遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的前沿拓展
——等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和微流控芯片技術(shù)的引入與思考

趙雪瑩， 李夢欣， 盧大儒， 喬守怡， 皮 妍

（復(fù)旦大學(xué) a.生物科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心；b.生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

0 引 言

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，基因科學(xué)越來越廣泛而深入地影響了人類的生活與健康，帶來了社會(huì)對(duì)生命科學(xué)人才培養(yǎng)的全新要求。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程是生物專業(yè)本科生的必修課程之一，如何通過課程內(nèi)容的精心設(shè)計(jì)，將新技術(shù)、新方法、新思維與經(jīng)典的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合，聚焦當(dāng)今社會(huì)技術(shù)熱點(diǎn)，通過新案例的學(xué)習(xí)拓展學(xué)生的知識(shí)面，開啟學(xué)生的創(chuàng)新思維，培養(yǎng)學(xué)生從生活中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力和理論聯(lián)系實(shí)際的能力，值得每一名教學(xué)工作者深入思考和探究。

傳統(tǒng)的分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程通常以經(jīng)典的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）實(shí)驗(yàn)作為典型教學(xué)案例，傳授學(xué)生現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)知識(shí)及基本原理。近年來基因技術(shù)迅猛發(fā)展，PCR技術(shù)在原有基礎(chǔ)上獲得了極大拓展和延伸。其中，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、耗時(shí)短、場地及設(shè)備要求低等特點(diǎn)［1，2］，較之PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中具有極大的優(yōu)勢。研究人員將其與經(jīng)典的微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出核酸現(xiàn)場快速檢驗(yàn)方法，已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因材料鑒定、病原微生物的快速檢測等方向，成為生物技術(shù)造福于人類生活的經(jīng)典案例［1-4］。

在近年的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中，筆者選取轉(zhuǎn)基因材料鑒定這一社會(huì)熱點(diǎn)問題，設(shè)計(jì)以基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)的微流控芯片核酸檢測技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料實(shí)驗(yàn)作為教學(xué)案例，將等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和微流控芯片核酸檢測技術(shù)引入遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，作為經(jīng)典PCR技術(shù)的教學(xué)延伸，在拓展教學(xué)內(nèi)容的深度與廣度的同時(shí)，引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注技術(shù)的前沿發(fā)展，激發(fā)學(xué)生探索科學(xué)的興趣，培育學(xué)生的創(chuàng)新能力和科研素質(zhì)。

1 技術(shù)原理

1.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理

LAMP技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其基本原理在于，通過對(duì)目標(biāo)基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性，在60～65℃恒溫環(huán)境中進(jìn)行循環(huán)置換合成，可在15～60 min完成109～1010倍核酸擴(kuò)增［2，5-7］。與經(jīng)典的PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)具有靈敏度高、特異性高、反應(yīng)設(shè)備要求低、速度快等優(yōu)勢，如表1所示［6-7］。

表1 LAMP技術(shù)和普通PCR技術(shù)特點(diǎn)比較

目前，我國已發(fā)布并實(shí)施了針對(duì)出口食品中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——SN／T3767出口食品中轉(zhuǎn)基因成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法（第3-30部分），規(guī)定了12個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系、5個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆品系、8個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系、1個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥品系、1個(gè)轉(zhuǎn)基因甜菜品系及1個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品系的檢測方法［8-11］。LAMP技術(shù)因其優(yōu)點(diǎn)突出，成為了目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測的重點(diǎn)發(fā)展方向。

1.2 微流控芯片核酸檢測技術(shù)原理

微流控技術(shù)是一種在微納米級(jí)別的空間內(nèi)精確操控微尺度流體的新興技術(shù)，能夠?qū)⑸锘蚧瘜W(xué)樣品的整個(gè)反應(yīng)和分析過程的基本操作集成在一片由微結(jié)構(gòu)和微通道構(gòu)成的芯片上，通過對(duì)微流體的精確控制，實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)化檢測和分析［12-13］。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，微流控芯片體積小、操作簡便、耗樣量少、檢測成本低、設(shè)計(jì)靈活，已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、機(jī)械、電子等多學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域［14］。

微流控芯片具有高度集成化的優(yōu)勢，能夠減少檢測反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)場地與大型儀器的依賴性，而基于LAMP的核酸檢測技術(shù)僅需簡單控溫裝置即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸高靈敏度的檢測。微流控芯片與LAMP技術(shù)相結(jié)合，通過開發(fā)小型便攜化的核酸檢測裝置，能夠極大地簡化操作、節(jié)約時(shí)間和樣本，且反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)，在食品檢測、病原微生物檢測、轉(zhuǎn)基因檢測等方向均具有較好的應(yīng)用前景［15-16］，用于實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)案例中，既具有較強(qiáng)的可操作性，也具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。

2 教學(xué)方案設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因大豆MON89788是由孟山都遠(yuǎn)東有限公司研發(fā)的抗除草劑草甘膦大豆品種，我國農(nóng)業(yè)部于2013年批準(zhǔn)其進(jìn)口用作加工原料。實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)基因大豆MON89788為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用基于LAMP的微流控芯片核酸檢測技術(shù)對(duì)MON89788及對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測，建立轉(zhuǎn)基因檢測的實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)案例。通過該實(shí)驗(yàn)教學(xué)，傳授學(xué)生等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、微流控芯片技術(shù)及轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)等前沿知識(shí)，引導(dǎo)學(xué)生了解前沿科技，激發(fā)其探索科學(xué)問題的興趣。

實(shí)驗(yàn)安排在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的最后一次進(jìn)行。首先，對(duì)轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆粉末進(jìn)行核酸提取，獲得待測樣本的基因組DNA后，將預(yù)設(shè)好的轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系特異序列引物和通用的大豆內(nèi)源基因引物分別與熒光染料混合，加至微流控芯片的引物孔中，完成引物預(yù)處理；然后，配置LAMP反應(yīng)液，并加入待測樣本DNA，混合后加至微流控芯片的反應(yīng)孔中，將芯片置于等溫?cái)U(kuò)增微流控芯片反應(yīng)儀，實(shí)時(shí)收集擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值；最后，導(dǎo)出熒光數(shù)據(jù)，完成數(shù)據(jù)分析及實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

實(shí)驗(yàn)中每位學(xué)生獨(dú)立完成1份轉(zhuǎn)基因大豆樣品的檢測；每2人為1小組，小組內(nèi)共享實(shí)驗(yàn)設(shè)備及耗材，并在實(shí)驗(yàn)過程中交流討論，互幫互助；每12人為一大組，使用一張微流控芯片完成檢測。每一大組完成一次非轉(zhuǎn)基因大豆檢測對(duì)照實(shí)驗(yàn)及以水為檢測對(duì)象的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

本次實(shí)驗(yàn)課程將等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和微流控芯片技術(shù)作為一種全新的基因檢測方法引入了遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，課程內(nèi)容包括技術(shù)原理講解、實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)、學(xué)生獨(dú)立完成檢測實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)分析與處理、問題討論與反思等環(huán)節(jié)，鼓勵(lì)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)探索和科學(xué)應(yīng)用的能力，提高學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)。

3 教學(xué)效果

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

轉(zhuǎn)基因大豆樣本的檢測結(jié)果如圖1所示。采用大豆通用引物分別對(duì)轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆樣本進(jìn)行檢測，均取得了較好的擴(kuò)增結(jié)果，熒光強(qiáng)度值在反應(yīng)7.15 min左右時(shí)出現(xiàn)了指數(shù)級(jí)上升，提示其檢測結(jié)果為陽性；采用轉(zhuǎn)基因大豆特異性引物分別對(duì)轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測，轉(zhuǎn)基因大豆樣本在反應(yīng)15 min左右時(shí)即出現(xiàn)了指數(shù)級(jí)上升，獲得陽性檢測結(jié)果，而非轉(zhuǎn)基因大豆樣本未出現(xiàn)熒光信號(hào)的指數(shù)級(jí)增強(qiáng)，提示檢測結(jié)果為陰性。

圖1 微流控?zé)晒饧夹g(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因大豆實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

3.2 問卷調(diào)查

在連續(xù)兩年課堂教學(xué)的實(shí)踐之后，通過問卷的形式，針對(duì)學(xué)生對(duì)課堂教學(xué)的滿意度及知識(shí)掌握程度、實(shí)驗(yàn)開設(shè)的必要性等問題進(jìn)行了調(diào)查與評(píng)估，同時(shí)收集了學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和課堂教學(xué)模式的意見與建議。調(diào)查結(jié)果如圖2～3所示。

圖2 對(duì)教學(xué)效果調(diào)查結(jié)果

圖3 對(duì)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)意義調(diào)查結(jié)果

問卷調(diào)查結(jié)果顯示，針對(duì)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，41.38%的學(xué)生表示之前從未接觸過該技術(shù)，48.28%的學(xué)生反映僅接觸過一點(diǎn)相關(guān)知識(shí)；針對(duì)微流控技術(shù)，91.38%的學(xué)生表示之前從未接觸過相關(guān)知識(shí)。通過課堂上技術(shù)原理的講解和實(shí)際動(dòng)手實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)教學(xué)達(dá)到了較好的效果，其中79.04%的學(xué)生對(duì)微流控技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料的方法和原理有了較好的理解，而對(duì)于更深層次的LAMP技術(shù)，62.38%的學(xué)生能夠有較好的理解。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)置，82.85%的學(xué)生認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)選題新穎，能夠?qū)W習(xí)到生命科學(xué)最前沿的知識(shí)和技術(shù)，且與日常生活密切相關(guān)，應(yīng)用性很強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)的開展很有意義。學(xué)生也對(duì)該實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)意義進(jìn)行了肯定，認(rèn)為在該實(shí)驗(yàn)中能夠同時(shí)學(xué)習(xí)到微流控技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和轉(zhuǎn)基因材料鑒定技術(shù)，使課堂知識(shí)與實(shí)踐生活得到了很好的結(jié)合。

在課堂教學(xué)過程中，學(xué)生對(duì)該實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出了濃厚的興趣，課堂氣氛活躍，討論熱烈，在完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)的同時(shí)，也為該實(shí)驗(yàn)的課堂教學(xué)設(shè)計(jì)提出一些很好的意見和建議，如希望教師在講解過程中多增加一些對(duì)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)原理的講述，以及進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)參與度，并希望在等溫?cái)U(kuò)增引物設(shè)計(jì)、微流控芯片工作原理等方面有更多的了解，學(xué)生的積極反饋也為教師后期進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、提高教學(xué)效果提供了很大助力。

3.3 教學(xué)成效

微流控芯片核酸檢測技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料實(shí)驗(yàn)課程實(shí)施兩年來，取得了較為理想的教學(xué)效果。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)聚焦社會(huì)技術(shù)熱點(diǎn)，選取轉(zhuǎn)基因材料為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，吸引學(xué)生濃厚的興趣，具有較強(qiáng)的應(yīng)用性；選取等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和微流控芯片技術(shù)相結(jié)合的微流控芯片核酸檢測技術(shù)為檢測方法，操作簡便，反應(yīng)迅速、有利于課堂教學(xué)的順利實(shí)施；等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為經(jīng)典的PCR擴(kuò)增技術(shù)的拓展和延伸，在實(shí)際應(yīng)用中具有特殊的優(yōu)勢，是技術(shù)創(chuàng)新的典型案例，是遺傳學(xué)教學(xué)內(nèi)容很好的補(bǔ)充，能夠幫助學(xué)生拓展思路、培育創(chuàng)新精神；微流控芯片核酸檢測技術(shù)作為生物學(xué)與化學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科交叉融合的創(chuàng)新成果，同時(shí)也是生命科學(xué)應(yīng)用于實(shí)際生活的最前沿技術(shù)，能夠開闊學(xué)生的視野，培養(yǎng)學(xué)生從實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力。課程實(shí)踐的初步結(jié)果顯示，學(xué)生對(duì)該實(shí)驗(yàn)的認(rèn)可度很高，這有利于后期的進(jìn)一步實(shí)踐和推廣。

4 結(jié) 語

遺傳學(xué)是一門歷史悠遠(yuǎn)的學(xué)科，近年來的發(fā)展十分迅猛。在經(jīng)典的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程基礎(chǔ)上引入新技術(shù)、新方法、新案例，對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)課程的趣味性，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，激發(fā)學(xué)生主動(dòng)學(xué)習(xí)的熱情，具有極大的意義。在近兩年的教學(xué)實(shí)踐中嘗試引入微流控芯片核酸檢測技術(shù)快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料實(shí)驗(yàn)的案例，獲得了學(xué)生的高度認(rèn)可，取得了較好的教學(xué)效果。未來將進(jìn)一步探索新技術(shù)與經(jīng)典遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)相融合的教學(xué)模式，在傳授學(xué)科基礎(chǔ)知識(shí)和基本原理的同時(shí)，幫助學(xué)生開闊視野，緊跟前沿科技的發(fā)展，提升學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和科學(xué)素養(yǎng)，培育出更多適應(yīng)于當(dāng)代生物科技發(fā)展需求的創(chuàng)新型人才。