蛇床子素聯(lián)合 TRAIL 誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)機(jī)制

司麗慧，林瑞新，吳乙時(shí)，李佳慧，崔君澤，楊淑莉*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科；2.肝膽胰外科，吉林 長春130041)

卵巢癌是婦科病癥中致死率處于首位的惡性腫瘤，以上皮性癌最為多見，占比近70%[1]。針對(duì)此類疾病的治療，目前首選治療方案為手術(shù)聯(lián)合足療程化療，但在治療過程中患者易出現(xiàn)耐藥性，從而引發(fā)劇烈毒副反應(yīng)，故應(yīng)用極大受限[2]。對(duì)此，生物治療技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其中以腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)為典型代表，其作為新型生物制劑，屬于TNF超家族范疇，可特異性誘使腫瘤細(xì)胞凋亡，呈無毒性，正常細(xì)胞組織生長分化不受影響，是一類具有潛力的抗癌藥物，但治療過程中部分患者耐藥性依舊存在，TRAIL臨床應(yīng)用亦受到阻礙[3]。為增強(qiáng)其抗癌效用，進(jìn)一步提升療效，輔以其他藥物聯(lián)合治療為現(xiàn)今研究熱點(diǎn)。而據(jù)報(bào)道證實(shí)[4]：蛇床子素作為傘形科植物中的一類純天然香豆素，除發(fā)揮抗變態(tài)反應(yīng)、抗肝炎、抗病毒及抗骨質(zhì)疏松效用外，還具有廣譜抗癌作用，在肺癌、肝癌及白血病等治療中均呈現(xiàn)良好抗癌活性。鑒于蛇床子素聯(lián)合 TRAIL 在卵巢癌抗癌作用中的研究所涉不多，本研究旨在探究蛇床子素聯(lián)合TRAIL在卵巢癌中的作用，并初步探究其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料SKOV-3和OVCAR-3細(xì)胞株由吉林大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供，重組人TRAIL蛋白購于美國RD公司，蛇床子素、MTT、DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司，caspase-3、caspase-9及其前體、凋亡酶激活因子(Apaf-1)、細(xì)胞色素C檢測(cè)試劑盒/抗體購自美國Cell Signaling公司，Apaf-1 siRNA購自上海吉瑪生物，蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購自美國Santa Cruz公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司，Caspase活性檢測(cè)試劑盒由江蘇碧云天生物技術(shù)研究所支持。酶標(biāo)儀為美國雷勃公司Thermo Multiskan MK3，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，環(huán)境條件為37℃、5%CO2。分組施加蛇床子素(0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L)及TRAIL(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL及40 ng/mL)，48小時(shí)后以MTT法檢測(cè)活性，Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)后，選取蛇床子素(50 μmol/L)、TRAIL(20 ng/mL)為最終試驗(yàn)濃度。分別為蛇床子素組(OS組)，TRAIL組(TR組)，蛇床子素聯(lián)合TRAIL組(OT組)，空白對(duì)照組(Blank組)。

1.2.2最終濃度選擇 單一施以不同濃度蛇床子素(0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L)及TRAIL(0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL及40 ng/mL)，作用48 h后運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，經(jīng)MTT檢測(cè)顯示，蛇床子素及TRAIL單一作用SKOV-3和OVCAR-3 48 h后，抑制率與濃度呈正相關(guān)。由Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)后，選取蛇床子素(50 μmol/L)、TRAIL(20 ng/mL)為最終試驗(yàn)濃度開展研究。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔5×103接種于96孔版，每孔內(nèi)加入20 μl MTT檢測(cè)液，培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加200 μl DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。

1.2.4siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后加完全培養(yǎng)基重懸，吸管吹打混勻制成細(xì)胞懸液。按1×106個(gè)/孔的細(xì)胞濃度將細(xì)胞接種至6孔板中，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24 h，使其轉(zhuǎn)染前每孔細(xì)胞達(dá)到80%-90%的匯合率。轉(zhuǎn)染前3 h，去除原培養(yǎng)基，更換為不含血清和抗生素的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基。采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。根據(jù)轉(zhuǎn)染及其后處理的不同，細(xì)胞分為蛇床子素、TRAIL聯(lián)合Apaf-1 siRNA組(si-OT組)，蛇床子素、TRAIL聯(lián)合陰性對(duì)照 siRNA組(NC-OT組)。

1.2.5凋亡檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，按照PE Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒(BD，美國)說明操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并用配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6ELISA檢測(cè) 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、0值孔、空白孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔、0值孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，恒溫箱溫育60 min，自動(dòng)洗板機(jī)洗板，將底物A和B按1∶1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液，恒溫箱溫育15 min，所有孔加入終止液，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度。

1.2.7Western blot檢測(cè) RIPA提取總蛋白，對(duì)蛋白進(jìn)行定量，采用SDS-PAGE對(duì)100 μg蛋白進(jìn)行電泳，200 mA恒流電轉(zhuǎn)印120 min，將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜浸于含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；加入一抗工作液，TBST洗3次，加入二抗，室溫?fù)u床孵育1.5 h。TBST洗3次，使用EZ-ECL化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)試劑盒對(duì)膜進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.8免疫共沉淀檢測(cè) 各組取2×106細(xì)胞行免疫沉淀。緩沖液裂解15 min后置于12 000 rpm離心10 min，取用上清液加入Apaf-1抗體孵育過夜，再加以蛋白G瓊脂糖珠行2小時(shí)孵育，經(jīng)免疫沉淀2小時(shí)后，以Western blot試驗(yàn)檢測(cè)pro-caspase蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，運(yùn)用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)，若P<0.05，則視作差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素聯(lián)合TRAIL處理降低卵巢癌細(xì)胞活性并誘導(dǎo)凋亡

在MTT檢測(cè)與流式凋亡檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，加入藥物進(jìn)行處理的另外三組的活性抑制率與誘導(dǎo)凋亡率均有顯著上升(P<0.05)，其中蛇床子素與TRAIL聯(lián)合使用顯示出了比單獨(dú)使用蛇床子素或TRAIL更高的活性抑制與誘導(dǎo)凋亡效果，此結(jié)果提示蛇床子素和TRAIL在抑制卵巢癌細(xì)胞活性與誘導(dǎo)其凋亡上具有協(xié)同作用。結(jié)果見表1及圖1A、1B。

表1 細(xì)胞活性抑制率及誘導(dǎo)凋亡率

圖1 細(xì)胞活性抑制率及誘導(dǎo)凋亡率

2.2 蛇床子素與TRAIL影響凋亡相關(guān)蛋白及細(xì)胞色素C表達(dá)

通過ELISA檢測(cè)caspase-3、caspase-9 及細(xì)胞色素C表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TRAIL組細(xì)胞色素C呈高表達(dá)，蛇床子素組則與空白對(duì)照組細(xì)胞色素C表達(dá)水平無明顯差異，提示TRAIL在卵巢癌細(xì)胞中的機(jī)制為通過細(xì)胞色素誘導(dǎo)線粒體分泌至細(xì)胞質(zhì)中；蛇床子素組caspase-9前體蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組基本一致，可知其無法直接誘使Apaf-1與caspase-9前體蛋白結(jié)合；而在蛇床子素與聯(lián)合 TRAIL使用的組別中，caspase-9前體蛋白表達(dá)相對(duì)水平顯著提高，可見Apaf-1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)Apaf-1與caspase-9前體蛋白結(jié)合；經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，蛇床子可通過上調(diào)Apaf-1表達(dá)促使caspase-3、caspase-9的活化。見表2、3與圖2。

表2 SKOV-3中caspase-3、caspase-9活化、細(xì)胞色素C及caspase-9 前體蛋白表達(dá)相對(duì)水平

表3 OVCAR-3中caspase-3、caspase-9活化 、細(xì)胞色素C及caspase-9 前體蛋白表達(dá)相對(duì)水平

圖2 SKOV-3與OVCAR-3中caspase-3、caspase-9活化 、細(xì)胞色素C及caspase-9 前體蛋白表達(dá)相對(duì)水平

2.3 蛇床子素與TRAIL影響Apaf-1表達(dá)水平

通過Western blot檢測(cè)Apaf-1表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，TRAIL組Apaf-1相對(duì)水平較空白對(duì)照組無明顯差異，而蛇床子素聯(lián)合TRAIL組Apaf-1則呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，提示蛇床子素可能通過上調(diào)Apaf-1表達(dá)起到TRAIL增敏效用。影響Apaf-1的表達(dá)可能是蛇床子素與TRAIL處理起到效果的重要機(jī)制。結(jié)果見表4與圖3。

表4 SKOV-3中Apaf-1表達(dá)相對(duì)水平

圖3 SKOV-3中Apaf-1表達(dá)相對(duì)水平

2.4 Apaf-1通過與caspase-9前體的相互作用影響細(xì)胞凋亡

利用免疫共沉淀檢測(cè)Apaf-1與caspase-9前體的相互作用情況，結(jié)果顯示Apaf-1與caspase-9前體在卵巢癌細(xì)胞中存在相互作用(圖4)，提示Apaf-1通過此種相互作用影響卵巢癌細(xì)胞凋亡情況是蛇床子素與TRAIL誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。對(duì)蛇床子素、TRAIL聯(lián)合Apaf-1 siRNA組(si-OT組)，蛇床子素、TRAIL聯(lián)合陰性對(duì)照 siRNA組(NC-OT組)兩組細(xì)胞進(jìn)行的凋亡檢測(cè)與ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染Apaf-1 siRNA后，蛇床子素聯(lián)合TRAIL處理對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用出現(xiàn)下降，提示Apaf-1的表達(dá)變化是蛇床子素聯(lián)合TRAIL影響卵巢癌細(xì)胞凋亡的重要一環(huán)。結(jié)果見圖5。

圖4 Apaf-1與caspase-9前體的相互作用情況

圖5 凋亡檢測(cè)與ELISA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

卵巢癌作為盆腔深部隱匿性婦科腫瘤，首次確診多已為中晚期，因此最佳治療時(shí)機(jī)錯(cuò)失，有效治療手段缺乏，其致死率在婦科惡性腫瘤中處第一位[5-6]。目前，以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類、紫杉醇等藥物足療程化療為卵巢癌一線治療方案，可有效延長患者生存期[7]。據(jù)有關(guān)研究證實(shí)[8]：在化療初期階段，60%-80%卵巢癌患者具有較高敏感性，但在持續(xù)治療過程中，約75%以上晚期卵巢癌患者呈現(xiàn)耐藥性，由此引發(fā)的嚴(yán)重副作用使治療難度驟升。為此，醫(yī)學(xué)界以卵巢癌凋亡機(jī)理為切入點(diǎn)開展了諸多相關(guān)研究，旨在尋求一種更為有效的治療方案。

現(xiàn)如今，生物治療成為惡性腫瘤治療的第四大技術(shù)，在卵巢癌治療中已取得確切療效。TRAIL為首選生物治療藥物，于1995年首次發(fā)現(xiàn)，歸屬于TNF家族，因其腫瘤細(xì)胞凋亡屬特異性誘導(dǎo)，且不對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，故其作為抗癌藥物潛能巨大[9]。但限于仍有部分腫瘤患者可對(duì)TRAIL治療產(chǎn)生耐藥性，因此，聯(lián)合增敏藥物，對(duì)其耐藥性加以逆轉(zhuǎn)，提升TRAIL殺傷腫瘤細(xì)胞能力，為現(xiàn)今研究熱點(diǎn)[10]。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[11]，單獨(dú)使用蛇床子素及TRAIL無法對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，但聯(lián)合使用，誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡情況明顯，且線粒體膜電位水平明顯降低，細(xì)胞色素C釋放增加，由此證實(shí)蛇床子素可能為TRAIL增敏劑。蛇床子作為一類天然植物化合物，可在一定程度控制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)過程，在炎癥及纖維化病癥中具有確切療效[12]。據(jù)Lu K等學(xué)者[13]研究報(bào)道，使用不同劑量的蛇床子素治療子宮內(nèi)膜癌(Ec)，隨蛇床子素劑量上升可上調(diào)miR-424表達(dá)，從而使Ishikawa和KLE細(xì)胞增殖受到抑制并被誘導(dǎo)凋亡，蛇床子素已成為一種新型且具備潛力的子宮內(nèi)膜癌抗癌藥劑。多方證據(jù)表明，蛇床子素具備成為卵巢癌治療藥物潛能?；诖耍疚难芯恳庥轿錾叽沧铀芈?lián)合TRAIL 誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞的凋亡，并對(duì)其作用機(jī)理加以明確，旨在尋找一種新型卵巢癌治療策略。

本文結(jié)果顯示：蛇床子素+TRAIL組細(xì)胞活性抑制率及凋亡率均最高，且其中機(jī)制為Apaf-1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了caspase-3、caspase-9活化。其中Apaf-1是線粒體通路中一個(gè)關(guān)鍵的促凋亡因子，在一定條件下能直接促進(jìn)procaspase-9的活化和釋放，從而進(jìn)一步活化caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在本研究的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)了Apaf-1在卵巢癌細(xì)胞中與caspase-9前體的相互作用。由此可知：蛇床子素聯(lián)合TRAIL治療具有協(xié)同效果，且可增強(qiáng)TRAIL抗癌效用，此過程與Apaf-1蛋白高度相關(guān)。另外可能的潛在機(jī)制在于[14]：蛇床子素聯(lián)合TRAIL可影響線粒體膜電位，從而增加細(xì)胞色素C等凋亡誘導(dǎo)因子釋放，細(xì)胞凋亡通路得以激活。有關(guān)線粒體膜電位變化的機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探索。

此外，作為 caspase 家族引起細(xì)胞凋亡的最主要的成分之一的caspase-9，其活化直接影響到通路進(jìn)程，可有效激活caspase-3效應(yīng)分子，促使腫瘤細(xì)胞DNA呈片段化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在caspase-9活化過程中，Apaf-1蛋白的參與極為關(guān)鍵。本研究結(jié)果已證實(shí)：蛇床子素聯(lián)合TRAIL可促進(jìn)Apaf-1表達(dá)上調(diào)，由此與caspase-9前體蛋白結(jié)合增強(qiáng)。這一機(jī)制與于有江等學(xué)者[15]所述研究有較大一致性，而Jiang G等學(xué)者[16]以卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、OV2008及正常卵巢細(xì)胞IOSE80為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮囼?yàn)，發(fā)現(xiàn)蛇床子素可通過G2/M阻滯抑制細(xì)胞增殖并誘使細(xì)胞凋亡，其中潛在機(jī)制與相對(duì)凋亡蛋白Bcl-2、Bax和caspase 3/9的調(diào)節(jié)有關(guān)。且據(jù)Bae H等學(xué)者[17]研究證實(shí)，蛇床子素可通過靶向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/促分裂原激活的蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，通過對(duì)斑馬魚異種移植測(cè)定，肯定了蛇床子素的藥理作用，故將其作為卵巢癌治療的有效藥物得到了有力佐證。本文的研究結(jié)果對(duì)上述發(fā)現(xiàn)具有補(bǔ)充意義。

綜上所述：蛇床子素聯(lián)合TRAIL治療卵巢癌可降低細(xì)胞活性，進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡，原因與其誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中細(xì)胞色素C的分泌及上調(diào)Apaf-1表達(dá)，從而通過Apaf-1與caspase-9相互作用，促進(jìn)caspase-9的活化表達(dá)有關(guān)。蛇床子素與TRAIL聯(lián)合使用具有較高卵巢癌治療潛力，可為后續(xù)卵巢癌臨床治療提供重要參考。