AMPK/ACC通路參與高強(qiáng)度間歇、持續(xù)性運(yùn)動(dòng) 改善肥胖大鼠肝臟線粒體脂肪氧化功能的研究＊

張 媛，李佳欣，劉小瑋，韋 娟，張念云，盛 蕾

（1.南京體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院，江蘇 南京 210014；2.上海交通大學(xué) 系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院 運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，上海 200240；3.杭州師范大學(xué) 體育學(xué)院，浙江 杭州 311121）

肥胖（obesity）是指體重增加、遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素相互作用下造成體內(nèi)脂肪堆積過多和/或分布異常而引起的慢性代謝性疾病，已成為全球公共健康危機(jī)。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國有46%成年人及15%兒童出現(xiàn)肥胖或超重，面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［1］。肥胖可誘發(fā)多種代謝綜合征，包括：2型糖尿病（T2DM）、非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）、心血管疾病等，相反，通過膳食與運(yùn)動(dòng)干預(yù)控制體重可顯著降低肥胖人群的全因死亡率［2，3］。NAFLD的患病率及嚴(yán)重程度與肥胖上升趨勢高度相關(guān)［4］，在我國約70%-80%肥胖人群中伴隨有NAFLD［5］，由于NAFLD在早期階段不易被診斷，因此由肥胖誘發(fā)的NAFLD發(fā)病率是未來十年的主要健康威脅之一［6，7］。營養(yǎng)過剩與缺乏運(yùn)動(dòng)是導(dǎo)致肥胖及NAFLD的常見誘因。若機(jī)體因肥胖或脂質(zhì)代謝異常使脂肪細(xì)胞存儲(chǔ)脂肪能力下降時(shí)，肝細(xì)胞則發(fā)揮類似脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)存儲(chǔ)作用，將多余脂質(zhì)以甘油三酯的形式儲(chǔ)存在肝細(xì)胞中，從而逐漸造成肝臟脂肪變性［8，9］。脂肪酸氧化是肝臟脂代謝的主要通路之一，肝臟是進(jìn)行脂肪酸氧化最活躍的組織，其主要氧化形式為β-氧化，需在線粒體中完成，因此提高肝臟線粒體功能以及對(duì)脂肪酸的氧化能力是改善肝臟脂質(zhì)沉積有效機(jī)制。諸多研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)可從多方面緩解肥胖趨勢、改善NAFLD進(jìn)程，如：運(yùn)動(dòng)可調(diào)節(jié)正常肝臟與脂肪肝中的脂滴動(dòng)力學(xué)［10］，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可通過改變肝臟氧化應(yīng)激水平與炎癥反應(yīng)改善脂肪肝［11］，運(yùn)動(dòng)通過調(diào)節(jié)特定細(xì)胞器線粒體的功能和結(jié)構(gòu)來防治NAFLD［12］等。本研究通過建立營養(yǎng)性肥胖大鼠模型，并對(duì)其分別進(jìn)行高強(qiáng)度間歇游泳訓(xùn)練（HIIT）、持續(xù)性游泳訓(xùn)練（CT）不同運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)，擬探究不同運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)對(duì)營養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積、線粒體功能及脂肪氧化能力的影響，以期揭示其作用機(jī)制，為肥胖相關(guān)慢性疾病的防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 營養(yǎng)性肥胖大鼠模型構(gòu)建

4周齡健康雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠80只，體重為68.4±2.4g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。大鼠每籠5只分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為普通飼料（normal diet，N）組（國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)）和45%高脂飼料（high-fat diet，H）組，購自美國Research Diets公司，貨號(hào)D12451，其中蛋白質(zhì)占 20 kcal%，糖類35kcal%和脂肪45kcal%。所有大鼠自然光照，室內(nèi)溫度 20℃±5℃，相對(duì)濕度50%～70%且通風(fēng)良好的條件下自由飲食飼養(yǎng)。本研究經(jīng)過本校動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，符合中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制度倫理審查委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)方針。飼養(yǎng)約8-9周后，稱量大鼠體重并篩選出肥胖大鼠，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：高脂飼料飼養(yǎng)的大鼠體重高于普通飼料飼養(yǎng)大鼠平均體重的20%即為單純性肥胖大鼠［13］。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與訓(xùn)練方案

營養(yǎng)性肥胖大鼠建模成果后，從普通大鼠中選取36只普通大鼠隨機(jī)分為普通安靜（normal control， NC）組，普通高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（normal high intensity interval training， NHI）組，普通持續(xù)性訓(xùn)練（normal continuous training， NCT）組。從肥胖大鼠中選取36只肥胖大鼠隨機(jī)分為肥胖安靜（obese control， OC）組，肥胖高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（obese high intensity interval training， OHI）組，肥胖持續(xù)性訓(xùn)練（obese continuous training， OCT）組6組，每組12只。肥胖組大鼠各組均維持高脂膳食喂養(yǎng)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組（HIIT 和CT）大鼠在室溫20℃～26℃環(huán)境中，于長1 m、寬0.5 m、 高0.7 m，水深60cm，水溫31℃±1℃的玻璃泳池中進(jìn)行游泳訓(xùn)練，具體訓(xùn)練方案參照（表1）［14］。Gobatto等研究得出5%-6%體重負(fù)重游泳為大鼠乳酸閾強(qiáng)度，因此本實(shí)驗(yàn)CT組游泳負(fù)重小于3%體重，HIIT組游泳負(fù)重大于5%［15］。大鼠負(fù)重按標(biāo)準(zhǔn)稱量金屬塊于氣球袋中縛大鼠尾部。訓(xùn)練過程中，若大鼠出現(xiàn)反復(fù)沉浮、失去平衡或協(xié)調(diào)性下降等情況，用器皿將其撈起休息片刻待恢復(fù)后繼續(xù)訓(xùn)練，若大鼠漂浮水面靜止不游動(dòng)，用軟毛刷等給予刺激，促其運(yùn)動(dòng)，以保證運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練量。于每次訓(xùn)練結(jié)束后，用毛巾吹風(fēng)機(jī)等干燥器具和手段將大鼠身體完全干燥，防止大鼠因皮毛濕潤受涼。訓(xùn)練期間，及時(shí)觀察并記錄大鼠活動(dòng)及進(jìn)食飲水狀況。末次訓(xùn)練后禁食12h后，稱量大鼠體重，處死后取出肝臟于冰上用生理鹽水清洗，剔除脂肪組織后稱重，稱取100mg新鮮肝臟組織冰上剪碎即刻放入盛有少量PBS緩沖液中，制備肝臟細(xì)胞懸液。另剪切一部分肝臟組織分置凍存管于液氮中速凍，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（HIIT）和持續(xù)性訓(xùn)練（CT）方案

1.3 主要試劑和儀器

BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)23225）購于Thermo Scientific公司；肝臟TG檢測試劑盒（貨號(hào)A110-1-1）購于南京建成；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（貨號(hào)P0027）、線粒體提取試劑盒（貨號(hào)C3606）、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（貨號(hào)C2006）購于碧云 天公 司；CPT-1α（貨 號(hào)ml058994）、β-HAD（貨號(hào)ml058964）及ACC（貨號(hào)ml059228）脂肪酶 ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物；PGC-1α（貨號(hào)20658-1-AP）購于Proteintech公司、p-AMPK（貨號(hào)2535S）購于Cell Signaling、p-ACC蛋白一抗（貨號(hào)AA110）購于碧云天公司，內(nèi)參蛋白GAPDH一抗（貨號(hào)為60004-1-Ig）購于proteintech生物公司，抗兔、抗鼠二抗（貨號(hào)BS13278、BS12478）抗購于Bioworld公司。

蔡 司 顯 微 鏡（Axio imager A2），Biorad Western blotting 發(fā)光儀（ChemidocTM Touch Gel Imaging System #1708370），Tecan酶標(biāo)儀（M200）

1.4 指標(biāo)檢測與方法

1.4.1 肝指數(shù)計(jì)算

測量各組大鼠體重和肝臟重量，按照公式計(jì)算：肝指數(shù)=肝臟重量（g）/體重（g）

1.4.2 生物化學(xué)法檢測肝臟TG含量

GPO-PAP酶法檢測肝臟TG含量。取新鮮肝臟組織剪碎冰浴勻漿，無水乙醇提取勻漿介質(zhì)，2500 rpm離心10 min，取上清液，酶標(biāo)儀檢測TG含量，酶標(biāo)儀檢測波長510 nm吸光值，按照說明書帶入公式計(jì)算出肝臟TG含量。

1.4.3 油紅染色檢測肝臟脂質(zhì)含量

肝臟冰凍切片取6μm進(jìn)行脂質(zhì)染色，用PBS清洗3次后，采用4%多聚甲醛固定10 min， 油紅O染液染色10 min， 蘇木素染液復(fù)染5 min， 清洗后封片，脂滴顏色為橘紅色，光鏡顯微鏡400倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野，圖像分析系統(tǒng)選用Image-J進(jìn)行分析，計(jì)算每個(gè)視野下脂滴面積百分比。

1.4.4 ELISA檢測肝臟組織酶活性

采用ELISA法檢測肝臟組織CPT-1α、β-HAD、ACC脂肪氧化酶及CS酶活性，取部分肝臟組織剪碎加入緩沖液，冰浴勻漿后，離心取上清液，按照試劑盒說明書計(jì)算肝臟脂肪氧化酶活性。

1.4.5 流式細(xì)胞儀檢測肝臟線粒體膜電位

新鮮肝臟組織約100mg，置于PBS冰上剪碎，冰浴上進(jìn)行勻漿，經(jīng)多次梯度離心后收集到線粒體沉淀，用線粒體儲(chǔ)存液重選線粒體。對(duì)線粒體樣本進(jìn)行BCA蛋白定量。取50ug純化線粒體，裝載JC-1熒光探針后上流式細(xì)胞儀（ACEA NovoCyteTM）檢測熒光強(qiáng)度。采集數(shù)據(jù)后，采用Novo ExpressTM軟件進(jìn)行分析，設(shè)置PE通道檢測JC-1聚集物，發(fā)紅色熒光，F(xiàn)L1（FITC）通道檢測JC-1單體，發(fā)綠色熒光。若JC-1熒光染料聚集在線粒體基質(zhì)中，將形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光，表明此時(shí)線粒體膜電位較高，相反，JC-1熒光染料在線粒體膜電位較低時(shí)，以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。由此，采用紅、綠熒光的相對(duì)比例來衡量線粒體去極化的比例，反映線粒體膜電位的變化情況。以20μM濃度CCCP處理后的陽性對(duì)照為參照畫門，檢測線粒體膜電位，Q2-2區(qū)線粒體膜電位越高，Q2-4區(qū)膜電位越低。

1.4.6 肝臟細(xì)胞核蛋白與胞漿蛋白提取

取定量肝臟組織樣本約100mg，采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，按照比例配置組織勻漿液，冰浴充分勻漿后4℃，1500g離心5min，上清液為部分細(xì)胞漿蛋白。向沉淀中添加抽提液，渦旋混勻后冰浴10-15分鐘，4℃ 12，000-16，000g離心5min，上清液即為細(xì)胞漿蛋白。再次向沉淀中加入細(xì)胞核蛋白抽提液，每隔1-2分鐘高速渦旋混勻，持續(xù)30分鐘后，后4℃，12，000-16，000g離心10min，上清液即為細(xì)胞核蛋白，BCA法測定各樣本蛋白濃度，-70℃凍存待用。

1.4.7 Western blot檢測

按照BCA試劑盒說明書步驟提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量，50ug蛋白上樣量經(jīng)12.5% SDS PAGE凝膠電泳分離，后PVDF轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5h封閉 后加 抗PGC-1α、p-AMPK、p-ACC、GAPDH一抗于4℃冰箱過夜。次日，TBST洗膜3次每次10min，加二抗室溫孵育1.5h，TBST洗膜后，使用ECL超敏化學(xué)試劑（美國bioworld）反應(yīng)一定時(shí)長后，置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）進(jìn)行曝光，發(fā)光結(jié)果采用Image Lab Software 5.2（BIO-RAD，美國）處理分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

所有數(shù)據(jù)結(jié)果使用Execl軟件（美國Microsoft）整理并表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），采用GraphPad Prism 5.01軟 件（美 國GraphPad Software）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析（Two-way ANOVA）并作圖，P＜0.05時(shí)為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠體重及肝指數(shù)

由圖1及表2可知，營養(yǎng)性肥胖大鼠與普通大鼠相比，大鼠體重、肝臟重量及肝指數(shù)均顯著增高（P＜0.05）。與NC組相比，8周HIIT與CT運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，NCT組大鼠體重顯著降低（P＜0.05），NHI組肝臟重量顯著下降（P＜0.05）。與OC組相比，8周HIIT與CT運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，OHI、OCT組大鼠體重、肝臟重量及肝指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肝臟重量及肝指數(shù)變化

圖1 不同運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)后正常、肥胖大鼠體重變化

2.2 大鼠肝臟脂質(zhì)含量

與NC組大鼠相比，OC組大鼠肝臟組織脂滴含量顯著增高，（P＜0.05）。8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)后，普通、肥胖大鼠肝臟脂滴均顯著下降（P＜0.05）見圖2。OC組大鼠肝臟TG含量顯著增高，HIIT運(yùn)動(dòng)干預(yù)后顯著降低NC和OC肝臟TG含量（P＜0.05），而CT對(duì)肝臟TG含量的干預(yù)效果不明顯，見圖3。

圖2 肝組織油紅O染色（比例尺=20μm）及脂肪滴總面積百分比

圖3 各組大鼠肝臟TG含量

如圖4所示，與NC組大鼠相比，OC組大鼠AMPK與ACC磷酸化水平無顯著變化。與OC組大鼠比較，HIIT干預(yù)后，肝臟AMPK與ACC磷酸化水平顯著增高（P＜0.05），而CT僅對(duì)肥胖大鼠p-ACC含量有顯著影響（P＜0.05）。此外，與普通大鼠相比，肥胖大鼠脂肪合成酶ACC活性顯著增高（P＜0.05），CPT-1α、β-HAD等脂肪分解酶活性無顯著變化。HIIT可顯著提高普通、肥胖大鼠CPT-1α、β-HAD等脂肪分解酶活性（P＜0.05），同時(shí)降低肥胖大鼠脂肪合成酶ACC活性（P＜0.05），而CT對(duì)各組大鼠線粒體脂肪氧化酶活性作用不明顯，見圖5。

圖4 各組大鼠肝臟AMPK/ACC蛋白表達(dá)

圖5 各組大鼠肝組織線粒體脂肪氧化酶活性變化

2.3 大鼠肝臟線粒體功能

與NC組大鼠相比，OC組線粒體低膜電位比例顯著增高（P＜0.05）；與OC組大鼠相比，8周HIIT、CT運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)后OHI與OCT組線粒體低膜電位比例顯著降低（P＜0.05），見圖6。與安靜組相比，8周HIIT與CT干預(yù)使肝細(xì)胞核PGC-1α蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），8周HIIT運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著提高普通、肥胖大鼠線粒體檸檬酸合酶（CS）活性（P＜0.05），見圖7。

圖6 各組大鼠肝組織線粒體膜電位

圖7 各組大鼠肝組織線粒體PGC-1 α表達(dá)量即CS活性

3 分析與討論

3.1 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠體重及肝指數(shù)的影響

近些年，諸多人體與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究關(guān)注高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)（HIIT）與持續(xù)性運(yùn)動(dòng)（CT）兩種不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)超重、肥胖及與之相關(guān)慢性病的影響［16-18］。本研究中，高脂膳食誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖大鼠在進(jìn)行8周HIIT或CT干預(yù)后，其體重均低于安靜肥胖大鼠，說明兩種運(yùn)動(dòng)方式均可達(dá)到減輕體重的效果。目前，大量研究已充分證實(shí)肥胖與NAFLD之間具有較高度相關(guān)，肥胖不僅與NAFLD的初始階段有關(guān)，如單純性脂肪變性（SS，simple steatosis），而且與其嚴(yán)重程度有關(guān)，從流行病學(xué)的觀點(diǎn)來看，兩種疾病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率持續(xù)上升［19］。Pegah Golabi等對(duì)NAFLD患者結(jié)合膳食或運(yùn)動(dòng)干預(yù)后實(shí)驗(yàn)研究的薈萃分析結(jié)論表明：患者每周3-7天，為期8-48周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可動(dòng)員30.2%的肝臟脂肪，運(yùn)動(dòng)對(duì)分解肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的促進(jìn)作用獨(dú)立于對(duì)體重的影響，并且有氧與抗阻運(yùn)動(dòng)方式對(duì)其影響不存在顯著差異［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，肥胖肝臟重量及肝指數(shù)指標(biāo)均顯著增高，說明肥胖在一定程度上導(dǎo)致脂肪在肝臟組織中異位沉積，表現(xiàn)為NAFLD發(fā)展的早期階段。肥胖大鼠在進(jìn)行8周HIIT與CT干預(yù)后，其肝臟重量與肝指數(shù)呈顯著下降，提示兩種運(yùn)動(dòng)方式對(duì)緩解肝臟脂肪異位沉積均具有顯著效果。

3.2 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠肝臟AMPK/ACC通路調(diào)節(jié)下脂代謝的影響

脂肪代謝不平衡往往是誘發(fā)NAFLD的直接病因［21］。研究表明：導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積的FFAs主要來自外周脂肪分解［22］。其次，來自肝臟脂肪從頭合成（DNL，de novo lipogenesis）［23］。Samuel 等研究發(fā)現(xiàn)：骨骼肌IR會(huì)導(dǎo)致高血糖癥和高胰島素血癥，兩者作用可促進(jìn)脂肪合成酶表達(dá)水平，使肝臟中葡萄糖合成FFAs增加［24］。另一方面，F(xiàn)FAs的清除是決定FFAs穩(wěn)態(tài)的另一重要環(huán)節(jié)。肝臟FFAs主要通過線粒體β氧化和再酯化合成甘油三酯進(jìn)一步代謝。NAFLD早期肝細(xì)胞內(nèi)FFAs內(nèi)流增加，增強(qiáng)線粒體脂肪氧化，是代償性降低肝臟脂肪積累的適應(yīng)性表現(xiàn)。Kakimoto等研究表明肝臟線粒體脂肪氧化能力在HFD喂養(yǎng)4周時(shí)有所降低，而在喂養(yǎng)8周時(shí)卻得以恢復(fù)，提示HFD誘導(dǎo)的受損肝臟線粒體功能具有一定重塑性［25］，其可能與提高線粒體功能及肉堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶1（CPT-1）、輕脂酞輔酶脫氫酶（β-HAD）活性有關(guān)［26-27］。Ningning Wang等人采用膳食誘導(dǎo)型肥胖小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在進(jìn)行8周HIIT或CT干預(yù)后，HIIT可通過調(diào)節(jié)乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等脂質(zhì)合成基因及CPT1α、β-HAD等β氧化基因mRNAs水平，顯著抑制肝臟脂質(zhì)合成［17］。本研究結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積現(xiàn)象明顯，肝細(xì)胞TG含量顯著增高，油紅染色脂滴含量大幅增加，在經(jīng)過8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)后，肝臟甘油三酯含量顯著下降，其中肥胖大鼠的HIIT干預(yù)效果優(yōu)于CT，提示HIIT與CT兩種不同的運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用存在不同機(jī)制。

AMPK是細(xì)胞內(nèi)重要的能量調(diào)控分子，也是肝臟重要的脂代謝調(diào)節(jié)分子之一。AMPK激活后對(duì)改善NAFLD的作用主要通過三個(gè)方面發(fā)揮作用：1）抑制肝臟從頭合成作用。研究表明，ACC是AMPK下游的重要調(diào)節(jié)因子之一，存在于肝細(xì)胞內(nèi)，可催化乙酰CoA進(jìn)行脂肪酸的從頭合成，是肝臟TG合成的重要限速酶。磷酸化的p-AMPK可使ACC磷酸化失活，從而抑制脂肪酸的從頭合成［28］。2）提高肝臟脂肪酸氧化。AMPK激活后對(duì)ACC的失活作用，可進(jìn)一步抑制丙二酰輔酶A（M-CoA），其為線粒體脂肪酸氧化過程CPT-1限速酶的抑制劑［29］。因此，AMPK激活可促進(jìn)脂肪酸在CPT-1的協(xié)助下進(jìn)入線粒體基質(zhì)進(jìn)行β氧化。研究發(fā)現(xiàn)：AMPK表達(dá)下降可使肝臟脂肪生成增加，脂肪酸氧化減少［30］。相反，肝臟AMPK過表達(dá)可降低脂質(zhì)生成相關(guān)基因表達(dá)，從而降低肝臟TG含量，同時(shí)增加脂肪酸氧化相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)線粒體β氧化［31-32］。3）增強(qiáng)線粒體功能。線粒體是細(xì)胞ATP生成部位，細(xì)胞ATP生成與消耗直接影響AMPK的激活程度，同時(shí)線粒體也是脂肪被徹底氧化的核心場所，線粒體功能與脂肪氧化效率密切相關(guān)［33］。

AMPK對(duì)細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP比值的變化敏感，其主要由干擾ATP生成（如線粒體抑制劑/解耦劑）或加速ATP消耗（如運(yùn)動(dòng)）的能量挑戰(zhàn)引起的AMP/ATP比值增加而被激活。研究證實(shí)，激活A(yù)MPK通路是運(yùn)動(dòng)改善脂肪肝的重要機(jī)制之一［34-35］。人體研究表明，運(yùn)動(dòng)與膳食干預(yù)是改善成人［36］及青少年［37］NAFLD患者的有效手段。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練課降低NAFLD表現(xiàn)，而停訓(xùn)將導(dǎo)致脂肪肝變性［38］。Xuejie等研究報(bào)道，急性和慢性運(yùn)動(dòng)均可間接激活2型糖尿病大鼠肝臟AMPK/ACC信號(hào)通路，提高肝臟胰島素敏感性，而慢性或長期運(yùn)動(dòng)將進(jìn)一步通過AMPK/ACC信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝［39］。有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)增加NAFLD小鼠AMPK和CPT1蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)脂肪酸β氧化，降低體重，減輕和逆轉(zhuǎn)肝脂肪變性［40］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，普通與肥胖大鼠相比，AMPK/ACC信號(hào)通路表達(dá)水平無顯著差異，肥胖大鼠ACC酶活性顯著高于普通大鼠，提示肥胖大鼠肝臟脂肪合成率較高。HIIT可顯著上調(diào)普通、肥胖大鼠肝臟AMPK、ACC磷酸化水平，并顯著提高線粒體β氧化酶CPT-1、β-HAD活性，同時(shí)抑制肥胖大鼠脂肪合成酶ACC活性。正常與肥胖大鼠在8周CT運(yùn)動(dòng)干預(yù)后ACC磷酸化水平顯著增高，ACC酶失活增加，抑制脂肪 合成。

3.3 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)大鼠肝臟線粒體功能的影響

線粒體脂肪氧化水平對(duì)維持肝臟細(xì)胞脂質(zhì)平衡具有重要意義，線粒體功能失調(diào)可導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生脂肪蓄積，觸發(fā)炎癥與纖維化反應(yīng)導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生發(fā)展［41］。肥胖、T2DM患者線粒體過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（PGC-1）表達(dá)下調(diào)，線粒體DNA突變，線粒體數(shù)量減少，氧化磷酸化能力下降［42-43］。Sanyal等研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者肝臟脂肪β氧化顯著增高，線粒體結(jié)構(gòu)受損，線粒體脊缺失，提示營養(yǎng)性肥胖造成的長期β氧化代償性增強(qiáng)可導(dǎo)致線粒體受損和功能降低［44］。同樣有研究發(fā)現(xiàn)：NASH的嚴(yán)重程度與肝臟線粒體功能下降顯著正相關(guān)［45］。嚙齒類動(dòng)物研究表明，跑步可增強(qiáng)肝臟線粒體功能，提高新鮮提取肝臟的棕櫚酸氧化水平，同時(shí)增加肝臟CPT-1酶活性［46-47］。此外，肝細(xì)胞凋亡也參與了NAFLD的發(fā)生和進(jìn)展，胞漿中線粒體狀態(tài)變化則是細(xì)胞凋亡病理改變的重要部分［48］。研究表明：不同NAFLD階段的肝臟線粒體ETC復(fù)合物活性、耗氧率、氧化磷酸化（OXPHOS）效率以及線粒體膜電位呈現(xiàn)出不同變化特征，導(dǎo)致這些差異的原因可能與疾病病程肝臟氧化應(yīng)激程度不同有關(guān)。如Koliaki等發(fā)現(xiàn)肝臟線粒體OXPHOS效率在簡單脂肪變性機(jī)體中顯著增高，而在NASH患者中顯著下降［49］。基因瘦素缺陷ob/ob小鼠和瘦素抵抗db/db小鼠以中度肝炎癥和輕度纖維化為特征［50］，其肝臟線粒體氧化能力有所增強(qiáng)，而ETC復(fù)合物活性被顯著抑制，NASH的肝臟線粒體ETC明顯受損［51-52］。線粒體膜電位作為檢測細(xì)胞凋亡的有效指標(biāo)，反映了肝臟細(xì)胞在不同時(shí)期的狀態(tài)。營養(yǎng)性肥胖機(jī)體肝臟組織由于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，易引起線粒體膜上通透性增加，導(dǎo)致跨膜電位降低， 膜完整性及線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p［53］。研究發(fā)現(xiàn)，與普通大鼠相比，9周高脂膳食大鼠肝臟線粒體膜電位顯著下降，而對(duì)其進(jìn)行每天1小時(shí)，每周 5天，為期8周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)后，與安靜組相比，大鼠肝臟膜電位得以恢復(fù)，這一改變與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高線粒體內(nèi)膜卵磷脂與腦磷脂的含量比值有關(guān)［54］。提示，運(yùn)動(dòng)干預(yù)促進(jìn)線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)合成水平增高，線粒體膜通透性被穩(wěn)定，膜電位正常，線粒體生物機(jī)能增強(qiáng)。與之前研究結(jié)果相似，本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與普通大鼠比較，營養(yǎng)性肥胖大鼠線粒體低膜電位比例顯著增高，8周HIIT或CT干預(yù)均可使線粒體低膜電位比例明顯降低，并趨于普通大鼠水平，說明不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)優(yōu)化線粒體功能的重要調(diào)節(jié)作用。其次，8周HIIT使普通、肥胖大鼠肝臟線粒體生物發(fā)生關(guān)鍵因子PGC-1表達(dá)水平、CS活性均顯著增高，而CT對(duì)線粒體的作用效果弱于HIIT，提示，肝臟線粒體在HIIT運(yùn)動(dòng)干預(yù)下表現(xiàn)出更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性。

4 結(jié)論

綜上所述，HIIT運(yùn)動(dòng)干預(yù)可通過AMPK/ACC通路調(diào)節(jié)肥胖大鼠肝臟脂代謝酶活性，提高線粒體功能及脂肪氧化水平，緩解營養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)沉積，干預(yù)效果更佳。CT運(yùn)動(dòng)干預(yù)可提高肥胖大鼠ACC磷酸化水平，抑制肝臟脂肪合成，亦可在一定程度上緩解肝臟脂質(zhì)沉積，兩者在線粒體水平調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。