響應(yīng)面法優(yōu)化硒化桑葉多糖的制備工藝及其體外抗氧化活性

胡潤(rùn)鋒，李浚哲，李鵬飛，周 軍，李湘洲

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.廣西民族大學(xué)a.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530006）

桑Morus alba是?？啤⑸俾淙~喬木或灌木，廣泛分布在溫帶、亞熱帶、熱帶等氣候地區(qū)。我國(guó)是世界上最大的種桑國(guó)，已有4000 多年的桑栽培史。桑葉為植物桑的干燥葉，又名鐵扇子，神仙葉?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑葉因含黃酮、生物堿、甾醇、γ-氨基丁酸、多糖等多種天然活性成分[1-2]，使其具有降血糖[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等多種生物活性，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及保健行業(yè)[7-8]。2002年，我國(guó)就將桑葉列為藥食同源。

硒是維持人體正常生理活動(dòng)所必需的18 種微量元素之一，它在維持機(jī)體正常功能和健康方面有著不可或缺的地位[9]。研究表明，硒元素可增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力、降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)、提高機(jī)體免疫力，而硒元素的缺乏也與肝損傷，心血管疾病，癌癥和衰老等有關(guān)[10-11]。因此，對(duì)于缺硒人群來(lái)說(shuō)，硒元素的補(bǔ)充尤為重要。硒化合物按照硒元素的形態(tài)可分為有機(jī)硒化合物（硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白）和無(wú)機(jī)硒化合物（硒酸鹽、亞硒酸鹽），相比于無(wú)機(jī)硒化合物，有機(jī)硒化合物具有生物利用度高和生物毒性低等特點(diǎn)，更適合用于補(bǔ)充人體的硒元素，其中富硒多糖便是一種理想的補(bǔ)硒制劑[12]。硒多糖可分為天然硒多糖和人工合成硒多糖。天然硒多糖主要存在于富硒土壤中生長(zhǎng)的植物內(nèi)以及用富硒培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物內(nèi)[13-15]，但由于富硒土壤分布不均勻以及植物和微生物的富硒能力有限，導(dǎo)致天然富硒產(chǎn)品產(chǎn)量少且硒多糖含量較低[16]。人工合成硒多糖是由天然多糖和無(wú)機(jī)硒化合物合成得到的，相比于天然硒多糖，具有原料來(lái)源豐富且硒含量高的特點(diǎn)，兼具多糖和硒元素兩者的生物活性[17-18]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用天然多糖和無(wú)機(jī)硒化物反應(yīng)成功制備出各種富硒多糖，不僅保留甚至提高了天然多糖原有的生物活性，同時(shí)也增加了硒元素獨(dú)特的的生物活性，且毒副作用大大降低。Yuan 等[19]利用微波輔助技術(shù)合成的硒化甘薯多糖可以顯著提高甘薯多糖的體外抗氧化、體內(nèi)抗腫瘤、降血糖活性。Huang 等[20]合成的硒化黃芪多糖提高了黃芪多糖的清除自由基和抑制腎結(jié)石的活性。Liu 等[21]合成的硒化梭柄乳頭菌多糖的降血糖、降血脂活性明顯提高。目前，將硒元素引入桑葉多糖以提高桑葉多糖的生物活性還未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。

桑葉多糖作為桑葉的主要活性成分之一，具有降血糖、抗氧化、抗凝血等生物活性[22-23]，而硒元素同樣具有顯著的抗氧化活性，將兩者結(jié)合能否提高桑葉多糖的抗氧化活性有待探究。值得注意的是，在硒化多糖改性過(guò)程中，反應(yīng)條件能對(duì)多糖的硒含量造成較大的影響，而硒含量能直接影響到硒化多糖的生物活性，因此對(duì)天然多糖的硒化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化具有重要意義。基于此，本研究以桑葉多糖為原料，硒含量為考察指標(biāo)，利用HNO3-Na2SeO3法制備硒化桑葉多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法優(yōu)化硒化桑葉多糖的制備工藝，并對(duì)比研究硒化前后桑葉多糖的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和體外抗氧化活性的差異，為桑葉中多糖類(lèi)化合物在功能性食品和藥物等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干桑葉，產(chǎn)自湖南永州；亞硒酸鈉，西隴科學(xué)股份有限公司；氯化鋇、無(wú)水硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、高氯酸、硝酸、鹽酸、鄰苯二胺、氨水、甲苯，溴化鉀均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；S-8 大孔樹(shù)脂、聚酰胺樹(shù)脂，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料公司。

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；WB-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TG16-WS 離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；DK-98-Ⅱ電爐，天津市天泰有限公司；Zeiss Sigma 300 掃描電子顯微鏡，卡爾·蔡司股份公司；Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Zetasizernano 納米粒度及zeta 電位分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；ALPHA 傅里葉變換紅外光譜儀，布魯克公司；UV2300-Ⅱ系列雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MLP-Se 的合成

利用水提醇沉法提取桑葉多糖[24]。稱(chēng)取一定量粉碎烘干后的桑葉粉，按照固液比1∶20（g·mL-1）加入無(wú)水乙醇，80℃回流2 h 后過(guò)濾，濾渣60℃烘干得到脫脂桑葉粉。稱(chēng)取一定量脫脂桑葉粉，按照固液比1∶20（g·mL-1）加入去離子水，80℃回流提取2 h，離心，取上清液。依次用聚酰胺樹(shù)脂和S-8 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附法除去提取液中蛋白和色素，濃縮后加入4 倍體積的無(wú)水乙醇，5℃下靜置24 h，過(guò)濾，沉淀依次分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3 次，冷凍干燥得到桑葉多糖，命名為MLP。

利用HNO3-Na2SeO3法對(duì)MLP進(jìn)行硒化改性。稱(chēng)取300 mg 的MLP 置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入50 mL一定質(zhì)量濃度的HNO3，加熱使其充分溶解，加入一定量的Na2SeO3與700 mg 的BaCl2，水浴加熱攪拌反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后使其冷卻，調(diào)節(jié)pH 值至7 左右，加入一定量的Na2SO4以除去BaCl2，離心取上清液置于透析袋中透析72 h，濃縮、凍干后得到硒化桑葉多糖，命名為MLP-Se。桑葉多糖硒化的反應(yīng)方程式見(jiàn)圖1。

圖1 桑葉多糖硒化的反應(yīng)方程式Fig.1 Reaction equation of selenization of mulberry leaves polysaccharides

1.2.2 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立及測(cè)定

采用鄰苯二胺法測(cè)定MLP-Se 中的硒含量[25]。用Na2SeO3配置一系列質(zhì)量濃度梯度的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容至25 mL，加入2 mL 質(zhì)量濃度2%的鄰苯二胺溶液，暗處反應(yīng)1 h，加入10 mL 甲苯，振蕩萃取5 min，收集上層甲苯層溶液，以甲苯作為參比溶液，在波長(zhǎng)334 nm 的紫外分光光度計(jì)中測(cè)定并得到吸光度值。以硒的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=0.307 3X+0.009 3(R2=0.998 0)。

MLP-Se 消化過(guò)程如下：稱(chēng)取10 mg MLP-Se置于燒杯內(nèi)，加入5 mL 混合酸（HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4，v/v/v），浸泡3 h，待MLP-Se 完全溶解，加熱消化使溶液體積蒸發(fā)至約1 mL。待消化液冷卻后加入5 mL 的6 mol·L-1鹽酸繼續(xù)加熱30 min 以上并不再沸騰時(shí)，停止加熱使Se(VI)還原為Se(IV)，加熱過(guò)程中防止暴沸。溶液冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加入2 mL 2%的鄰苯二胺溶液和5%的EDTA-2Na 溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH值至2.0，置于暗處反應(yīng)1 h，后續(xù)操作按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定方法，得到吸光度值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算硒含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

按照MLP-Se 的合成方法，分別考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比和HNO3的體積分?jǐn)?shù)對(duì)制備的MLP-Se 中Se 含量的影響。其中，在Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.2、HNO3體積分?jǐn)?shù)0.5%和反應(yīng)溫度70℃的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間分別為5、6、7、8、9 h 對(duì)MLP-Se 中Se 含量的影響；在HNO3體積分?jǐn)?shù)0.5%、反應(yīng)溫度80℃和反應(yīng)時(shí)間7 h 的條件下，考察Na2SeO3與MLP的質(zhì)量比分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 對(duì)MLPSe 中Se 含量的影響；在Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.2、反應(yīng)溫度80℃和反應(yīng)時(shí)間7 h 的條件下，考察HNO3體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9% 對(duì)MLP-Se 中Se 含量的影響；在Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.2、HNO3體積分?jǐn)?shù)0.5%和反應(yīng)時(shí)間7 h 的條件下，考察反應(yīng)溫度分別為50、60、70、80、90 ℃對(duì)MLP-Se 中Se 含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定反應(yīng)時(shí)間7 h，進(jìn)一步優(yōu)化Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比、HNO3的體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度對(duì)MLP-Se 合成的影響，采用三因素三水平的Box-Behnken 方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)（表1）。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平及編碼值Table 1 Design factor level and code value of Box-Benhnken

1.2.5 掃描電鏡-能譜分析

分別取干燥的MLP 和MLP-Se，粘附到碳導(dǎo)電介質(zhì)板上鍍金。噴金后將樣品置于掃描電鏡下室溫掃描，觀察硒化前后多糖的表面形貌，并利用EDS 分析儀進(jìn)行元素分析。

1.2.6 凝膠色譜分析

采用凝膠色譜法測(cè)定MLP 和MLP-Se 的分子量[26]。色譜條件：Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，PL aquagel-OH（8.0×300 mm，8 μm）柱，示差折光器（RID），柱溫35℃，流動(dòng)相為0.1 M的NaCl 溶液，流速0.6 mL·min-1，進(jìn)樣20 μL。

以分子量3 000～200×105Da 的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)值（lgMw）為縱坐標(biāo)作圖，得到多糖分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=-0.430 4X+9.910 7(R2=0.999 6)。將樣品的色譜分析結(jié)果中的保留時(shí)間帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的分子量。

1.2.7 粒徑和zeta 電位分析

取適量MLP 和MLP-Se 溶于水中，配置成濃度為0.1 mg·mL-1的多糖溶液，在25℃的條件下，測(cè)量多糖樣品的電勢(shì)和粒徑分布。

1.2.8 紅外光譜分析

利用KBr 壓片法對(duì)MLP 和MLP-Se 進(jìn)行壓片制樣，樣品在紅外光譜下掃描，掃描頻率64 Hz，掃描32 次，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.2.9 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力的測(cè)定

取2 mL 不同濃度的樣品溶液分別加入2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液，混合均勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，離心，取上清液于517 nm 處檢測(cè)其吸光度值，以相應(yīng)的乙醇溶液為對(duì)照。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式為：

式（1）中：D為DPPH 自由基清除率，Ai是樣品與DPPH 反應(yīng)后的吸光度，Aj是無(wú)水乙醇代替DPPH 的吸光度，A0是蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.10 清除2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基能力的測(cè)定

將7.0 mmol·L-1的ABTS 溶液 與5.0 mmol·L-1的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，避光室溫放置12 h后，加蒸餾水稀釋50 倍，使其在波長(zhǎng)734 nm 處吸光度為0.70±0.02。取0.5 mL 不同濃度的樣品溶液，加4.0 mL 稀釋后的ABTS 溶液，室溫避光反應(yīng)6 min，在734 nm 處測(cè)其吸光度，以相應(yīng)蒸餾水為對(duì)照。ABTS 自由基清除率的計(jì)算公式為：

式（2）中：Abt為ABTS 自由基清除率，Ai是樣品與ABTS 反應(yīng)后的吸光度，Aj是蒸餾水代替ABTS的吸光度，A0是蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，采用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.2.3 中所述方法分別考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比和HNO3體積分?jǐn)?shù)對(duì)MLP-Se 中硒含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2a 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MLP-Se的硒含量先增大后減小，反應(yīng)時(shí)間為7 h 時(shí)的硒含量達(dá)到最大值為2.08±0.06 mg·g-1。因此選擇反應(yīng)時(shí)間為7 h。由圖2b 可知，隨著反應(yīng)溫度的增大，MLP-Se 的硒含量先增大后減小，當(dāng)反應(yīng)溫度為80℃時(shí)，硒含量達(dá)到最大值為2.83±0.07 mg·g-1，繼續(xù)增大反應(yīng)溫度，硒含量開(kāi)始減小，原因在于高溫能激活反應(yīng)位點(diǎn)，有利于硒化反應(yīng)的進(jìn)行，但過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致部分多糖鏈斷裂以及有機(jī)硒穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)被破壞造成的[27]。由圖2c 可知，隨著HNO3體積分?jǐn)?shù)的增大，MLP-Se 的硒含量先增大后減小，當(dāng)HNO3體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，硒含量達(dá)到最大值為2.85±0.05 mg·g-1，繼續(xù)增大HNO3體積分?jǐn)?shù)，硒含量開(kāi)始減小，原因可能是因?yàn)樵诤线m的酸性條件下，糖苷鍵的部分?jǐn)嗔驯┞冻龈嗟奈磻?yīng)位點(diǎn)，但反應(yīng)體系酸性環(huán)境過(guò)大將導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞[28]。由圖2d 可知，隨著Na2SeO3與MLP 質(zhì)量比的增大，MLP-Se 的硒含量先增大后減小，在質(zhì)量比值為1.2 時(shí)，硒含量達(dá)到最大值為2.84±0.08 mg·g-1，質(zhì)量比繼續(xù)增大，硒含量開(kāi)始減小，原因可能是飽和結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致的非特異性吸收有關(guān)[27]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

按照表1的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

以硒含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10.0.7軟件，將表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=-41.91+4.51A+0.38B+3 0.25C+0.18AB+4.92AC+0.03BC-8.75A2-0.003B2-6.04C2，并對(duì)此設(shè)計(jì)的模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型中A、B、C、A2、B2、C2項(xiàng)均為極顯著（P＜0.01）。根據(jù)F值可知，各因素對(duì)桑葉多糖的硒含量影響大小順序?yàn)椋篊（HNO3體積分?jǐn)?shù)）＞B（反應(yīng)溫度）＞A（Na2SeO3與MLP 質(zhì)量比）。試驗(yàn)所建立的模型（P＜0.01）為極顯著，失擬項(xiàng)（P＞0.05）為不顯著，說(shuō)明所建立的響應(yīng)面模型用來(lái)優(yōu)化MLP-Se 制備的最佳工藝條件是可行的。信噪比36.695＞4，說(shuō)明該模型可預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，而修正判定系數(shù)RAdj=0.989 0，表示可以用此模型來(lái)預(yù)測(cè)98.9%的響應(yīng)值。判定系數(shù)R2Pred=0.956 8，說(shuō)明此模型擬合程度良好，可以利用模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)制備的MLP-Se 的硒含量值，R2Pred=0.956 8 與R2=0.995 2 的值接近，說(shuō)明該響應(yīng)面設(shè)計(jì)合理。

經(jīng)過(guò)Design-Expert 軟件計(jì)算獲得制備MLPSe 的響應(yīng)面優(yōu)化工藝為：Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.268，HNO3的體積分?jǐn)?shù)0.54%，反應(yīng)溫度84.98 ℃，此條件下的硒含量的預(yù)測(cè)值為3.158 mg·g-1。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，在質(zhì)量比MLP 與Na2SeO3的1.27、反應(yīng)溫度85℃、HNO3體積分?jǐn)?shù)0.54%的條件下，5 次平行實(shí)驗(yàn)制備的MLP-Se 中硒含量的實(shí)際平均值為3.147 mg·g-1。實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，表明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)合理、可靠。

2.3 掃描電鏡-能譜分析

圖3a—c 分別為MLP 和MLP-Se 的掃描電鏡及MLP-Se 的能譜分析結(jié)果。由圖3a 可知，MLP表面整體比較光滑，且存在不規(guī)則的、致密的溝壑，這可能是由于樣品經(jīng)冷凍干燥后水分的升華而導(dǎo)致開(kāi)裂，而圖3b 中MLP-Se 的表面凹凸不平，主要以無(wú)定形的結(jié)構(gòu)聚集存在，表明硒化修飾改變了桑葉多糖的表觀形貌。MLP-Se 的能譜分析表明C、O、Se 原子比分別為45.34%、54.07%、0.59%，Se 元素的存在表明硒化修飾的成功。

圖3 MLP（a）、MLP-Se（b）的掃描電鏡和MLP-Se 的能譜分析（c）Fig.3 Analysis of SEM of MLP(a),MLP-Se(b) and EDS of MLP-Se (c)

2.4 凝膠色譜分析

MLP 和MLP-Se 樣品的凝膠色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖4。MLP 和MLP-Se 的保留時(shí)間分別為8.338和8.209 min，相對(duì)分子質(zhì)量分別為2.099×103和2.385×103kDa，表明MLP 經(jīng)硒化修飾后，其分子量有所增大，這是由于硒化反應(yīng)過(guò)程中含硒官能團(tuán)取代了原多糖分子中的羥基所致。

圖4 MLP（a）和MLP-Se（b）的GPC 分析Fig.4 GPC analysis of MLP(a) and MLP-Se(b)

2.5 粒徑和zeta 電位分析

多糖的流體力學(xué)性質(zhì)如電勢(shì)電位和粒徑分布可以在一定程度上反映其穩(wěn)定性，一般來(lái)說(shuō)，多糖分子的粒徑越小、zeta 電位的絕對(duì)值越大，說(shuō)明多糖分子在體系中越容易分散或溶解，反之則多糖分子越容易聚集。圖5為0.1 mg·mL-1的MLP和MLP-Se 溶液的粒徑分布和zeta 電位分析結(jié)果，圖5a 中MLP-Se 分子的平均直徑（33.68 nm）小于MLP 分子的平均直徑（168.0 nm），圖5b 中MLP 和MLP-Se 均帶負(fù)電荷，而MLP-Se 的zeta電位的絕對(duì)值（20.4 mV）大于MLP 的zeta 電位的絕對(duì)值（14.5 mV），說(shuō)明硒化修飾后提高了桑葉多糖在溶液體系中的穩(wěn)定性。

圖5 MLP 和MLP-Se 的粒徑分析（a）和zeta 電位（b）Fig.5 The particle size(a) and zeta potential distribution(b) of MLP and MLP-Se

2.6 紅外光譜分析

MLP 和MLP-Se 的紅外光譜分析結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，MLP 和MLP-Se 的譜圖整體相似，說(shuō)明硒化修飾并不會(huì)破壞桑葉多糖的主要結(jié)構(gòu)。在3 400和2 920 cm-1處的特征吸收峰分別是由O-H的彎曲振動(dòng)和C-H 的伸縮振動(dòng)引起的。1 625 和1 425 cm-1處為羧基的特征吸收峰，說(shuō)明了糖醛酸的存在。在1 000～1 200 cm-1處的重疊峰是吡喃環(huán)中C-O-C 和C-O-H 的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明MLP主要以吡喃糖的形式存在。而MLP-Se 分別在609、822、920 和1 384 cm-1處產(chǎn)生了新的特征吸收峰，其中，609 cm-1歸因于Se-O-C 的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，822 cm-1歸因于Se=O 伸縮振動(dòng)，920 cm-1歸因于C-O-Se 的伸縮振動(dòng)，1 384 cm-1為糖環(huán)上與Se=O 相鄰的C-H 特征吸收峰，說(shuō)明MLP 經(jīng)HNO3-Na2SeO3法可以有效制備MLP-Se，且硒與多糖是通過(guò)C-O-Se 和Se=O 結(jié)合的。這與Wu 等[29]和Zhu 等[30]在硒化修飾多糖的研究結(jié)果一致。

圖6 MLP 和MLP-Se 紅外光譜分析Fig.6 FT-IR spectroscopy analysis of MLP and MLP-Se

2.7 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

由圖7可知，MLP 和MLP-Se 對(duì)DPPH 自由基的清除率均表現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系，隨著樣品濃度的增加，DPPH 自由基清除率越高。在相同濃度下，MLP-Se 對(duì)DPPH 自由基清除率均明顯高于MLP（P＜0.05）。在濃度達(dá)到5 mg·mL-1時(shí)，MLP和MLP-Se 對(duì)DPPH 的清除率分別達(dá)到70.61%和86.71%，IC50值分別為2.15 和0.88 mg·mL-1，說(shuō)明硒化修飾可以增加桑葉多糖對(duì)DPPH 自由基的清除效果。

圖7 MLP 和MLP-Se 對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.7 Scavenging effects of MLP and MLP-Se on DPPH free radical

2.8 ABTS 自由基清除能力測(cè)定

由圖8可知，MLP 和MLP-Se 對(duì)ABTS 自由基的清除率均表現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系，隨著樣品濃度的增大，對(duì)ABTS 自由基的清除率越高。在相同濃度下，MLP-Se 對(duì)ABTS 自由基清除率的作用均高于MLP。在濃度達(dá)到5 mg·mL-1時(shí)，MLP和MLP-Se 對(duì)DPPH 的清除率分別達(dá)到80.50%和100%，IC50值分別為1.79 和0.68 mg·mL-1，說(shuō)明硒化修飾可以增加桑葉多糖對(duì)ABTS 自由基清除率的作用。

圖8 MLP 和MLP-Se 對(duì)ABTS 自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effects of MLP and MLP-Se on ABTS free radical

綜上所述，利用HNO3-Na2SeO3法對(duì)桑葉多糖進(jìn)行硒化改性，可以提高桑葉多糖的抗氧化活性。研究表明多糖的中羥基解離能較弱[31]，其易向自由基提供氫原子，因此多糖具有抗氧化活性，且活性的強(qiáng)弱直接和供氫能力相關(guān)，而硒多糖中硒基團(tuán)的存在可以激活正構(gòu)碳中的氫原子，從而增強(qiáng)其清除自由基的能力[32]。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

以水提醇沉、吸附法制備的桑葉多糖（MLP）為原料，利用HNO3-Na2SeO3法對(duì)其進(jìn)行硒化修飾制備硒化桑葉多糖（MLP-Se）。通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化并獲得了MLP-Se 的制備工藝為MLP與Na2SeO3的質(zhì)量比1.27，反應(yīng)溫度85℃，HNO3體積分?jǐn)?shù)0.54%，反應(yīng)時(shí)間7 h，此條件下制備的MLP-Se 中硒含量高達(dá)3.147 mg·g-1，建立的響應(yīng)面模型可靠。理化性質(zhì)與表觀結(jié)構(gòu)分析表明，桑葉多糖已被成功硒化，且硒與多糖是通過(guò)C-OSe 和Se=O 結(jié)合，此外，硒化修飾改變了桑葉多糖的表面形貌，增大了桑葉多糖分子量，提高桑葉多糖在溶液體系中的穩(wěn)定性。MLP-Se 對(duì)DPPH自由基和ABTS 自由基的IC50值分別為0.88 和0.68 mg·g-1，且明顯低于MLP，表明硒化改性制備的MLP-Se 的抗氧化能力更強(qiáng)。

3.2 討 論

將硒元素引入到桑葉多糖的分子結(jié)構(gòu)中，形成富硒的桑葉多糖，不僅提高了桑葉多糖復(fù)溶后的穩(wěn)定性，還有效提高了桑葉多糖原有的生物活性，為桑葉多糖的深加工開(kāi)發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)，也為類(lèi)似天然多糖的研究與利用提供有益借鑒。通過(guò)能譜和紅外光譜分析可以初步表明硒元素已成功引入到多糖分子中，且硒與多糖是通過(guò)C-O-Se 和Se=O 的方式結(jié)合的，但由于尚未對(duì)MLP 和MLP-Se 進(jìn)行進(jìn)一步的分離富集，因而無(wú)法對(duì)多糖修飾前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入解析。下一步可以在分離獲得純度較高的化合物的基礎(chǔ)上通過(guò)圓二色譜、核磁共振波譜等分析技術(shù)對(duì)MLP 和MLP-Se 的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入系統(tǒng)的分析，以便于更好地闡述其構(gòu)效關(guān)系。