品中不同添加水平下的回收率和精密度 （n＝6）

4.實際樣品測定。根據(jù)所建立的測定方法，對采自養(yǎng)殖場的20份飼料樣品（配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和預混合飼料）進行檢測。結(jié)果顯示，20份樣品中4種AGs均低于檢出限，該結(jié)果表明所收集的飼料均未檢出陽性，也同時反映出禁抗政策得到很好的實施。

三、結(jié)論

本研究采用固相萃取法結(jié)合液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、預混合飼料中鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素和安普霉素殘留的定量測定方法。為了規(guī)避使用離子對試劑和獲得較高的目標物回收率，對色譜柱、提取條件、凈化條件等參數(shù)進行了優(yōu)化。最終確定飼料樣品經(jīng)10%三氯乙酸溶液（含0.002 mol/L EDTA－2Na、0.01 mol/L磷酸二氫鉀，pH為7.5±0.2）提取，HLB柱凈化，采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定。4種藥物的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg，平均回收率均在69.8%～101.7%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間相對標準偏差均小于15%。該方法簡便、快速、準確、靈敏，無離子對試劑干擾，可用于飼料中鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素和安普霉素的測定，為飼料質(zhì)量安全監(jiān)管提供了重要的技術(shù)手段。