四川南充地區(qū)部分豬場呼吸道疫病主要病原調(diào)查與分析

王懷禹，劉強(qiáng)，何子雙，龍冬梅，魏玲

（1.南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院 四川南充 637131；2.閬中大北農(nóng)農(nóng)牧食品有限公司 四川南充 637400）

豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）是一種由多種病毒、細(xì)菌、支原體以及環(huán)境應(yīng)激、不良的飼養(yǎng)管理和機(jī)體免疫力降低等諸多因素相互作用引起的豬只呼吸道疾病的總稱。在規(guī)?；i場養(yǎng)殖過程中，PRDC 病原主要分為兩大類，即原發(fā)性病原與繼發(fā)性病原，前者主要包括豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）等；后者主要包括副豬嗜血桿菌（HPS）、豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）、豬肺炎支原體（MH）、豬鏈球、多殺性巴氏桿菌（Pm）、綠膿桿菌和豬附紅細(xì)胞體（eperythrozoonsuis）等。PRDC 感染通常由多種病原混合感染引起，臨床上常見感染途徑為原發(fā)性病原先侵入豬只呼吸道和肺臟破壞呼吸道的防御屏障，引起免疫抑制，進(jìn)而降低感染豬體呼吸道抵抗力，然后豬體內(nèi)潛在病原或環(huán)境外源病原共同引起呼吸道疾病。據(jù)已報道的臨床統(tǒng)計，PRRSV 和PCV2 混合感染最為常見，對豬場PRDC的發(fā)生起著不容忽視的影響。PRDC 一年四季均可傳播流行，但在秋末、冬春較寒冷季節(jié)高發(fā)，感染率可達(dá)30%～80%，病死率約為10%～30%，主要感染6～10 周齡保育豬和13～20 周齡的育肥豬，且豬齡越小感染率和死亡率越高，不同時期的發(fā)病豬臨床癥狀、發(fā)病特點有所不同。南充是畜牧大市，2020 年生豬出欄量位居四川省第一，為確保生豬產(chǎn)能恢復(fù)，為生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展保駕護(hù)航，做好豬疫病防控顯得尤為重要，及時調(diào)查分析豬場重要疫病-呼吸道疫病綜合征主要病原混合感染狀況，能夠為有效地防控PRDC 提供科學(xué)依據(jù)。本研究采集了2020—2021 年南充地區(qū)部分規(guī)模化豬場及散養(yǎng)戶疑似PRDC 發(fā)病豬的肺、腎和淋巴結(jié)等組織病料236 份，了解南充地區(qū)規(guī)?；i場及散養(yǎng)戶豬只PRDC 主要病原混合感染狀況，基于檢測結(jié)果的分析為規(guī)?；i場疫病有效防控提出解決方案。

1 材料

1.1 病料來源

本研究所用樣品來自四川省南充地區(qū)9 個縣市，主要采集具有咳嗽、呼吸困難和體溫升高等疑似PRDC 癥狀的發(fā)病豬肺、腎和淋巴結(jié)等組織病料，2020 和2021 年檢測樣品分別為126 和110份，合計236 份。

1.2 主要試劑

細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司），RNAiso Plus Total RNA 提取試劑（購自上海生工生物工程股份有限公司），DNA Marker2000、TRIzol、2X Taq Master Mix、瓊脂糖（購自大連寶生物工程有限公司）；無水乙醇、異丙醇、DEPC、氯仿等（購自四川協(xié)力生物有限公司）；麥康凱、TSA 及改良Friis 培養(yǎng)基等。

1.3 引物設(shè)計與合成

所用引物參考NCBI 相關(guān)病原基因組序列，利用Primer 6.0 設(shè)計軟件選取保守序列設(shè)計各自特異性引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 方法

2.1 調(diào)查法

對病料來源的豬場相關(guān)管理、技術(shù)人員進(jìn)行問卷和座談等形式的調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容主要涉及養(yǎng)豬場基本情況、存欄量、免疫情況、疫病流行特點，如臨床癥狀與剖檢病變、各生長階段死淘情況及防治措施和效果等，切實了解疫病發(fā)生的情況。

2.2 實驗室檢測法

采集疑似PRDC 臨床癥狀的典型發(fā)病豬現(xiàn)場剖檢采樣，無菌采集病豬肺臟、淋巴結(jié)、血液等病料組織樣品進(jìn)行實驗室檢測，本實驗主要對PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、HPS、MH、鏈球菌、產(chǎn)毒性巴氏桿菌共計8 種PRDC 常見病原進(jìn)行了檢測，各病原所有引物詳見表1。

表1 PRDC 8種常見病原引物

2.2.1 病毒鑒定

1）DNA 和RNA 提取。待檢測樣品分別進(jìn)行DNA 和RNA 提取。首先對病料進(jìn)行研磨、離心等處理，再按照DNA 提取試劑盒說明書提取相關(guān)DNA，同時使用提取試劑完成RNA 的提取。RNA 提取方法如下：①在200μL 病料懸液中加入1,000μL TRIzol 細(xì)胞裂解液，4℃靜置10min 后，12,000r/min 離心10min；②取上清并在其中加入約1/2 體積的氯仿，4℃靜置10min，12,000r/min 離心10min；③取上清加入等體積異丙醇，4℃靜置10min，12,000r/min 離心10min；④去上清后，在離心管中加入75%乙醇1,000μL，反復(fù)沖洗沉淀，12,000r/min 離心5min。室溫靜置10min 后，溶于20μL DEPC 水中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2）DNA PCR 擴(kuò)增。將所提取DNA 分別利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：2X Taq Master Mix 10μL，DNA 0.5μL，上下游引物各0.5μL，補滅菌HO 至總體積20μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果并記錄。

3）RNA RT-PCR。檢測CSFV 和PRRSV 分別采用套氏PCR 和普通RT-PCR。CSFV 套式PCR 擴(kuò)增第1 輪一步法擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2× 1 Step Buffer 20μL，Prime Script TM One Step Enzyme Mix 1.5μL，外套上下游引物各1μL，RNA模板1.5μL，用RNase-free Water 補至總體積50μ L；第1 輪擴(kuò)增條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，94℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存；第2 輪擴(kuò)增反應(yīng)體系為：Premix Taq Enzyme 25μL，內(nèi)套上下游引物各1μL，第1輪PCR產(chǎn)物300倍稀釋后為模板1.5μL，用RNase-free Water 補反應(yīng)體積至50μL。第2 輪擴(kuò)增條件為：94℃5min；95℃15s，54℃30s，72℃30s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10min；4℃保存。普通RT-PCR 擴(kuò)增程序為：94℃5min；94℃30s，59℃45s，72℃30s，30 個循環(huán)；最后72℃延伸10min。取10μL 第2 輪PCR 產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)上照相觀察并記錄結(jié)果。

2.2.2 細(xì)菌的分離鑒定將病料組織分別接種到麥康凱、含5%牛血清的TSA 培養(yǎng)基和含5%牛血清、0.01%NAD 的特殊培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜。選取典型疑似病原菌的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、擴(kuò)菌、生化試驗及PCR 鑒定。細(xì)菌培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)及生化鑒定詳見表2。

表2 分離菌培養(yǎng)特性

2.2.3 支原體的分離鑒定將采集的肺組織等病料，加入改良Friis 液體培養(yǎng)基進(jìn)行無菌研磨制成肺組織乳劑，靜置后，取上清液接種于含50%豬鼻支原體特異性血清的改良Friis 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4～10d，每天記錄pH 值變化，且每隔5d 盲傳1 次。取0.2mL 液體培養(yǎng)物接種于改良Friis 固體培養(yǎng)基表面，37℃、5%CO條件下培養(yǎng)，觀察是否有支原體樣菌落。將疑似支原體菌落接種于改良Friis 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每日觀察顏色變化及pH值變化。變黃后進(jìn)行PCR 鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 調(diào)查結(jié)果與分析

本實驗采集病料來自南充地區(qū)9 個縣市如嘉陵區(qū)、閬中市、南部縣、儀隴縣、西充縣、蓬安縣、營山縣等12 個規(guī)?；B(yǎng)殖場和8個散養(yǎng)戶。規(guī)模化養(yǎng)殖場均采用水泡糞飼養(yǎng)模式，存欄均在1 萬頭以上，散養(yǎng)戶存欄均在1,000 頭以上。20 個豬場疑似PRDC 死淘豬主要集中在30～110 日齡，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、氣喘、呼吸困難、消瘦、咳嗽、背毛粗亂、眼鼻分泌物增多，有的后肢關(guān)節(jié)腫脹等。病豬剖檢發(fā)現(xiàn)病變均集中在肺部。

3.2 實驗室檢測結(jié)果與分析

通過對236 份病料進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果顯示，236 份病料樣品中，236 份均為陽性，檢出率為100%。其中有189 份檢出PCV2，陽性率為80.1%，151 份檢出PRRSV，3 份檢出CSFV，34份檢出PRV，35 份檢測出鏈球菌，22 份檢測出產(chǎn)毒性巴氏桿菌，11 份檢測出豬肺炎支原體，14 份檢測出副豬嗜血桿菌，詳見表3。對陽性組織樣品進(jìn)行病原學(xué)分析時，所有病料既有單一病原感染，也有混合感染，且混合感染非常普遍，236 份陽性樣品中有207 份為混合感染，占所有陽性樣品的87.7%，而且混合感染類型相當(dāng)復(fù)雜，病原分析發(fā)現(xiàn)二重感染較為普遍，PCV2 和PRRSV 混合感染率最高為47.5%，其次為PCV2+PRV 感染率為14.4%，有一部分病料為三重甚至四重混合感染情況，三重感染中以PCV2+PRRSV+SS 感染率最高約4.7%，四重混合感染率為0.4%，未發(fā)現(xiàn)五重感染（詳見表4）。

表3 病原鑒定結(jié)果

表4 混合感染情況

4 小結(jié)與防控

PRDC 在世界各地普遍存在，在養(yǎng)豬生產(chǎn)實際中，該病往往由一種或多種病原體感染所致。近年來我國PRDC 持續(xù)感染，危害日漸明顯和嚴(yán)重，特別是現(xiàn)代化規(guī)模化豬場養(yǎng)殖模式下，病原日益復(fù)雜，多重感染或混合感染是當(dāng)前常見的發(fā)病規(guī)律，常見以病毒性、細(xì)菌性、病毒與細(xì)菌混合等多種感染形式出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)潛在的原發(fā)性病原主要為病毒類；繼發(fā)性感染是導(dǎo)致病豬大量死亡的主要原因。根據(jù)臨床分析，PRRSV 和PCV2 是最常見的混合感染，對PRDC 發(fā)生有著非常重要的影響。

本次研究采集了236 份南充地區(qū)部分豬場病料，主要檢測了8 種常見的PRDC 病原：PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、SS、HPS、Pm、MH。結(jié)果顯示，雖然各豬場存在的主要呼吸道疾病不同，在毒株、菌株種類及感染情況等方面存在差異，但各豬場普遍存在PCV2和PRRSV 的混合感染和繼發(fā)感染，這提示在四川南充地區(qū)豬群中普遍存在PRDC，且引起的病原也非常復(fù)雜，PRRSV 是造成當(dāng)?shù)刎i場保育和育肥階段豬群呼吸道疾病的重要因素之一，日常關(guān)注環(huán)境控制和病原混合或繼發(fā)感染、控制豬群死淘率是各豬場應(yīng)重視的問題。在多種病原混合感染過程中，病原間具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

分析PRDC 在我國普遍流行的原因，有以下幾種：對于保育階段的豬群而言，此階段豬只自身免疫系統(tǒng)、消化和呼吸系統(tǒng)功能尚不健全，且體內(nèi)母源抗體逐漸降低，加之?dāng)嗄獭⒒烊旱葢?yīng)激因素，導(dǎo)致該階段豬群感染率發(fā)病率高。育肥階段的豬群飼養(yǎng)密度過大、通風(fēng)不良、營養(yǎng)缺乏和免疫機(jī)能降低等是導(dǎo)致豬群呼吸道疾病暴發(fā)的主要原因。

防控PRDC 的有效方法是科學(xué)免疫結(jié)合藥物防治，各豬場應(yīng)結(jié)合實際情況進(jìn)行有針對性防治。PRDC 完整的防治計劃應(yīng)從以下幾個方面著手：豬場要采取嚴(yán)格的生物安全措施，制定合理的免疫接種程序，加強(qiáng)各類疫病的控制和監(jiān)測，強(qiáng)化豬場日常管理，詳細(xì)記錄豬群生長情況、產(chǎn)量記錄等信息，對于重點豬群如保育豬、育肥豬等應(yīng)盡可能避免各類應(yīng)激反應(yīng)，合理控制豬舍飼養(yǎng)密度，堅持營養(yǎng)全面、科學(xué)搭配的喂養(yǎng)原則，給予全價的優(yōu)質(zhì)飼料，確保飼料中蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，確保保育舍的保溫和通風(fēng)等。日常飼養(yǎng)過程中，嚴(yán)格執(zhí)行清潔衛(wèi)生制度和消殺制度，對于潛在的病原攜帶者如外來人員或車輛、物品等進(jìn)行風(fēng)險管控，防止外界病原體的傳入而引發(fā)感染。對于一些常見細(xì)菌，極易產(chǎn)生耐藥性，因此對于細(xì)菌類疾病養(yǎng)豬場應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選用高效抗菌藥物，并能夠聯(lián)合用藥或交替使用異種抗菌類藥物，但要注意藥物間配伍禁忌。

隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷提升和現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖模式的擴(kuò)大，各類豬病本身也發(fā)生著新的變化，不僅表現(xiàn)在抗原表位的突變，混合感染的復(fù)雜化、耐藥機(jī)制的多元化等，多種病原的相互作用，使得機(jī)體多系統(tǒng)并發(fā)癥日益嚴(yán)重，疫病防控越來越難。呼吸系統(tǒng)作為動物機(jī)體的對外口戶，更是眾多病原的突破口，因此是預(yù)防疾病的重中之重。在當(dāng)前豬病嚴(yán)峻形勢下，有必要加強(qiáng)對豬群的疫病監(jiān)測和疫苗免疫。