甘蔗發(fā)酵制品的氨基酸對比及營養(yǎng)風味分析

林 波，鄭鳳錦，方曉純，陳趕林

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室，廣西 南寧 530007）

甘蔗為廣西重要的經(jīng)濟作物，亦是傳統(tǒng)支柱產(chǎn)業(yè)。甘蔗因其含糖分高，且富含綠原酸、咖啡酸等酚酸類物質(zhì)，以及多種氨基酸、維生素、鈣、鐵、微量元素等營養(yǎng)成分[1-2]。甘蔗性平，具有清熱潤肺、健入肝脾、生津解酒、止咳消痰等功效，是“天然復脈湯”或“補血果”[3]。經(jīng)現(xiàn)代學者對甘蔗的莖、葉、汁進行相關研究，證實甘蔗具有較強的抗炎、抗氧化、抗突變、降血糖、正向調(diào)節(jié)血脂水平等功效[2，4-6]。甘蔗汁糖分豐富，經(jīng)發(fā)酵加工后可制備果酒[7]、果醋[8]、功能飲料[9]等，不僅拓寬了甘蔗深加工多樣化產(chǎn)品開發(fā)，還豐富了果酒、果醋的品種類型，甘蔗深加工成為了國內(nèi)外近年來加工研究的熱點。

隨著國民經(jīng)濟和人民生活水平的提高，酒類產(chǎn)品趨于低度化、營養(yǎng)型，果醋產(chǎn)品兼具營養(yǎng)、保健性能，已成為產(chǎn)業(yè)政策、市場需求及與國際接軌的必然發(fā)展趨勢。據(jù)報道[10]，2020年上半年，在淘寶、天貓、酒仙網(wǎng)等電商平臺，果酒的銷售額達3.243億元，同比增長1 944.6%；中國低度酒市場到2035年或?qū)⒊^2 500億元。氨基酸是酒、醋中重要的營養(yǎng)與呈味物質(zhì)，與原料中的糖類、有機酸和揮發(fā)性成分協(xié)同賦予了特殊的味感（如酸、甜、苦、鮮、澀）；而氨基酸的種類及濃度對果酒、果醋香氣的復雜性有直接的影響[11]，其中氨基酸對食醋的酸味具有緩沖作用，使其更加柔和、鮮美、醇厚[12]。因此，闡明發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸組成差異及呈味分析，對于指導發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。

課題組前期研究對（低度）甘蔗果酒、甘蔗醋的發(fā)酵工藝及發(fā)酵風味進行優(yōu)化[7-8，13]。以甘蔗混合汁為原料，采用甘蔗低度酒、甘蔗醋的工藝發(fā)酵制備得到甘蔗果酒、甘蔗醋，對甘蔗發(fā)酵制品中氨基酸的變化進行分析，通過分析甘蔗汁、甘蔗果酒、甘蔗醋中氨基酸總量、必需氨基酸、呈味氨基酸等組成及含量，根據(jù)氨基酸平衡理論，采用氨基酸比值系數(shù)法綜合評價甘蔗發(fā)酵制品的營養(yǎng)價值，為甘蔗多樣化產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：甘蔗汁、甘蔗果酒、甘蔗醋，廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所制備提供。

試劑：鹽酸、苯酚、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、茚三酮等，優(yōu)級純；超純水，自制。

氨基酸的進口標準品（Wako）：門冬氨酸（L-Aspartic Acid）、蘇氨酸（L-Threonine）、絲氨酸(L-Serine）、谷氨酸（L-Glutamic Acid）、脯氨酸（L-Proline）、甘氨酸（Glycine）、丙氨酸（L-Alanine）、胱氨酸(L-Cystine）、纈氨酸(L-Valine）、蛋氨酸（L-Methionine）、異亮氨酸（L-Isoleucine）、亮氨酸（L-leucin）、酪氨酸（L-Tyrosine）、苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、賴 氨 酸(L-Lysine）、組 氨 酸（L-Histidine）、精氨酸（L-Arginine），混合標準溶液，北京世紀奧科生物技術有限公司提供。

儀器：L-8900型全自動氨基酸分析儀、磺酸型陽離子樹脂分離柱（4.6 mm ID×60 mm，3 μm），日本HITACHI公司產(chǎn)品；GR-202型分析天平，日本A&D有限公司產(chǎn)品；CAHT-50L型超純水器，北京中科智恒科技有限公司產(chǎn)品；GM-0.5A型隔膜真空泵，天津津騰實驗設備有限公司產(chǎn)品；D3500S-DTH型超聲波清洗器，必能信超生（上海）有限公司產(chǎn)品；VORTEX GENIUS 3型渦旋振蕩器，德國IKA公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 氨基酸組成測定

參照GB/T 5009.124—2016食品中氨基酸的測定方法，吸取樣品2.000 g進行酸水解，水解后的溶液過0.22 μm濾膜，所得濾液進行氨基酸分析，每個樣品平行3次。

（1）標準溶液制備。準確吸取0.4 mL（精確至0.001 mL）氨基酸的混合標準品，以0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 mL，制得0.1 μmol/mL混合標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（2）色譜條件。色譜柱為磺酸型陽離子樹脂分離柱，4.6 mm ID×60 mm，3 μm；緩沖液流速0.40 mL/min；顯色劑溶液流速0.35 mL/min；檢測波長570 nm，440 nm；分離柱溫度59℃；反應溫度135℃；進樣量20 μL；最低檢測靈敏度3 pmol；適宜樣品濃度2 nmol/20 μL。

1.2.2 營養(yǎng)評價

根據(jù)氨基酸比值系數(shù)法[14]，將甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中的氨基酸組成，與1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）/世界衛(wèi)生組織（WHO）/提出的人體必需氨基酸模式進行對比，通過公式（1）～（3）計算樣品中必需氨基酸（EAA）的氨基酸比值（RAA）、氨基酸比值系數(shù)（RC）和氨基酸比值系數(shù)分（SRC）。

式中：待評價蛋白質(zhì)某必需氨基酸含量與WHO/FAO模式中相應必需氨基酸含量均以1 g蛋白質(zhì)中的量計，mg/g；

RAA——樣品中某種必需氨基酸的含量相當于模式中相應必需氨基酸的多少倍。

式中：RC=1——該種必需氨基酸的含量比例與模式氨基酸一致；

RC＞1——該種必需氨基酸的含量相對過剩；

RC＜1——該種必需氨基酸的含量相對不足。其中，RC值最低者為第一限制性氨基酸（FLAA）。

式中：CV——RC的相對標準偏差。SRC的意義：如果蛋白質(zhì)中必需氨基酸的組成比例與必需氨基酸模式一致，則CV=0，SRC=100；若蛋白質(zhì)的RC值越分散，那么這些必需氨基酸在氨基酸平衡生理作用方面所提供的負作用越大，則CV值變大，SRC值變小，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值越差。相比較而言，SRC值越接近100，其營養(yǎng)價值越高[15]。

1.2.3 風味氨基酸及滋味強度

（1）風味氨基酸組成。食品中影響風味的氨基酸主要分為鮮味和酸味氨基酸（Sour and MSG-like Amino Acids，SMAA）、甜味氨基酸（Sweet Amino Acids，SAA）和苦味氨基酸（Bitter Amino Acids，BAA）三大類[16]。其中，鮮味和酸味氨基酸以谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）含量之和計。甜味氨基酸：以蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）之和計?？辔栋被幔豪i氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、組氨酸（His）之和計。

（2）滋味強度值。滋味物質(zhì)的味道強度值[17]（Taste Activity Value，TAV）的計算公式如下：

式中：TAV——味道強度值；

C——滋味物質(zhì)的絕對濃度值，mg/100 g；

T——滋味物質(zhì)的閾值，mg/100 g。

通常認為，TAV值大于1時，該物質(zhì)能夠?qū)υ摌悠返某饰队胸暙I，且數(shù)值越大，貢獻越大；相反，當比值小于1時，說明該物質(zhì)對呈味貢獻不大，呈味作用不顯著。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理和繪圖，IBM SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性方差分析，采用Duncan檢驗方法（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗發(fā)酵制品氨基酸成分變化分析

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中游離氨基酸組成及質(zhì)量濃度見表1。

由表1可知，甘蔗汁的總氨基酸（TAA）最高，其次是甘蔗果酒，甘蔗醋最低；而必需氨基酸質(zhì)量濃度最高是甘蔗果酒，其次是甘蔗醋，最少是甘蔗汁，其中甘蔗果酒、甘蔗醋的必需氨基酸（EAA）占總氨基酸（TAA）分別是43.58%，43.53%，高于FAO/WTO標準蛋白的必需氨基酸含量36.0%。非必需氨基酸（NEAA）含量最高是甘蔗汁，占總氨基酸的20.23%，而甘蔗果酒、甘蔗醋含量依次較低，分別占總氨基酸的77.26%，77.08%，超過FAO/WHO提出的氨基酸模式60%以上。根據(jù)食品風味氨基酸的分類及含量結(jié)果，甘蔗汁的主要風味氨基酸是鮮味氨基酸（SMAA），其質(zhì)量濃度最高為487.30 mg/100 mL（p＜0.05），其次是苦味氨基酸（BAA）和甜味氨基酸（SAA）；甘蔗果酒和甘蔗醋的主要風味氨基酸是苦味氨基酸（BAA），甜味氨基酸次之，鮮味氨基酸相對較少。

表1 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中游離氨基酸組成及質(zhì)量濃度/mg·（100 mL）-1

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的17種氨基酸對比見圖1。

由圖1可知，分別對甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的17種氨基酸進行百分比對比。甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中主要的氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸，分別占甘蔗汁總氨基酸的58.9%，10.4%，占甘蔗果酒總氨基酸的11.4%，10.3%和占甘蔗醋總氨基酸的12.3%，10.5%，其他的氨基酸分別占甘蔗汁的1.0%～3.0%，占甘蔗果酒的3.0～6.0%，占甘蔗醋的2.0%～6.0%。

圖1 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的17種氨基酸對比

甘蔗汁經(jīng)酒精發(fā)酵制備的甘蔗果酒，其所含氨基酸中除了天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸的含量顯著降低外，大部分含量都比甘蔗汁中的有不同程度增加，尤其是酪氨酸、賴氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量明顯增加。

這與甘蔗汁在酒精發(fā)酵過程中，釀酒酵母利用甘蔗汁中的糖源和氨基酸合成結(jié)構性和功能性蛋白質(zhì)，用來生長酵母菌體及合成酶類，也作為酵母所需的氮源供給[18]，隨著甘蔗汁酒精發(fā)酵，甘蔗汁中的蔗糖受熱水解成葡萄糖和果糖。葡萄糖經(jīng)酶類催化、戊糖磷酸途徑、糖酵解途徑代謝生成組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、胱氨酸和甘氨酸；隨著甘蔗汁中葡萄糖繼續(xù)分解生成的丙酮酸，與谷氨酸在生物酶的作用下合成丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸；天冬氨酸和谷氨酸作為微生物發(fā)酵中主要的生物合成氨基酸，氨基酸進入檸檬酸（三羧酸）循環(huán)代謝[19]，天冬氨酸經(jīng)參與發(fā)酵代謝活動后，其含量明顯降低。作為必需氨基酸之一的賴氨酸，其生物合成起源于α-酮戊二酸，在發(fā)酵中與蘇氨酸有相互競爭抑制的作用；由于甘蔗汁中含有蘇氨酸，參與釀酒酵母的代謝活動較少，從而提高甘蔗果酒中α-酮戊二酸合成賴氨酸的含量[20]。與報道的果酒發(fā)酵中各類氨基酸含量的變化趨勢有所不同，這可能與原果中所含有的糖原有關系[21]。因此，甘蔗汁發(fā)酵成甘蔗果酒的總氨基酸及其天冬氨基酸的含量明顯降低，其他氨基酸種類及含量呈現(xiàn)不同程度的增加或降低的變化。

而甘蔗醋在酒用酵母和醋酸菌的先后作用下進行發(fā)酵，所得的醋液同比甘蔗汁，其氨基酸中天冬氨酸、谷氨酸和蛋氨酸的含量降低，同時脯氨酸和絲氨酸含量也有少許降低；其他氨基酸的含量提高了10%～80%，如甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸。這與山西老陳醋經(jīng)發(fā)酵后各氨基酸有不同程度的增加變化結(jié)果一致，各類氨基酸參與醋酸發(fā)酵代謝活動，而且甘蔗醋中的氨基酸含量的增加主要來源于酒精發(fā)酵[22]。研究發(fā)現(xiàn)，不同的微生物分類群與不同的氨基酸化合物具有相關性[23]。

2.2 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的營養(yǎng)成分評價

采用氨基酸的組成比值系數(shù)法對比甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的各種必需氨基酸營養(yǎng)成分變化，并進行營養(yǎng)評價。

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分數(shù)見表2，甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸的RAA、RC和SRC的比較見表3。

表2 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分數(shù)

表3 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中必需氨基酸的RAA、RC和SRC的比較

由表2可知，通過與FAO/WHO的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸的模式譜進行比較，甘蔗果酒和甘蔗醋的必需氨基酸組成中異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸都高于FAO/WHO的模式譜，其中甘蔗果酒中賴氨酸比值比FAO/WHO的模式譜高達4.21%，甘蔗醋中纈氨酸比FAO/WHO的模式譜高出1.94%，甘蔗果酒和甘蔗醋的蛋氨酸+半胱氨酸占比均低于WHO/FAO模式譜，甘蔗果酒和甘蔗醋的必需氨基酸占總氨基酸比值都相差不多；而甘蔗汁的必需氨基酸占比均低于WHO/FAO模式譜。這可能與甘蔗在酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵過程中，酵母利用甘蔗汁中的糖原、蛋白質(zhì)等成分進行生物代謝產(chǎn)物或發(fā)酵完全后酵母細胞自溶有密切聯(lián)系[20]。這與軟棗獼猴桃的鮮果、果酒的營養(yǎng)評價結(jié)果類似[24]，果酒的營養(yǎng)價值比原果汁的要高些。

由表3可知，蛋氨酸+半胱氨酸是甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的第一限制性氨基酸。甘蔗汁的蘇氨酸RC值最高，且與異亮氨酸、纈氨酸均符合WHO/FAO參考氨基酸模式；甘蔗果酒和甘蔗醋中賴氨酸RC值高，且與異亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸符合WHO/FAO參考氨基酸模式，亮氨酸略低于WHO/FAO參考氨基酸模式。從氨基酸比值系數(shù)分（SRC）來看，甘蔗汁的SRC最高（69.66），比甘蔗果酒、甘蔗醋的SRC約高出10.0，說明甘蔗汁的營養(yǎng)價值比甘蔗果酒、甘蔗醋要高，但從必需氨基酸的配比上看，甘蔗果酒和甘蔗醋的配比更趨于合理，如賴氨酸是組成人體蛋白質(zhì)的必需氨基酸之一，必須從食物中攝取補充，在加工過程中極易被破壞[25]，但從甘蔗汁發(fā)酵制備成甘蔗果酒、甘蔗醋，其賴氨酸的RC均比甘蔗汁的RC高，這說明通過發(fā)酵加工，甘蔗汁發(fā)酵制備的甘蔗果酒、甘蔗醋必需氨基酸營養(yǎng)更均衡，具有一定的營養(yǎng)食用價值。

2.3 甘蔗制品呈味強度分析

根據(jù)風味氨基酸的分類方法，將各類風味氨基酸對照其在水中的呈味閾值計算出各自的TAV值。

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中氨基酸的呈味分析見表4。

表4 甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中氨基酸的呈味分析

由表4可知，甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味分布不一，甘蔗汁的主要呈味分布是鮮味氨基酸＞苦味氨基酸＞甜味氨基酸；甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味分布是苦味氨基酸＞鮮味氨基酸＞甜味氨基酸。甘蔗汁中對滋味物質(zhì)有貢獻的氨基酸種類有2種，TAV值最高的為天冬氨基酸（4.14），其次是谷氨酸（2.44）；甘蔗果酒中滋味物質(zhì)有貢獻的氨基酸也有2種，TAV值最高的為谷氨酸（1.86），其次是賴氨酸（1.05）；甘蔗醋中滋味物質(zhì)有貢獻的氨基酸只有1種，為谷氨酸（1.28）。谷氨酸在甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的TAV值中均為較高值，說明是這三者的主要滋味貢獻氨基酸。

氨基酸分類中苦味氨基酸種類最多，甜味氨基酸其次，鮮味氨基酸種類最少[26]。但是，甘蔗汁和甘蔗醋中鮮有苦味感，因苦味氨基酸如苯丙氨酸、異亮氨酸等，當其含量低于呈味閾值時，可增強其他呈味氨基酸的鮮味和甜味，如苦味氨基酸精氨酸，有增加呈味復雜性和提高鮮度的作用[27]。

3 結(jié)論

以甘蔗混合汁為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵制備甘蔗果酒、甘蔗醋制品。通過對甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋中氨基酸進行對比分析與評價。甘蔗汁中氨基酸含量豐富，總氨基酸最高，必需氨基酸所占比例較少；甘蔗果酒、甘蔗醋的總氨基酸有所減少，但必需氨基酸所占比值較高，且都高于FAO/WHO的模式譜。蛋氨酸和半胱氨酸是甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的第一限制性氨基酸。甘蔗汁的SRC最高，明顯比甘蔗果酒、甘蔗醋的SRC高；而甘蔗果酒、甘蔗醋，其賴氨酸的RC均比甘蔗汁的RC高；綜合從必需氨基酸的配比考慮，甘蔗果酒和甘蔗醋的更趨于合理，可與其他飲品搭配調(diào)制食用或開發(fā)新產(chǎn)品，提高產(chǎn)品中營養(yǎng)生物效價。

甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味氨基酸分布不一，甘蔗汁的主要呈味分布是鮮味氨基酸＞苦味氨基酸＞甜味氨基酸，甘蔗果酒和甘蔗醋的呈味分布是苦味氨基酸＞鮮味氨基酸＞甜味氨基酸。谷氨酸是甘蔗汁、甘蔗果酒和甘蔗醋的主要滋味貢獻氨基酸，TAV在1.3～2.4。

研究在前期果酒、果醋研究的基礎上，從產(chǎn)品的氨基酸組成及其營養(yǎng)價值和呈味上分析，初步探索甘蔗果酒、甘蔗醋的必需氨基酸營養(yǎng)組成，具有一定的營養(yǎng)價值。由于是從氨基酸的組成及含量對產(chǎn)品的呈味進行分析，但氨基酸對酒、醋發(fā)酵的微生物群落演替及風味差異的影響尚不明確，還需進一步進行研究。研究結(jié)果可為甘蔗多樣化產(chǎn)品開發(fā)，以及產(chǎn)品營養(yǎng)與特征風味提供理論依據(jù)，并為果酒、果醋研究營養(yǎng)成分與微生物群落特征相關基礎。