甘畢舒中鹽酸小檗堿薄層鑒別方法的改進研究

王歡，李彩虹，趙新茹，柳亞茹，趙軍彥，劉朝陽

（石家莊市九洲獸藥有限公司 石家莊 050699）

小檗堿能迅速滅殺機體中革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、霉菌、病毒等，達到清熱解毒，抗炎止瀉的效果，所以小檗堿不僅是甘畢舒的鑒別項，還是成方制劑的主要藥效成分之一。有文獻報道采用高純度的鹽酸小檗堿，未測出口服小檗堿的LD，故甘畢舒中鹽酸小檗堿安全無毒副作用，具有清熱解毒，抗炎止瀉的功效。

關(guān)于中藥成方制劑中鹽酸小檗堿的薄層鑒別，已有《獸藥質(zhì)量標準》（2017 年版中藥卷）《中華人民共和國獸藥典》（2020 年版第二部）收錄及很多文獻報道，各種方法中供試品的制備、展開劑系統(tǒng)的選擇具有一定的變化，參照文獻經(jīng)多次試驗，發(fā)現(xiàn)用甲醇處理供試樣品并以環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）為展開劑效果更好，各組分分離理想，相同位置顯相同顏色熒光斑點，專屬性好，重復性好。

1 儀器、試劑和藥品

1.1 儀器設(shè)備

DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)）；ZF-I 型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠生產(chǎn)）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試驗試劑

無水乙醇（分析純，天津市康科德科技有限公司生產(chǎn)，批號220401）；無水甲醇（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號20210802）；苯（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號20210308）；乙酸乙酯（分析純，天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn)，批號2021 年12 月1 日）；異丙醇（HPLC，天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號20180824）；氨水（分析純，天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn)，批號2021 年6 月1 日）；環(huán)己烷（分析純，天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn)，批號2021 年7 月16 日）；三乙胺（分析純，天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn)，批號2021 年05 月27 日）

1.3 實驗藥品

鹽酸小檗堿對照品：批號為wkq21022004，含量97.8%，四川省維克奇；甘畢舒：批號202201190，石家莊市九洲獸藥有限公司。

2 實驗與結(jié)果

2.1 甘畢舒中小檗堿鑒別方法

取本品5mL，加無水乙醇5mL，充分搖勻，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2017 年《獸藥質(zhì)量標準》中藥卷，附錄0502）試驗，吸取供試品溶液5μL，對照品溶液2μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（6:3:1.5:1.5:0.5）為展開劑，置氨蒸汽預飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.2 甘畢舒中小檗堿鑒別改進方法

取本品5mL，加甲醇5mL，充分搖勻，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2020 年《中華人民共和國獸藥典》第二卷，附錄0502）試驗，吸取供試品溶液2μL，對照品溶液2μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）為展開劑，置氨蒸汽預飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.3 甘畢舒中小檗堿鑒別改進方法專屬性考察

取缺黃柏的9 味藥材按照三黃翁口服液質(zhì)量標準制備缺黃柏陰性對照溶液。分別取甘畢舒和缺黃柏的陰性對照口服液，分別按照“2.1、2.2”項下的方法制備供試品溶液和陰性對照供試品溶液，再進行點樣，展開、顯色。

2.4 甘畢舒中小檗堿鑒別改進方法重復性考察

按照“2.2”的方法制備6 份供試品溶液，分別點樣，展開、顯色。

2.5 甘畢舒中小檗堿的薄層鑒別

由圖1 可知，鹽酸小檗堿對照品斑點與甘畢舒中鹽酸小檗堿的斑點顯色模糊，其他位置分離不理想，陰性對照品在鹽酸小檗堿的相應位置較高處有類似顏色的模糊斑點，對甘畢舒鹽酸小檗堿鑒別項結(jié)果的判定影響較大。

圖1 甘畢舒鹽酸小檗堿薄層鑒別圖譜

2.6 甘畢舒中小檗堿的薄層鑒別樣品處理方法的改進

樣品處理從無水乙醇改進到甲醇，由圖2 可見，鹽酸小檗堿和供試品顯點清晰且在一條直線上，而陰性對照在鹽酸小檗堿對應位置較高位置顯類似顏色斑點，較未改進處理方法的斑點變淡，但是對甘畢舒鹽酸小檗堿鑒別項結(jié)果的判定仍有一定影響。

圖2 甘畢舒鹽酸小檗堿薄層鑒別圖譜

2.7 甘畢舒中小檗堿的薄層鑒別展開劑改進

通過參考2020 版《中華人民共和國獸藥典》第二部中其他成分藥劑的鹽酸小檗堿薄層鑒別方法，將鹽酸小檗堿鑒別項展開劑苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（6:3:1.5:1.5:0.5）改為環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1），其他條件不變，進行鹽酸小檗堿薄層色譜的鑒別。由圖3 可見，供試品鹽酸小檗堿斑點未完全分開，可視性較差，陰性對照在鹽酸小檗堿位置未見相同顏色的斑點，對甘畢舒鹽酸小檗堿鑒別項結(jié)果的判定有較小影響。

圖3 甘畢舒鹽酸小檗堿薄層鑒別圖譜

2.8 甘畢舒中小檗堿的薄層鑒別樣品處理方法和展開劑的改進

用改進后樣品處理方法和展開劑薄層鑒別如圖4，供試品各組方分離理想，鹽酸小檗堿對應位置顯清晰可見的相同顏色的熒光斑點，陰性對照在對應位置未見相同顏色的熒光斑點，鹽酸小檗堿對照品斑點與甘畢舒中鹽酸小檗堿的斑點在一條直線上，顯相同的熒光斑點，供試品各組分分離清晰容易判斷，陰性對照薄層鑒別無干擾，專屬性良好。

圖4 甘畢舒鹽酸小檗堿薄層鑒別圖譜

2.9 甘畢舒中小檗堿的薄層鑒別重復性考察

通過制備6 份甘畢舒供試品，按改進后方法進行重復性考察，結(jié)果顯示（圖5），6 份供試品相應條帶一一對應，且與對照品有相同熒光斑點，表明該方法的重復性好。

圖5 甘畢舒鹽酸小檗堿薄層鑒別圖譜

3 討論

《中華人民共和國獸藥典》（2020 年版第二部）和相關(guān)文獻中鹽酸小檗堿薄層鑒別供試品樣品多用甲醇處理，通過本試驗發(fā)現(xiàn)在相同展開劑下甲醇處理供試品優(yōu)于無水乙醇，組分分離較理想，斑點清晰可見，陰性對照存在影響薄層鑒別判斷的斑點淡化，所以還需要對展開劑進行改進。本試驗除采用苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（6:3:1.5:1.5:0.5）為展開劑，還進行了展開劑正丁醇-冰醋酸-水（7:1:2）、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10:6:1:1）、環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）的鑒別試驗，發(fā)現(xiàn)以環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺作為展開劑比使用苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液目標斑點展開清晰可見，斑點分離效果好，專屬性良好，重現(xiàn)性好，安全環(huán)保，可視性好，效果滿意。該方法可作為甘畢舒的鹽酸小檗堿的薄層鑒別方法及為甘畢舒做特征圖譜提供方法。