納米金比色法檢測乙肝病毒核酸綜合性實驗

溫聰穎， 李 想， 張瑞巧， 李怡敏， 周 亭， 曾景斌

（1.中國石油大學（華東）化學化工學院，重質(zhì)油國家重點實驗室，山東 青島 266580；2.青島市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 青島 266100）

0 引 言

近年來，納米金由于具有獨特的光學性質(zhì)、良好的化學穩(wěn)定性及生物相容性，且易于修飾等特點受到了廣泛關注［7-9］?；谄浒l(fā)展的比色技術操作簡便省時、無需大型儀器，在現(xiàn)場即時檢測中展現(xiàn)出巨大的應用潛力。其檢測原理主要是基于被檢對象引起納米金狀態(tài)改變導致溶液變色，從而用裸眼即可判讀檢測結果［10-12］?；诖?，本文以乙肝病毒核酸為模式目標物，利用納米金技術設計了一種病毒核酸的比色檢測法。該法通過在納米金上分別修飾與乙肝病毒核酸兩端互補的DNA序列，利用其與目標核酸通過堿基互補配對實現(xiàn)雜交，形成納米金團聚，使顏色發(fā)生從紅色到藍色的明顯變化，從而實現(xiàn)比色檢測。該實驗從材料制備、表征、修飾到應用，內(nèi)容完整并具有較強的可操作性，融合了材料、化學、生物、醫(yī)學等多個學科的理論知識以及相關的實驗方法和技術，并緊密聯(lián)系科學前沿，具有較高的綜合性、交叉性和前瞻性，適合在相關專業(yè)高年級本科生中開設，有利于高校綜合型創(chuàng)新人才的培養(yǎng)。

1 實驗設計

圖1展示了本實驗的流程、實施方法和預期目標。實驗開始前，學生通過參觀實驗室、查閱文獻、交流討論等方式，熟悉實驗內(nèi)容；然后實施實驗，包括納米金的制備、DNA修飾及病毒核酸檢測；接著進行數(shù)據(jù)整理、分析和總結，并撰寫論文；最后以學術答辯的形式進行考核。本實驗通過模擬科學研究的一般步驟，讓學生體驗一套完整的科研訓練過程，能夠極大地培養(yǎng)學生的綜合實驗能力及科研素養(yǎng)。

圖1 實驗流程、實施方法和預期目標

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

試劑：氯金酸、氯化鈉、六水合氯化鎂、二水合檸檬酸三鈉、甲酰胺、鹽酸、硫酸葡聚糖鈉鹽（M.W.500000）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等購自國藥集團化學試劑有限公司，乙肝病毒DNA片段（5′-ATA CCA CAT CAT CCA TAT AAC TGA AAG CCA-3′）、丙肝病毒RNA反轉錄DNA片段（5′-ATC TCC AGG CAT TGA GCG GGT TTA TCC ACG A-3′）、艾滋病毒RNA反轉錄DNA片段（5′-CCA TGA ATT TAG TTG CGC CTG GTC CTT TAA-3′）、乙肝病毒互補DNA片段1（HS-5′-AAA AAA AAAAAATGG ATG ATG TGG TAT-3′）、乙肝病毒互補DNA片段2（HS-5′-AAA AAA AAAAAATGG CTT TCA GTT ATA-3′）購自Invitrogen公司。

儀器：電子天平（奧豪斯儀器有限公司，PWS224ZH／E），離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司，TGL-16），動態(tài)光散射儀（Malvern ZetaSizer Nano ZS），透射電鏡（日本電子株式會社，JEM-1400），紫外-可見分光光度計（日本島津公司，UV-2450），控溫磁力攪拌器（愛博特科技有限公司，ZNCL-TS），恒溫振蕩器（上海精宏實驗設備有限公司，THZ-312），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ2200）。

2.2 納米金的制備

采用檸檬酸鈉還原法制備納米金［13］：取5 mL 24.28 mmol／L的氯金酸溶液，用超純水定容至100 mL，轉移至燒瓶中，在攪拌下加熱回流；待溶液煮沸后向其中迅速加入10 mL新配制的檸檬酸三鈉溶液（38.8 mmol／L），繼續(xù)加熱15 min，在此過程中溶液顏色由黃色變?yōu)楹谏詈蟪尸F(xiàn)酒紅色，停止加熱，存于4 °C待用。

2.3 乙肝病毒核酸靶向的納米金生物探針構建

采用低pH輔助法［14-16］，通過巰基與金的配位作用，在納米金上修飾巰基化的乙肝病毒核酸的互補DNA片段，兩種片段的修飾方法一致，具體為：在500 μL上述納米金溶液中加入15 μL 100 μmol／L的巰基化DNA片段，渦旋混勻，在恒溫振蕩器上室溫反應5 min，再加入10 μL檸檬酸緩沖溶液（500 mmol／L，pH3.0），繼續(xù)反應30 min，將產(chǎn)物離心洗滌3次以除去未反應的DNA片段（離心條件：12 000 r／min，15 min）；最后將產(chǎn)物分散到500 μL Tris緩沖溶液（20 mmol／L，pH 8.0）中，分別命名為探針1、探針2，存于4 °C待用。

2.4 納米金生物探針用于乙肝病毒核酸的檢測

2.4.1 檢測的基本方案

醫(yī)療機構是引起醫(yī)源性感染的重要場所。醫(yī)院消毒是預防醫(yī)源性感染的重要措施,消毒與滅菌質(zhì)量監(jiān)測又是評價消毒與滅菌效果的重要手段[1]。為了解新鄉(xiāng)市醫(yī)療機構消毒與滅菌質(zhì)量狀況和相關部門進行醫(yī)院消毒管理和監(jiān)督工作提供理論依據(jù),現(xiàn)回顧性分析新鄉(xiāng)市2015-2017年各級醫(yī)療機構的消毒監(jiān)測結果,現(xiàn)統(tǒng)計如下:

首先配制雜交液，在20 mmol／L、pH 8.0 Tris緩沖溶液中加入甲酰胺、硫酸葡聚糖和MgCl2，使其終濃度分別為20%、16%和3.75 mmol／L，再根據(jù)實驗需求添加一定量的NaCl，然后將制備的兩種納米金探針與雜交液以體積比3∶3∶4（探針1∶探針2∶雜交液）混合配成檢測工作液，取200 μL工作液與100 μL待檢樣品混合，在恒溫振蕩器上反應，根據(jù)實驗需求選擇反應溫度和時間，待反應結束后觀察顏色變化并測定紫外-可見吸收光譜。

2.4.2 檢測條件的優(yōu)化

采用單因素變量法優(yōu)化反應溫度、時間和鹽度，所有陽性組乙肝病毒核酸的濃度都設定為0.1 μmol／L，所有空白對照組均加入等體積的超純水，每組實驗均重復3次。

反應溫度的優(yōu)化：雜交液中NaCl濃度設定為0.3 mol／L，反應分別在25、30、35、40、45 °C下進行，各反應1.5 h后測定吸收光譜，確定最佳溫度。

反應時間的優(yōu)化：雜交液中NaCl濃度設定為0.3 mol／L，反應溫度設定為最佳溫度，分別孵育1、5、10、30、50、70、90 min后，測定吸收光譜確定最佳時間。

檢測體系鹽度的優(yōu)化：雜交液中NaCl濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6 mol／L，在最佳溫度下孵育最佳時間，測定吸收光譜確定最佳鹽度。

2.4.3 檢測方法的特異性實驗

在優(yōu)化后的最佳反應條件下（反應溫度30 °C；反應時間5 min；NaCl濃度0.4 mol／L），分別檢測0.1 μmol／L的乙肝病毒DNA、0.01 mmol／L丙肝病毒的反轉錄DNA、0.01 mmol／L艾滋病毒的反轉錄DNA，并采用超純水作為空白對照組，每組實驗重復3次，反應結束后測定吸收光譜。

2.4.4 檢測方法的重現(xiàn)性實驗

在優(yōu)化后的最佳反應條件下（反應溫度30 °C；反應時間5 min；NaCl濃度0.4 mol／L），用同一批次制備的探針分別檢測5組0.1 μmol／L的乙肝病毒DNA，測定吸收光譜，計算組內(nèi)相對標準偏差；采用不同批次制備的探針分別測定5組0.1 μmol／L的乙肝病毒DNA，測定吸收光譜，計算組間相對標準偏差。

2.4.5 不同濃度的乙肝病毒核酸的檢測

在優(yōu)化后的最佳反應條件下（反應溫度30 °C；反應時間5 min；NaCl濃度0.4 mol／L），分別檢測5×10－3、1×10－2、5×10－2、1×10－1、5×10－1、1 μmol／L的乙肝病毒DNA，測定吸收光譜，以光譜信號對濃度進行線性擬合得到標準曲線，同時測定11組空白樣品的信號，計算標準偏差。

3 結果與討論

3.1 納米金的表征

實驗所制得的納米金溶液呈現(xiàn)酒紅色（見圖2（a）），最大吸收波長為525 nm（見圖2（b））。由透射電鏡圖（見圖2（c））可以看出，納米金尺寸均勻，具有良好的單分散性，沒有發(fā)生團聚，粒徑統(tǒng)計（見圖2（d））顯示納米金的平均粒徑為（14.4±1.7）nm。

圖2 納米金的表征

3.2 納米金生物探針的表征

在低pH環(huán)境下，DNA能夠快速吸附到納米金表面，進而通過巰基與金的配位作用實現(xiàn)偶聯(lián)［14］，本實驗中與乙肝病毒核酸互補的兩段DNA序列的5′端各加入12個腺嘌呤（A）作為連接臂，目的是為了減少后續(xù)檢測時反應的空間位阻。納米金偶聯(lián)DNA后，水合粒徑增大，如圖3（a）所示，未修飾的納米金水合粒徑約為15 nm，修飾DNA后水合粒徑增至22 nm左右（探針1、2）。納米金和探針溶液中分別加入1 mol／L NaCl，納米金迅速變藍（圖3（b），①），表明納米金發(fā)生團聚，而探針1和探針2依然保持酒紅色（圖3（b），②、③），與納米金原液相比幾乎沒有明顯顏色變化（圖3（b），④），說明探針1、2在高鹽度的環(huán)境下仍然保持較好的單分散性。這是因為納米金主要是通過彼此間的靜電斥力穩(wěn)定存在溶液中，當加入大量鹽時，會屏蔽納米金表面的電荷，進而發(fā)生團聚；而在納米金表面修飾上DNA后，由于DNA對納米金的穩(wěn)定作用，使其在高鹽度環(huán)境中也不會團聚［17-18］。納米金探針水合粒徑的增大及穩(wěn)定性的提高證明DNA被成功修飾到納米金表面。進一步通過透射電鏡和吸收光譜進行表征，如圖3（c）～（f）所示，兩種探針均保持良好的單分散性，與未修飾的納米金相比（圖2（b）、（c）），尺寸和吸收光譜都沒有明顯的變化，表明修飾過程并未造成納米金團聚，也沒有改變納米金的光學性質(zhì)。

圖3 （a）納米金、探針1、2的水合粒徑；（b）納米金及探針的穩(wěn)定性測試：①～③依次為納米金、探針1、2加入1 mol／L NaCl的照片，④納米金原液的照片；（c）、（d）探針1、2的透射電鏡圖；（e）、（f）探針1、2的吸收光譜圖

3.3 納米金生物探針用于乙肝病毒核酸檢測的原理及可行性驗證

檢測原理示意圖如圖4（a）所示，探針1、2遇到目標DNA片段時，會通過堿基互補配對原則進行雜交反應，從而縮短納米金顆粒間的距離進而發(fā)生團聚，納米金溶液從酒紅色變成藍紫色，這樣就實現(xiàn)了目標病毒核酸的可視化檢測。對該方案的可行性進行了驗證：納米金生物探針用于陽性樣品（含有0.1 μmol／L的乙肝病毒核酸）檢測時，溶液顏色變成了藍紫色，而空白樣品（不含乙肝病毒核酸）保持酒紅色（圖4（b）），相應的吸收光譜顯示空白組的吸收光譜沒有發(fā)生明顯變化，最大吸收波長依然在525 nm左右，而陽性組最大的吸收峰紅移至590 nm左右（圖4（c））；透射電鏡表征顯示空白組的探針呈現(xiàn)單分散狀態(tài)，而陽性組的探針出現(xiàn)較嚴重的聚集狀態(tài)，更直觀地展示了納米金探針與目標DNA雜交后引起的團聚反應（圖4（d）～（e））。以上實驗結果表明該檢測方案切實可行，后續(xù)采用590 nm處吸收值與525 nm處吸收值的比值（A590／525）作為檢測信號。

圖4 （a）納米金生物探針用于乙肝病毒核酸檢測原理的示意圖；（b）空白組和陽性組的照片；（c）空白組和陽性組的吸收光譜圖；（d）空白組的透射電鏡圖；（e）陽性組的透射電鏡圖；陽性樣品里含有10－7 mol／L的乙肝病毒核酸，空白樣品中加入等體積的超純水

3.4 最優(yōu)檢測條件的探討

對檢測過程中的孵育溫度、反應時間、NaCl濃度進行了優(yōu)化，結果如圖5所示。隨著反應溫度的升高，信噪比（陽性信號與空白信號的比值）先增大后減小，在30 °C時達到最大值（圖5（a）），這是因為升高溫度有助于提高反應速率，但溫度過高也可能會導致DNA解鏈，故選用30 °C作為最佳反應溫度；而反應時間對檢測信號影響不大（圖5（b）），說明該反應速度很快，為了保證反應充分，選擇5 min作為最佳反應時間；DNA的雜交需要一定的離子強度，如圖5（c）所示，NaCl的添加濃度為0.4 mol／L時，信噪比最大，故在檢 測體系用0.4 mol／L的NaCl保持離子強度。

圖5 檢測條件的優(yōu)化（柱狀圖上方給出的是陽性組信號與空白組信號的比值，誤差線＝±標準偏差（重復3次））

3.5 檢測的特異性與重現(xiàn)性

將該方法用于丙肝病毒的反轉錄DNA和艾滋病毒的反轉錄DNA的檢測，結果如圖6所示，即使非目標DNA的濃度高出乙肝病毒DNA100倍時，仍不能產(chǎn)生明顯的信號，均與未加DNA的空白樣品相差不大，這說明該方法具有良好的特異性。進一步利用同一批次的納米金探針進行組內(nèi)重復性實驗、不同批次的納米金探針進行組間重復性實驗，得組內(nèi)相對標準偏差為0.51%，組間相對標準偏差為0.85%，表明該方法重現(xiàn)性較好（見表1）。

圖6 納米金生物探針檢測不同病毒核酸和空白樣品所得的信號值

表1 本方法的組內(nèi)及組間重現(xiàn)性

3.6 檢測的定量范圍及檢測限

用該方法檢測不同濃度的乙肝病毒DNA，所得信號隨著目標DNA濃度的增大而增大（見圖7），在5～1 000 nmol／L范圍內(nèi)具有良好的線性關系。進一步測定11組空白樣品的信號，得平均值為0.411，標準偏差為0.004 3。以空白樣品信號的平均值與其3倍標準偏差的和為可測量的最小檢測信號［19］，將最小檢測信號代入到標準曲線的方程中，算出檢測限為0.66 nmol／L。

圖7 納米金生物探針用于乙肝病毒核酸檢測的標準曲線

4 結 語

本實驗基于納米金技術構建了可以識別乙肝病毒核酸的生物探針，進而通過雜交反應，形成納米金團聚，產(chǎn)生顏色變化，實現(xiàn)了乙肝病毒核酸的簡便快速檢測。實驗涉及材料、化學、生物、醫(yī)學等多個學科的理論知識以及相關的實驗方法和技術，具有較強的綜合性和交叉性，且立足學術前沿，圍繞病毒檢測等社會熱點問題，在我校吸引了大批化學、材料等相關專業(yè)的學生開展實驗。教學效果顯示學生對實驗項目懷有極大的熱情，能夠充分發(fā)揮其自身的主觀能動性，圓滿完成課題。本實驗從文獻調(diào)研到實驗實施再到論文撰寫和答辯，基本涵蓋了科學研究的一般步驟，能夠讓學生體驗一套完整的科研訓練過程，從而極大地提高綜合實驗能力和科研素養(yǎng)，助力復合型人才和創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)。