小型綜合科研實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生科研能力的探索

胡 俊， 趙 熠， 楊國(guó)華， 趙 旻， 武軍駐

（武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430072）

0 引 言

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)是醫(yī)學(xué)教育的理論基礎(chǔ)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)是理論知識(shí)和實(shí)踐操作的連接，是培養(yǎng)學(xué)生科研能力的重要途徑?！秶?guó)家中長(zhǎng)期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱要（2010-2020年）》要求高等院校“針對(duì)不同層次、不同類型人才培養(yǎng)的特點(diǎn)，改進(jìn)專業(yè)培養(yǎng)方案，構(gòu)建科學(xué)的課程體系和學(xué)習(xí)支持體系”。傳統(tǒng)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系通常以形態(tài)學(xué)、機(jī)能學(xué)、病原生物學(xué)、解剖學(xué)、分子生物學(xué)等專業(yè)進(jìn)行劃分，教學(xué)過(guò)程中強(qiáng)調(diào)本學(xué)科實(shí)驗(yàn)知識(shí)技術(shù)的應(yīng)用性和獨(dú)立性，使知識(shí)體系有所割裂。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)一些醫(yī)學(xué)院校在嘗試進(jìn)行基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，通過(guò)課程整合使之成為結(jié)構(gòu)性好、整體協(xié)調(diào)的新型課程［1-5］，使學(xué)生能在短時(shí)間內(nèi)系統(tǒng)掌握各基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理和操作。實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革更重要的目的是培養(yǎng)學(xué)生的科研意識(shí)、科研思維和科研能力，激發(fā)學(xué)生的科研熱情和科研興趣，提高學(xué)生的綜合科研素質(zhì)［6-9］。

本研究以目前在生物醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)和慢病毒表達(dá)系統(tǒng)為切入點(diǎn)，一方面將兩項(xiàng)重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)融合為一個(gè)小型綜合實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)本科生開展系統(tǒng)科研的能力，另一方面更著重于引導(dǎo)本科生了解生物醫(yī)學(xué)科研前沿，培養(yǎng)他們對(duì)科研的興趣和熱愛，為推進(jìn)學(xué)生自主開展大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練科研項(xiàng)目、提前進(jìn)入PI（principle investigator）學(xué)術(shù)帶頭人實(shí)驗(yàn)室從事科學(xué)研究等提供扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）及其演變來(lái)的突變體（紅色熒光蛋白R(shí)FP、黃色熒光蛋白YFP等）因具有良好的熒光激發(fā)特性、穩(wěn)定的真原核細(xì)胞表達(dá)、分子量較小易于進(jìn)行基因融合表達(dá)等特性，被廣泛應(yīng)用為蛋白質(zhì)定位的分子標(biāo)記和報(bào)告基因，是當(dāng)前生物及生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的一類熒光標(biāo)記。

在生物醫(yī)學(xué)研究中，GFP作為熒光標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物水平的研究［10-11］。在細(xì)胞水平上，利用基因融合技術(shù)，將目的基因與熒光蛋白序列融合表達(dá)，從而開展目標(biāo)基因時(shí)空表達(dá)、細(xì)胞器及功能位點(diǎn)活細(xì)胞定位、亞細(xì)胞水平細(xì)胞器動(dòng)態(tài)變化等研究。在動(dòng)物水平上，熒光蛋白主要作為熒光標(biāo)記用于小動(dòng)物活體熒光成像。小動(dòng)物活體成像技術(shù)采用高靈敏度制冷CCD相機(jī)配合特制的成像暗箱和圖像處理軟件，可以直接監(jiān)控活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程［12-15］。

GFP在細(xì)胞水平的應(yīng)用可通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或是構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)，使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標(biāo)記細(xì)胞株開展細(xì)胞水平研究比瞬時(shí)轉(zhuǎn)染更為方便，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更為穩(wěn)定可靠。在動(dòng)物水平上使用GFP作為熒光標(biāo)記進(jìn)行長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察，則以使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標(biāo)記細(xì)胞系為佳。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標(biāo)記細(xì)胞株在生物醫(yī)學(xué)科研中具有廣泛的應(yīng)用，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的熒光標(biāo)記細(xì)胞株對(duì)于開展生物醫(yī)學(xué)科研具有非常重要的作用。

目前，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系效率最高的技術(shù)途徑是慢病毒技術(shù)［16-17］。慢病毒載體是基于人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的載體系統(tǒng)，由包裝載體和表達(dá)載體兩部分組成。慢病毒載體系統(tǒng)刪除了全部HIV-1的編碼基因，在介導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)不會(huì)表達(dá)HIV-1蛋白，其安全性已在國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期科研實(shí)踐中得到了充分證實(shí)。

小型綜合科研實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容和技術(shù)路線如圖1所示。通過(guò)構(gòu)建一個(gè)基于慢病毒系統(tǒng)的GFP表達(dá)載體，經(jīng)慢病毒包裝和感染后篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的A549細(xì)胞系，再使用該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，最后活體觀察裸鼠體內(nèi)腫瘤的綠色熒光。

圖1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

這個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目融合了基因克隆、載體構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、病毒收集、病毒感染、裸鼠成瘤等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)、病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，又涉及激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)等常用大型實(shí)驗(yàn)設(shè)備的使用，具有很強(qiáng)的綜合性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目旨在帶領(lǐng)醫(yī)學(xué)本科生從實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)安排、實(shí)驗(yàn)實(shí)施等多個(gè)方面了解生物醫(yī)學(xué)科研如何由淺顯到深入的開展，對(duì)醫(yī)學(xué)本科生進(jìn)行系統(tǒng)科研啟蒙。

2 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 質(zhì)粒和細(xì)胞株

真核熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1、慢病毒表達(dá)質(zhì)粒PLVX-PURO、慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G、人腎上皮細(xì)胞系HEK293T和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549均來(lái)自武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心。

2.2 主要試劑

分子克隆所用超強(qiáng)高保真PCR試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品D2000 DNA marker和1 kb plus ladder、DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；內(nèi)切酶XmaI、XbalI和T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用的DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、胰酶消化液購(gòu)自Hyclone；脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

2.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)賓得）、倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯）、激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯）、流式細(xì)胞儀（貝克曼Cytoflex）、小動(dòng)物活體成像儀（美國(guó)BRUKER）。

3 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

3.1 慢病毒GFP熒光載體構(gòu)建

慢病毒GFP熒光載體PLVX-Puro-GFP的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2（a）所示。以pEGFP-C1質(zhì)粒為模板，使用引物GFP-FULL-XmaI-F和GFP-FULL-XbaI-R（見表1）擴(kuò)增獲得GFP片段［見圖2（b）］；使用XmaI和XbaI雙酶切PCR擴(kuò)增的GFP片段和PLVX-Puro質(zhì)粒，回收片段和質(zhì)粒后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化［見圖2（c）］。從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑選3個(gè)單菌落小搖培養(yǎng)過(guò)夜后，以菌液為模板，使用引物GFP-F和GFP-R（見表1）進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)克隆中有2個(gè)能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，為GFP陽(yáng)性克?。垡妶D2（d）］；將2個(gè)GFP陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，使用XmaI和XbaI雙酶切進(jìn)行酶切鑒定，電泳檢測(cè)能觀察到載體片段和GFP插入片段［見圖2（e）］，進(jìn)一步確認(rèn)這2個(gè)克隆為陽(yáng)性克隆。測(cè)序顯示插入的GFP片段序列完全正確，陽(yáng)性克隆可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 慢病毒GFP表達(dá)載體PLVX-Puro-GFP的構(gòu)建

表1 載體構(gòu)建所用引物

3.2 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的A549-GFP熒光細(xì)胞系構(gòu)建

（1）細(xì)胞培養(yǎng)。HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中；A549培養(yǎng)于含有10%FBS的MEM完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)使用胰酶消化液常規(guī)消化傳代。

（2）慢病毒包裝。使用慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G和表達(dá)質(zhì)粒PLVX-Puro-GFP共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)293T細(xì)胞中都能觀察到綠色GFP熒光信號(hào)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染效率較好，慢病毒包裝成功［見圖3（a）］。收集培養(yǎng)基，0.45 μm濾器過(guò)濾后即得慢病毒毒液。

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化A549-GFP熒光細(xì)胞系的建立

（3）慢病毒感染A549細(xì)胞及藥物篩選。提前1

天將A549細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中培養(yǎng)，每孔加入0.5 mL

慢病毒毒液，感染24 h后更換含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行藥物篩選和持續(xù)培養(yǎng)。傳代2次后進(jìn)行檢測(cè)，激光共聚焦顯微鏡拍攝觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞都有GFP熒光［見圖3（b）］，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示97.5%的細(xì)胞為GPF陽(yáng)性細(xì)胞［見圖3（c）］，說(shuō)明篩選獲得的A549-GFP熒光細(xì)胞系純度很高，可以用于后續(xù)成瘤實(shí)驗(yàn)。

3.3 A549-GFP細(xì)胞成瘤及活體熒光檢測(cè)

將A549-GFP細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后制成107／0.1 mL細(xì)胞懸液（PBS重懸），注射于4周齡裸鼠皮下。注射后7天左右即可觀察到皮下有腫瘤形成，培養(yǎng)3周后腫瘤明顯增大［見圖4（a）］。將麻醉后的成瘤裸鼠放置于小動(dòng)物活體成像儀中進(jìn)行檢測(cè)，在488 nm左右的激發(fā)光下，能觀察到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)［見圖4（b）］。

圖4 活體檢測(cè)腫瘤熒光

4 結(jié) 語(yǔ)

本項(xiàng)目將熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)和慢病毒表達(dá)系統(tǒng)這兩項(xiàng)重要科研技術(shù)融合建立了一個(gè)小型綜合實(shí)驗(yàn)，帶領(lǐng)醫(yī)學(xué)本科生從實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)安排、實(shí)驗(yàn)實(shí)施等多個(gè)方面，真真切切了解生物醫(yī)學(xué)科研如何由淺顯到深入地開展，如何合理地設(shè)計(jì)和開展科研實(shí)驗(yàn)，真切體會(huì)一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)的完整實(shí)施歷程，培養(yǎng)本科生的科研素質(zhì)。

本綜合實(shí)驗(yàn)中既有基因克隆、載體構(gòu)建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，又有細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，還有慢病毒包裝、慢病毒收集、慢病毒感染等病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)還設(shè)計(jì)了裸鼠成瘤及小動(dòng)物活體觀察腫瘤熒光信號(hào)等動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，涉及激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)等大型儀器的操作使用，是一個(gè)融合了多種專業(yè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和檢測(cè)手段的綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，既能面向醫(yī)學(xué)本科生作為系統(tǒng)科研的啟蒙，也能面向研究生作為科研技術(shù)培訓(xùn)項(xiàng)目。