黃鰭棘鯛IGF-2基因克隆及IGF-1/2在胚胎發(fā)育過程中的表達特性分析

崔淼，李鈺杰，楊永春，張佳穎，許鮮姬，林李泉，林國榮，張其中，許德麟

( 1. 暨南大學 生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；2. 陽西縣恒生水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，廣東 陽江 529825；3. 陽江市國榮水產(chǎn)科技有限公司，廣東 陽江 529825)

1 引言

類胰島素樣生長因子（Insulin-like Growth Factors，IGFs）是一類參與脊椎動物生長、生殖和免疫等過程的調(diào)控因子，相較于胰島素，IGFs多一個功能域D。IGFs主要由肝臟細胞表達生成，然后通過內(nèi)分泌及旁分泌的方式運輸?shù)綑C體各個部位，介導生長激素（Growth Hormone, GH）發(fā)揮生理功能，從而促進肌肉組織的生長和肌纖維細胞的增殖，對于魚類的生長發(fā)育具有重要作用[1]。硬骨魚IGFs基因序列相繼在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[2]、斑馬魚（Danio rerio）[3]、鯉魚（Cyprinus carpio）[4]等成魚中被克隆報道，但一直未見其在胚胎發(fā)育中的作用研究。直到Fukenstein等[5]首次在大西洋鯛（Sparus aurata）卵子和受精卵發(fā)育不同時期檢測到了IGF-1基因，才明確IGF-1基因參與了調(diào)控胚胎的發(fā)育過程；此后，White等[6]發(fā)現(xiàn)敲除斑馬魚的IGF-2基因會導致胚胎死亡。由此可見，IGFs基因在硬骨魚類胚胎發(fā)育的調(diào)控過程中發(fā)揮著至關重要的作用。

黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）屬鱸形目、鯛科、棘鯛屬，為淺海暖水性底層魚類，生活在近岸海域及河口灣，常見于我國東南沿海[7-8]。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，深受廣大消費者的喜愛，是沿海地區(qū)最有推廣潛力的海水魚類養(yǎng)殖品種之一。黃鰭棘鯛繁殖期為每年的9-12月，雌魚繁殖期多次產(chǎn)卵[9-10]。鄭運通等[11-12]、Leu和Chou[13]完成了黃鰭棘鯛的人工繁殖以及種苗培育，Li等[14]和Zhou等[15]對黃鰭棘鯛性腺發(fā)育進行了研究，為黃鰭棘鯛規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖提供了理論基礎。目前，關于黃鰭棘鯛的生長相關基因研究絕大多數(shù)限于成魚之中[16-20]，在胚胎發(fā)育中的作用和機制研究相對較少。本文擬通過對黃鰭棘鯛早期胚胎發(fā)育全過程的跟蹤觀察，掌握其胚胎發(fā)育階段不同組織器官的特征變化規(guī)律，在克隆獲得黃鰭棘鯛IGF-2基因的基礎上，了解IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛胚胎中的表達特征，為研究IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛早期發(fā)育中的生理功能提供基礎資料。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

選擇體長為（14±3）cm，體重為（135±30）g的成魚，每5條作為一個混樣，每個樣本設3個平行，采樣前先進行MS-222（40 mg/L）麻醉，然后取新鮮肝臟組織，放入經(jīng)過DEPC水處理過的凍存管中，置于液氮中，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。黃鰭棘鯛海捕親魚來源于南海不同海域，選擇體質(zhì)健壯、體表光滑無傷痕、顏色鮮艷、活力大的個體，雄性個體體重大于250 g，雌性個體體重大于400 g，共286條，在廣東省陽江市恒生水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社海上網(wǎng)箱中進行強化培育。

采用絨毛膜促性腺激素（HCG）和促黃體素釋放激素（LRH-A）混合注射入背部肌肉，雌魚HCG注射量為600 IU/kg，LRH-A注射量為10 μg/kg；雄魚注射量為雌魚的一半，分兩次注射，間隔24 h。將5條雌性親魚與10條雄性親魚一同放入產(chǎn)卵池中，在水溫為（27±1）℃，鹽度為28，pH為8.0的情況下，采用避光、流水刺激的方法使親魚正常產(chǎn)卵受精。在孵化池的出水口收集受精卵，隨機取樣放入顯微鏡下觀察，確保受精卵發(fā)育同步性，然后將受精卵轉移至500 L的孵化桶中，在水溫為（26.5±0.5）℃，鹽度為28，pH為8.0的情況下，微充氣孵化。用燒杯于孵化桶中撈取適量受精卵，用吸管吸取胚胎（不少于30粒），在Nikon E100生物顯微鏡下連續(xù)觀察并拍照記錄。參考劉鑒毅等[21]的方法，當視野中50%以上個體發(fā)育至某階段時，所用時間即為發(fā)育到該階段的時間。當胚胎到達一個發(fā)育階段后，對該階段胚胎進行取樣，每次取樣分為3個平行，每個平行不少于50粒，用DEPC水沖洗干凈，放入液氮中冷凍保存。

2.2 實驗方法

2.2.1 引物設計與合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取到斜帶石斑魚（Epinephelus coioides，AY552787.1）、金錢魚（Scatophagus argus，XM_046394064.1）、羅非魚（Oreochromis niloticus，XM_025908435.1）、大 西 洋 鯛（S. aurata，EF563836.1）的IGF-2基因mRNA序列，利用BioEdit軟件進行序列比對，獲得IGF-2基因的保守區(qū)域，運用Primer Premier 5 設計保守區(qū)域引物，對黃鰭棘鯛IGF-2基因保守區(qū)域進行擴增測序，擴增反應體系總體積為25 μL：

10×KOD Buffer 2.5 μL，dNTPs Mixture（2 mmol/L）2.5 μL，MgSO4（25 mmol/L）1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 16.75 μL，KOD-Plus Neo 0.25 μL。PCR反應條件為94°C 4 min；98°C 10 s，52～64°C 30 s，68℃ 40 s，35個循環(huán)； 68°C 延伸7 min，4℃保存。以IGF-2基因保守區(qū)域序列作為基礎，設計并合成用于5′RACE與3′RACE擴 增所需的 特 異性引物，引物合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。引物序列詳見表1。

2.2.2 總RNA提取與第一鏈cDNA的合成

參照Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）說明書，提取黃鰭棘鯛肝與各胚胎發(fā)育階段的總RNA，按照MMLV Reverse Transcriptase試劑盒（Promega，美國）說明書，以Oligo(dT)作為引物，反轉錄合成第一鏈cDNA。同時根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′Kit試 劑 盒（TaKaRa，日本）說明書，以黃鰭棘鯛肝的RNA作為模板合成5′和3′ RACE-ready cDNA。

2.2.3 黃鰭棘鯛IGF-2基因克隆

以反轉錄獲得的第一鏈cDNA作為模板，用引物IGF-2-F與IGF-2-R進行梯度PCR。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測后，按照DNA凝膠回收試劑盒（Omega，美國）說明書，將PCR產(chǎn)物進行純化，連接到pMD?18-T（TaKaRa，日本）質(zhì)粒上，轉化進DH5α中，挑取單克隆菌落，經(jīng)菌液PCR檢測后，篩選出陽性菌，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，擴增反應體系總體積為25 μL：10×Buffer（含2.5 mmol/L MgCl2）2.5 μL，dNTPs Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，M13F-47（10 μmol/L）0.5 μL，M13R-48（10 μmol/L）0.5 μL，菌液1 μL，ddH2O 18.375 μL，rTaq 0.125μL。PCR 反應條件為94°C 3 min；94°C 30 s，55°C 30 s，72℃ 90 s，32個循環(huán)；72°C 延伸10 min，4℃保存。以5′RACE-ready cDNA和3′RACE-ready cDNA作為模板，采用特異性引物與通用引物進行巢式PCR擴增，擴增反應體系總體積為25 μL：10×KOD Buffer 2.5μL，dNTPs Mixture（2 mmol/L）2.5 μL，MgSO4（25 mmol/L）1.5 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，5′/3′RACE-ready cDNA 0.5 μL，ddH2O 16.75 μL，KOD-Plus Neo 0.25 μL。PCR 反應條件為94°C 4 min；98°C 10 s，50～64°C 30 s，68℃ 60 s，35個循環(huán)；68°C延伸7 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物操作同上。運用DNAMAN軟件將測序結果拼接，得到黃鰭棘鯛IGF-2基因cDNA序列。

2.2.4 生物信息學分析

運用NCBI數(shù)據(jù)庫在線分析黃鰭棘鯛IGF-2基因的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），并將其翻譯成相應的氨基酸序列，利用NCBI的Blast功能對IGF-2基因核苷酸與氨基酸進行序列相似性比對和分析，利用Expasy（http://web.expasy.org/）在線分析IGF-2基因的分子量、分子式、等電點等生物信息，利用MEGA X軟件進行氨基酸序列比對，并基于鄰接（Neighbour-joining，NJ）法構建IGF-2進化樹。用于IGF-2氨基酸序列分析、同源性比對和構建系統(tǒng)進化樹的基因序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫下載。

2.2.5 黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育階段IGF-1和IGF-2基因表達

根據(jù)已克隆得到的IGF-2基因以及前期報道的IGF-1基因序列[18]，設計用于qPCR的特異性引物。使用Bio-Rad CFX96TMReal Time System 平臺，參照SYBR?Green Real Time PCR MIX試劑盒（TOYOBO，日本）說明書，采用20 μL體系（SYBR?Green Real Time PCR MIX 10 μL，cDNA 1 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DEPC水8.2 μL），以實時qPCR法對IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育各階段的表達量進行測定。反應程序為預變性94℃ 3 min；94℃15 s, 60℃ 15 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因[20]，校正各基因的反轉錄效率，采用2-ΔΔct方法計算IGF-1和IGF-2在各胚胎發(fā)育時期中的相對表達量。

2.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0通過單因素方差分析和Duncan多重比較進行均值計算和顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，結果采用平均值±標準誤表示，設置3個平行實驗。

3 結果分析

3.1 黃鰭棘鯛IGF-2基因克隆及序列分析

利用保守區(qū)域特異性引物擴增獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉化等處理后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，確定為黃鰭棘鯛IGF-2基因保守區(qū)片段。根據(jù)此序列，進行3′RACE和5′RACE PCR擴增反應，得到IGF-2基因部分cDNA片段，經(jīng)過拼接，得到黃鰭棘鯛IGF-2基因cDNA全長序列（圖1）。黃鰭棘鯛IGF-2基 因cDNA包括148 bp的5′端 非 編 碼 區(qū)（5′UTR），940 bp的3′端非編碼區(qū)（3′UTR），以及648 bp的ORF，共編碼215個氨基酸殘基。對IGF-2基因編碼的蛋白質(zhì)進行生物信息學分析，結果顯示該蛋白質(zhì)中精氨酸（Arg）含量最高，為10.7%，其次為亮氨酸（Leu），含量為10.2%，色氨酸（Trp）含量最少，僅為0.5%。預測蛋白分子量為24.67 kDa, 理論等電點為10，不穩(wěn)定指數(shù)為68.58，脂肪指數(shù)為79.81，蛋白質(zhì)前52個氨基酸為信號肽，IGF-2功能區(qū)具有58個氨基酸，后105個氨基酸為結構域E。

圖1 黃鰭棘鯛IGF-2基因全長序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 Complete sequence of IGF-2gene cDNA and deduced amino acid sequence from Acanthopagrus latus

3.2 黃鰭棘鯛IGF-2基因氨基酸序列的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

黃鰭棘鯛IGF-2基因氨基酸序列經(jīng)過Blast檢索發(fā)現(xiàn)，IGF-2基因在魚類中高度保守（圖2），與同為鱸形目的大西洋鯛、三長棘赤鯛（Pagrus auriga）高度相似，一致性高達95%以上，與牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）一 致 性 在80%以上，與斑馬魚的一致性為78.2%，但與其他脊椎動物一致性較低，與野豬（Sus scrofa）的一致性為42.2%，與人（Homo sapiens）和獼猴（Macaca mulatta）的一致性僅為36.7%和35.8%。將黃鰭棘鯛與Gene-Bank中已發(fā)表的其他物種的IGF-2基因氨基酸序列進行比對，構建系統(tǒng)進化樹（圖3），基于系統(tǒng)進化樹可知，黃鰭棘鯛與其他硬骨魚類聚為一簇，兩棲類則和哺乳類聚為一簇。其中，黃鰭棘鯛先與大西洋鯛、沙重牙鯛（Diplodus sargus）聚為一支，三者在遺傳距離上最近，其次與三長棘赤鯛、牙鲆和大菱鲆等聚為一簇，與哺乳類動物和兩棲動物遺傳遺傳距離較遠，這與氨基酸序列同源性比較結果一致。

3.3 黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育觀察

黃鰭棘鯛受精卵在水溫為（26.5±0.5）℃，鹽度為28，pH為8.0的條件下，完成整個胚胎發(fā)育過程共用時25.5 h。在水體不充氣的狀態(tài)下，黃鰭棘鯛受精卵在不同鹽度的海水中分布不同，當鹽度大于32時，受精卵漂浮于水面；當鹽度小于24時，受精卵沉在水底；當鹽度為26～30時，受精卵懸浮于水中。黃鰭棘鯛受精卵卵裂方式為盤狀卵裂，卵裂僅在胚盤上進行，卵黃不參與分裂。黃鰭棘鯛卵受精后，卵周隙變小，受精卵卵徑為（0.900±0.050）mm，內(nèi)有一個直徑為（0.250±0.020）mm的油球。受精后，在動物極可觀察到一扁平帽狀結構，稱為胚盤，卵黃向植物極集中，原生質(zhì)逐漸向動物極轉移，胚盤開始隆起，大約40 min后在胚盤頂部中央產(chǎn)生一分裂溝，即第一次細胞分裂，最終形成兩個均等的細胞（圖4a）。55 min后開始第二次細胞分裂，在細胞頂部中央出現(xiàn)與第一次細胞分裂相垂直的分裂溝，形成4個大小相似的細胞（圖4b），1 h 10 min后，在第一次分裂溝兩邊，各出現(xiàn)一條與之相平行的分裂溝，形成8個細胞（圖4c）。然后繼續(xù)分裂，依次進入16細胞期（圖4d）、32細胞期（圖4e）、64細胞期（圖4f）和多細胞期（圖4g）。隨著細胞分裂次數(shù)不斷增多，細胞多而呈不規(guī)則排列，3 h 20 min后進入桑葚胚期（圖4h）。細胞繼續(xù)分裂，細胞間更細密，細胞界限模糊不清，4 h后在胚盤處細胞堆積，在突出于卵黃之上形成囊胚層，進入高囊胚期（圖4i）。細胞向四周擴散，5 h 25 min后，囊胚層變低，稱之為低囊胚期（圖4j）。囊胚層繼續(xù)向下包，7 h 10 min 進入原腸前期（圖4k）；胚盤下包至卵黃1/2處，形成胚盾，8 h 45 min 后進入原腸中期（圖4l）；10 h 5 min 后囊胚層下包至卵黃3/4處，胚層包裹植物極形成胚孔，胚盾繼續(xù)延伸，胚體逐步形成，進入原腸晚期（圖4m）。11 h 10 min后，胚層繼續(xù)下包，最終完全將胚孔封閉（圖4n）；11 h 40 min后，胚體頭部開始形成視囊（圖4o）；受精12 h 20 min后，腦開始出現(xiàn)分化，身體中部出現(xiàn)肌節(jié)（圖4p）；受精后13 h 40 min后，在眼囊中間處出現(xiàn)一對凹陷，開始形成視杯，肌節(jié)數(shù)目增多（圖4q）；受精后15 h，肌節(jié)進一步增多，胚體末端黑色素開始累積，在腹面開始突出形成尾芽，并開始從卵黃囊上分離（圖4r）；16 h 50 min 后，尾從卵黃囊上分離出來，胚體頭部變大，視囊中出現(xiàn)圓形晶體，心臟原基開始出現(xiàn)（圖4s）；受精19 h 40 min后，心臟原基進一步發(fā)育，頭部結構變得復雜，胚體開始間歇性顫動，進入肌肉效應期（圖4t）；受精21 h后，胚體顫動頻率增加，心臟開始搏動，起初頻率微弱，以后逐漸加快（圖4u）；23 h 10 min后，胚體長度幾乎可以包裹卵黃囊一周，胚體扭動有力，在顯微鏡下可見連續(xù)扭動（圖4v）；胚體發(fā)育25 h 30 min后，胚體頭部破膜而出，尾部擺動頻繁，仔魚開始褪去卵膜孵出（圖4w）。

圖2 黃鰭棘鯛IGF-2基因氨基酸序列多重序列比對Fig. 2 Amino acid sequence multiple alignment of IGF-2gene fromAcanthopagrus latus

3.4 IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育過程中的表達情況

通過熒光定量PCR檢測黃鰭棘鯛IGF-1和IGF-2基因在胚胎發(fā)育不同階段（卵裂期、囊胚期、原腸期、胚孔封閉期、晶體期、肌肉效應期、心跳期、出膜前、出膜后3 d）的表達情況。結果顯示，黃鰭棘鯛IGF-1和IGF-2基因mRNA在各發(fā)育時期中均有表達（圖5），黃鰭棘鯛IGF-1基因呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢，在肌肉效應期表達量最高，在囊胚期、原腸期、胚孔封閉期、晶體期以及出膜后3 d表達量次之，卵裂期、心跳期、出膜前表達量較低；IGF-2基因呈現(xiàn)先上升后下降再上升的表達趨勢，在原腸期、肌肉效應期以及出膜后3 d的表達量較高，在胚孔封閉期和晶體期表達量次之，而在卵裂期、囊胚期、心跳期以及出膜前表達量較低。

4 討論

類胰島素樣生長因子是位于生物GH-IGFs生長軸下游的關鍵因子，介導生長激素發(fā)揮生物學功能[22]，類胰島素樣生長因子主要由IGF-1和IGF-2組成。IGF-2也被稱為生長調(diào)節(jié)素A，是胰島素家族的成員之一，具有促進細胞有絲分裂和分化的作用，同時也與個體脂肪沉淀、生長速度等生產(chǎn)性能關系密切[23]。本研究采用RACE技術，首次克隆獲得黃鰭棘鯛IGF-2基因的全長序列，其全長為1 736 bp，共編碼215個氨基酸，推導的氨基酸序列與其他硬骨魚類相似性較高，而與兩棲類、哺乳類相似性較低，系統(tǒng)進化關系與物種傳統(tǒng)分類學相一致，這說明IGF-2在硬骨魚類中進化保守。IGF-2蛋白與IGF-1蛋白[18]一級結構基本相同，均由信號肽、功能域和結構域E組成。IGF-2功能域具有53個氨基酸，由B、C、A、D 4個結構域組成[24]，B、A結構域分別與胰島素B鏈和A鏈同源[25]，C區(qū)與胰島素連接肽類似，這說明IGF-1、IGF-2和胰島素是由同一個祖蛋白進化來的[26]。IGF-2含有3個由半胱氨酸形成的二硫鍵，使得IGF-2蛋白質(zhì)的三級結構得以維持。但是，目前相比于人、鼠等哺乳動物，國內(nèi)外對硬骨魚類IGF-2基因的研究較少，后續(xù)仍需對魚類IGF-2基因功能及調(diào)節(jié)機制進行進一步研究。

圖3 黃鰭棘鯛和其他物種IGF-2基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of IGF-2gene amino acid sequence from Acanthopagrus latusand other species

本研究中觀察并記錄了黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育23個時期的形態(tài)特征變化。黃鰭棘鯛受精卵具有典型硬骨魚類端黃卵的特性，呈圓球形，具有一個油球，其內(nèi)含中性脂肪，使受精卵不僅能儲藏養(yǎng)料，也能使卵子漂浮于水中。受精卵在鹽度28的海水中為懸浮性卵，卵裂方式為盤狀卵裂。胚胎發(fā)育主要經(jīng)歷5個時期，分別為卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和器官形成期[27]。魚卵的直徑因物種不同而存在差異，魚卵直徑顯著影響其發(fā)育速度，一般魚卵直徑越大，發(fā)育速度越慢。將黃鰭棘鯛與幾種鱸形目暖水性海水魚類胚胎發(fā)育特征進行比較[21,28-33]（表2），發(fā)現(xiàn)黃鰭棘鯛受精卵卵徑比軍曹魚（Rachycentron canadum）卵徑小，與3種鯛科魚類差距不大，比其余3種魚卵徑大，這與物種的種間差異具有一定的關系。相較于3種鯛科魚類，黃鰭棘鯛孵化時間短，我們猜想這與孵化溫度有一定關系[34]。本研究中黃鰭棘鯛在水溫（26.5±0.5）℃的情況下，經(jīng)25.5 h孵化為仔魚，這與鄭運通等[12]觀察到黃鰭棘鯛受精卵在（21.6±0.5）℃下，30 h 35 min后孵化為仔魚情況有所差異，該結果也驗證了我們所猜想的胚胎孵化與溫度具有一定的關系。

圖4 黃鰭棘鯛的胚胎發(fā)育Fig. 4 Embryonic development ofAcanthopagrus latus

胚胎發(fā)育涉及到各種信號通路的調(diào)節(jié)，是個體發(fā)育中的重要環(huán)節(jié)，本研究利用RT-PCR檢測了IGF-1和IGF-2基因在胚胎發(fā)育各個時期的表達。結果顯示：IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛的胚胎發(fā)育各個時期均有表達，IGF-1基因在肌肉效應期高表達；相較于IGF-1基因，IGF-2基因在原腸期、肌肉效應期以及出膜后3 d均有高表達。金錢魚IGF-1基因在卵裂期到出膜期的各個時期中均有表達[35]，大西洋鯛[5,36]也有著類似現(xiàn)象。通過向斑馬魚胚胎顯微注射IGF-1基因mRNA，相較于對照組，實驗組斑馬魚軀干生長發(fā)育速度加快[1]。我們推測IGF-1基因可能在魚類胚胎發(fā)育過程中廣泛表達，促進肌纖維細胞的增殖。黃鰭棘鯛IGF-2基因直到原腸期才開始高表達，虹鱒卵裂期不表達[37]，斜帶石斑魚在桑葚期開始表達，隨后表達量持續(xù)升高[22]，這說明IGF-2基因在不同魚類早期胚胎發(fā)育過程中的表達方式不同。White等[6]利用嗎啉反義寡核苷酸抑制斑馬魚胚胎發(fā)育期間IGF-2b基因的表達，發(fā)現(xiàn)IGF-2b基因缺失導致斑馬魚背側中線發(fā)育缺陷，同時也導致了腹側前腦發(fā)育缺陷，最終胚胎死亡，這說明IGF-2基因可能參與了腦部發(fā)育與肌細胞的增殖。IGF-2基因在原腸期高表達，這與金錢魚IGF-2基因表達相似[35]，我們認為IGF-2基因可能在中胚層的形成中發(fā)揮作用。IGF-1和IGF-2基因在肌肉效應期都出現(xiàn)高表達的現(xiàn)象，表示二者在胚胎發(fā)育過程中對肌細胞的增殖均發(fā)揮作用。IGF-1和IGF-2基因在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，但其在胚胎發(fā)育過程中是否具有協(xié)同作用及其調(diào)控的下游信號通路還需進一步研究。

圖5 黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育過程中IGF-1/IGF-2基因mRNA的相對表達量Fig. 5 The relative expression of IGF-1/IGF-2genes mRNA in different embryo development stages ofAcanthopagrus latus

表2 海水魚類胚胎發(fā)育特征的比較Table 2 Comparison of embryonic developmental characteristics of marine fish