HPLC測定陜產紅茴香葉中莽草酸的含量

李 霞，黃東萍，趙苗苗，李崇勇，何 潔，王仕寶，崔艷麗

（1.漢中職業(yè)技術學院農林技術與生物工程學院，陜西 漢中 723000；2.漢中食品藥品檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000；3.漢中職業(yè)技術學院 藥學院，陜西 漢中 723000；4.漢中職業(yè)技術學院 秦巴山區(qū)藥（食）用植物研究所，陜西 漢中 723000；5.漢中職業(yè)技術學院 基礎課教學部，陜西 漢中 723000）

紅茴香（Illicium henryi Diels）又名紅毒茴，系木蘭科八角屬植物，為中國所特有，生于海拔300～2 200 m的丘陵或山地溝谷、溪邊濕潤常綠闊葉林中或林緣[1]，主產于陜西、甘肅、云南、廣西等地。第4次全國中藥資源普查陜西寧強縣普查隊在普查中發(fā)現(xiàn)，紅茴香在寧強縣等陜南區(qū)域分布廣泛，在民間經常替代八角茴香作為調味品食用。

莽草酸（Shikimic acid），又名毒八角酸，是可有效應對禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒藥物-達菲的重要原料[2]。另外，還可作為抗病毒和抗癌藥物中間體[3]。莽草酸（SA）在生物活性方面具有較高的開發(fā)利用價值，其主要通過影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集、動、靜脈血栓及腦血栓形成；其次，莽草酸具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[4]。莽草酸（SA）廣泛存在于木蘭科八角屬植物的果實中，因此對果實中莽草酸（SA）的提取分離、含量檢測等方面文獻報道較多，而對其葉子中活性成分及資源的開發(fā)利用研究相對較少。在陜南巴山區(qū)域，野生紅茴香分布較廣，但是對資源的開發(fā)利用相對單一，主要集中于果實作為調味品自采自用，對于其他部位（如葉子等）資源均廢棄未用?；谝陨锨闆r，就陜產紅茴香葉中的莽草酸（SA）含量進行測定，從而為該地區(qū)大量的紅茴香資源的開發(fā)利用做好基礎研究工作。

1 儀器材料與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀、LC-20AT型輸液泵、SPD-M20A型二極管陣列檢測器、KQ-800E型超聲波清洗器、HL-500A型高速多功能粉碎機、MS105DU型電子天平（d=0.01 mg）等。

莽草酸（SA）對照品，北京華工科創(chuàng)生物技術有限公司提供（批號AF8102671，純度98%）。試驗材料于2020年10月采自陜西寧強縣大安鎮(zhèn)，經漢中職業(yè)技術學院秦巴山區(qū)（食）藥用研究所王仕寶副教授鑒定為木蘭科植物紅茴香的葉，自然干燥后保存，備用。

2 結果與分析

2.1 色譜條件

色譜柱：Hedera NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-水（用磷酸調pH值3.5）（40∶60），流速1 mL/min，檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

紅茴香對照品與樣品色譜圖見圖1。

圖1 紅茴香對照品與樣品色譜圖

2.2 溶液制備

（1）對照品貯備液。取莽草酸（SA）對照品適量，精密稱定，至25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品貯備液（質量濃度為556.25 μg/mL）。

（2）供試品溶液的制備。取干燥后的紅茴香葉粉碎，過2號篩，取0.25 g精密稱定，至100 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考查

2.3.1 提取方法考查

（1）粉碎粒度考查。供試品粉碎后分別過1號篩、2號篩、3號篩、4號篩。

不同粒度供試品中莽草酸含量的測定見圖2。

圖2 不同粒度供試品中莽草酸含量的測定

通過比較不同過篩粒度，根據(jù)試驗結果確定粉碎粒度為過2號篩較為適宜。

（2）溶劑考查。供試品粉碎后過2號篩，分別用體積分數(shù)為50%乙醇、95%乙醇、50%甲醇、100%甲醇，以及水溶液為溶劑進行提取。

不同提取溶劑供試品中莽草酸含量的測定見圖3。

圖3 不同提取溶劑供試品中莽草酸含量的測定

通過比較不同的提取溶劑，最后根據(jù)試驗結果確定樣品提取溶劑為100%甲醇較為適宜。

（3）提取時間考查。供試品粉碎后過2號篩，以甲醇為提取劑，分別超聲時間10，20，30，40 min提取。

不同提取時間供試品中莽草酸含量的測定見圖4。

圖4 不同提取時間供試品中莽草酸含量的測定

通過比較不同的提取時間，最后根據(jù)試驗結果確定樣品超聲提取時間為30 min較為適宜。

2.3.2 線性范圍考查

精密量取莽草酸貯備液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分別加入在50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。制成質量濃度分別為5.56，11.13，22.25，55.63，111.25 μg/mL的系列標準溶液，分別注入液相色譜測定峰面積，以莽草酸的質量濃度為橫坐標X，以峰面積值為縱坐標Y作圖，得回歸方程Y=52 669.3X-33 000.2，R=0.999 9。結果表明，莽草酸進樣量在5.56～111.25 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 重復性試驗

分別制備供試品5份進行測定。

供試品重復試驗見表1。

表1 供試品重復試驗

RSD=1.8%，表明具有較好的重復性。

2.3.4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液分別于0，6，12，24，48 h進樣測定，記錄峰面積。RSD=0.8%，結果表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗

分別精密稱取9份已知含量的供試品適量，精密加入貯備液適量，各份均依樣品溶液的制備項下制樣方法制備供試品溶液。

加樣回收率（n=9）見表2。

表2 加樣回收率（n=9）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依2.3方法制備供試品溶液，在2.1色譜條件測定，記錄峰面積值，并用2.3.2回歸方程計算其含量，測定結果分別為14.64，14.75，14.69 mg/g，平均含量為14.69 mg/g。

3 結論

（1）木蘭科八角屬植物中，除栽培的八角（Illicium verum Hook f.）外，其他野生種類的果實大多有毒，甚至劇毒。因此，第一，切不可將野八角作為食用調料的八角收購或使用；第二，對八角的種類鑒別和基原考證顯得尤為重要，特別是由于紅茴香和紅毒茴的中文名稱經?；ビ茫栽诿耖g也出現(xiàn)混淆的情況。結合文獻[5-6]及中國植物志[7]，發(fā)現(xiàn)紅茴香和紅毒茴是2個不同的種類，紅茴香（Illicium henryi Diels）又稱紅毒茴、披針葉茴香、莽草（古名）等；紅毒茴（Illicium lanceolatum A.C.Smith.）又稱紅茴香、披針葉茴香、莽草、窄葉紅茴香、披針葉八角等。另外，八角屬（Illicium）植物中，部分種類具有藥用價值[8]。在民間調查中，發(fā)現(xiàn)紅茴香的果實、根皮及葉均為藥用，主要治療跌打損傷、瘀血腫痛、風濕痛等痹證。關于八角屬植物中的莽草酸（SA），除了抗病毒之外，還具有抗腫瘤和對心血管系統(tǒng)的作用[9]。近期文獻報道，莽草酸（SA）還可作為一種有效的組織再生劑，在人類人工皮膚模型中證實能夠促進傷口愈合和增強真皮重建的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)資木瓜中莽草酸（SA）通過減少RBL-2H3細胞脫顆粒抑制大鼠軟骨細胞分化[10]。

（2）藥材中有效成分的提取方法多樣，該紅茴香樣品在前期試驗中探究了回流、超聲、浸漬、微波輔助及索氏提取等方法，通過比較紅茴香葉中莽草酸（SA）提取得率，選擇了超聲提取方法較為適宜。此外，考查了單因素對提取得率的影響，最后綜合試驗結果確定紅茴香葉過2號篩子，溶劑為100%甲醇，提取時間、次數(shù)分別為30min和2次。另據(jù)文獻報道[11]，用二極管陣列檢測器在一定條件下，分析了莽草酸（SA）對照品色譜峰及樣品中目標組分對應色譜峰的紫外光譜，確定莽草酸（SA）在波長210 nm處有最大吸收。因此，選擇210 nm作為檢測波長，根據(jù)實際液相檢測效果分析，既可對目標成分進行準確分析，又可將相關物質有效檢出，從而較為準確地反映出樣品中的信息，故選擇210 nm作為檢測波長較為適宜。結合對流動相的優(yōu)化，確定乙腈-水（用磷酸調pH值3.5）（40∶60），色譜峰分離較好，拖尾現(xiàn)象較少，故以乙腈-水的磷酸溶液作為流動相。此外，色譜柱：Hedera NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 mL/min，檢測進樣量20 μL。最后通過綜合比較，對目標成分莽草酸（SA）檢測效果較好，測定值穩(wěn)定可靠。