杜仲葉抗氧化研究進(jìn)展

李博聞， 張立攀

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450000）

機(jī)體的新陳代謝會(huì)不斷產(chǎn)生自由基，正常情況下自由基的產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡，但一旦平衡被打破，自由基就會(huì)大量積累并攻擊細(xì)胞，干擾人體正常的生理生化反應(yīng)，誘發(fā)各種疾病，研究表明氧化反應(yīng)幾乎和所有疾病都有著緊密的聯(lián)系［1-2］. 為了減緩氧化反應(yīng)，抗氧化劑或抗氧化食品得到了廣泛的推廣應(yīng)用，抗氧化劑具有消除活性氧（reactive oxygen species，ROS），抑制自由基反應(yīng)，修復(fù)細(xì)胞損傷等作用. 傳統(tǒng)的抗氧化劑包括合成和天然兩類，但是合成抗氧化劑具有潛在的毒副作用，所以天然抗氧化劑因其安全性高、抗氧化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)備受消費(fèi)者青睞. 天然抗氧化劑來源廣泛如自然界的動(dòng)植物及微生物，大量研究證明中藥材也是抗氧化天然產(chǎn)物的重要載體，如靈芝多糖、枸杞多糖、金銀花多酚、杜仲葉黃酮等［3-5］，且其藥效與抗氧化功能聯(lián)系密切［6-7］. 大多數(shù)中藥材兼具藥食兩用及傳統(tǒng)食用習(xí)俗優(yōu)勢(shì)，有著廣泛的開發(fā)前景.

杜仲在我國(guó)種植面積廣泛，資源豐富，既是我國(guó)特有的名貴中藥材又是“藥食兩用”物質(zhì)，中醫(yī)常以皮入藥，具有降糖、降壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗衰老、抗癌等諸多功效［8］. 但杜仲皮資源短缺，價(jià)格昂貴，極大限制了杜仲資料的開發(fā)利用，研究表明杜仲葉與皮具有相似的功效成分包括黃酮類、綠原酸、環(huán)烯醚萜類、多糖、多酚、木脂素等. 杜仲葉資源豐富，方便采集. 近年來，關(guān)于杜仲葉的研究主要集中在藥用領(lǐng)域，且以抗氧化活性的研究居多，因此針對(duì)杜仲葉抗氧化活性成分、影響因素、抗氧化機(jī)理、評(píng)價(jià)方法等進(jìn)行系統(tǒng)性整理，以便為杜仲功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 杜仲葉抗氧化活性成分

1.1 綠原酸

綠原酸（chlorogenic acid，CA）是植物體內(nèi)重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗病毒、抗菌、保肝利膽、降壓、降脂、消除自由基等功能［9］.《中國(guó)藥典》將綠原酸作為杜仲葉質(zhì)量控制的唯一指標(biāo). 杜仲葉中綠原酸含量高于杜仲皮，可達(dá)1%～5%［9］. 李文娜等［10］發(fā)現(xiàn)杜仲葉綠原酸提取物對(duì)DPPH·、O2-、·OH、烷基自由基清除能力均高于綠原酸、VC，IC50達(dá)14 μg/mL. 曾橋等［11］利用響應(yīng)面法優(yōu)化杜仲葉茯磚茶綠原酸提取工藝并發(fā)現(xiàn)在0.28 mg/mL時(shí)其還原能力遠(yuǎn)高于VC.

1.2 總黃酮

黃酮是以2-苯基色原酮為母體的一類植物代謝產(chǎn)物，廣泛分布于自然界中，具有抑菌、抗氧化、消炎、防癌等功能［12］，目前杜仲葉中共分離出十幾種黃酮類化合物，如蘆丁、金絲桃苷、山柰酚、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、異槲皮苷等. 杜仲不同部位黃酮含量差異性較大，以杜仲葉含量最高達(dá)9.02%［12］，且老葉含量高于嫩葉. 鐘淑娟等［13］發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮對(duì)ATBS+、DPPH·及Cu2+清除能力均高于雄花、皮、籽.

1.3 總多酚

杜仲葉富含多酚類化合物，研究表明杜仲葉抗氧化活性物質(zhì)以總黃酮和總多酚為基礎(chǔ)［14］. 劉迪等［7］利用大孔吸附樹脂純化杜仲葉多酚，并證明其具有良好的體外抗氧化能力. 李陸軍等［15］采用表面活性劑法提取杜仲葉多酚，得率達(dá)6.77%，并且對(duì)·OH、ABTS+、DPPH·自由基具有明顯的清除能力.

1.4 多糖

多糖是細(xì)胞壁的重要組成部分，資源豐富，杜仲葉中粗多糖含量為0.98 g/100 g，具有抗病毒、抗衰老、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功效. 雷燕妮等［16］分離制備杜仲葉多糖并發(fā)現(xiàn)其對(duì)DPPH·、O2-、·OH等均具有較強(qiáng)的清除能力. 曾橋等［17］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)杜仲葉多糖在100 μg/mL時(shí)對(duì)ABTS+清除率達(dá)98.74%，當(dāng)60 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·自由基清除率達(dá)69.28%.

1.5 環(huán)烯醚萜類化合物

杜仲鮮葉中環(huán)烯醚萜類化合物含量高于老葉，約5.07 mg/g［18］. 杜仲葉中共分離出20多種環(huán)烯醚萜類化合物包括車葉草甘、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、杜仲苷、杜仲醇、哈帕甙乙酸酯等［19］. 藥理學(xué)研究表明環(huán)烯醚萜類化合物具有諸多功能活性，如京尼平苷酸具有保肝利膽、增強(qiáng)免疫力等功效，桃葉珊瑚苷具有抑菌、利尿、抗病毒等功能［20］. 彭勝［21］通過對(duì)杜仲葉抗氧化活性成分分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)綠原酸、桃葉珊瑚甙、京尼平甙酸、總黃酮等均具有良好的自由基清除能力.

2 影響抗氧化活性的因素

2.1 種植因素

1）產(chǎn)地. 杜仲在我國(guó)種植面積廣泛，主要分布在河南、湖北、陜西、江西、安徽等地［22］，不同產(chǎn)地的氣候、溫濕度、海拔、土壤條件等差異性較大，杜仲葉活性成分的形成和積累與其生長(zhǎng)的自然環(huán)境密切相關(guān)［23］. 吳可心等［24］對(duì)陜西、四川等8個(gè)地區(qū)杜仲葉活性成分檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)的杜仲葉綜合價(jià)值最高.

2）采摘季節(jié). 為了保證杜仲葉的質(zhì)量和產(chǎn)量，及時(shí)采摘能夠減少有效成分損失，保持最佳外形質(zhì)地，蘭濟(jì)艷等［25］對(duì)杜仲葉活性成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)最佳采收期宜控制在7—8月份.

3）品種. 品種是影響杜仲活性成分的重要因素，同一杜仲，即使同屬，品種不同，質(zhì)量也不盡相同，據(jù)統(tǒng)計(jì)杜仲良種共39種，每個(gè)品種都有其選育目的，如藥用、膠用、茶用等. 此外，矮樹種杜仲葉抗氧化活性普遍比高樹種強(qiáng)［26］.

4）植株部位與樹齡. 杜仲葉、籽、皮、花等化學(xué)成分相似但含量相差較大［26］，如杜仲葉中黃酮含量高于其他部位，抗氧化能力更強(qiáng)［14］. 中藥材藥效常與生長(zhǎng)時(shí)間關(guān)系密切，如中醫(yī)常以20年以上杜仲皮入藥，而關(guān)于杜仲葉隨樹齡增加的成分變化研究目前較少，張威鵬等［27］發(fā)現(xiàn)隨樹齡的增加杜仲葉中黃酮類物質(zhì)、苯丙素類物質(zhì)逐年減少，木質(zhì)素類含量呈遞增趨勢(shì)，25年生杜仲葉中木質(zhì)素含量最高.

5）施肥條件. 生態(tài)因子是影響杜仲葉的功能成分的直接或間接的因子，其中微量元素能夠干擾根系營(yíng)養(yǎng)、代謝、藥效成分的構(gòu)成及化學(xué)成分積累. 彭密軍等［28］對(duì)杜仲葉面噴施鐵、鋅、錳復(fù)合肥，可以提高總黃酮、總多酚、綠原酸等成分含量.

綜上所述，杜仲樹種培育應(yīng)針對(duì)不同產(chǎn)地、采摘季節(jié)、品種、植株部位與樹齡、施肥條件等因素實(shí)施調(diào)控，以達(dá)到優(yōu)化活性成分的目的，全面提升杜仲葉產(chǎn)量，滿足其高質(zhì)量發(fā)展需求.

2.2 加工方法

杜仲葉產(chǎn)地采摘后需要干燥并儲(chǔ)藏，杜仲葉顏色和活性物質(zhì)是評(píng)價(jià)品質(zhì)優(yōu)劣的重要參考指標(biāo)，如不及時(shí)加工會(huì)造成嚴(yán)重破壞和損失.《中國(guó)藥典》傳統(tǒng)采用低溫烘干和常溫曬干兩種方法處理，近年來隨著科技進(jìn)步又出現(xiàn)了一些新型干制方式，如微波干燥、真空凍干等. 研究表明不同的烘干技術(shù)對(duì)有效成分的影響較大，而抗氧化特性是與這類物質(zhì)密切相關(guān)，如微波真空干燥、真空冷凍干燥處理12 h 后的杜仲葉京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷、綠原酸含量均高于自然晾干和烘干［29］. 自然晾干容易使暴露在空氣中的抗氧化物質(zhì)氧化降解，熱風(fēng)烘干雖能提高干燥效率，但同時(shí)高溫會(huì)引起共價(jià)鍵破壞，導(dǎo)致多酚、黃酮等物質(zhì)損失；微波加熱具有高效、節(jié)能、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于熱敏性成分破壞性較大. 因此在杜仲葉食品開發(fā)加工過程中應(yīng)注意選擇合適的干燥方法以避免活性成分的丟失.

杜仲葉殺青處理是為了滅酶，減少活性成分的分解和損失，如微波、蒸汽、炒制等. 屠萬倩等［30］采用蒸制、發(fā)酵處理杜仲葉后發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和車葉草苷等明顯提高，蒸制微波風(fēng)干法相比烘干法、發(fā)酵法對(duì)綠原酸破壞較少. 劉雯等［31］采用不同殺青工藝對(duì)杜仲葉茶處理，發(fā)現(xiàn)微波殺青方式活性成分損失率最小. 因此，在進(jìn)行杜仲葉產(chǎn)品開發(fā)時(shí)應(yīng)考慮加工方法對(duì)活性成分含量的影響，在保證色香味的基礎(chǔ)上最大限度地保留功能物質(zhì)，開發(fā)新型杜仲葉食品.

3 杜仲葉活性成分提取方法

杜仲葉活性成分的提取方法主要包括超聲提取、微波法、酶解法、水提法、超臨界CO2法等. 不同提取方法對(duì)各種活性成分的提取率影響較大，詳見表1.

表1 不同加工方法對(duì)杜仲葉活性成分提取率的影響Tab.1 Effects of different processing methods on the extraction rate of active components from Eucommia ulmoides leaves

基于分析結(jié)果可知相比其他提取方法，超聲輔助提取對(duì)杜仲葉綠原酸提取率最高［32-34］，酶法提取次之. 超聲提取是中藥提取常用方法，具有高效、省時(shí)、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，酶法提取具有反應(yīng)條件溫和、易控制、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn).

不同提取方法對(duì)杜仲葉總黃酮的提取效率存在顯著性差異［35-37］，以微波提取率最高，為8.7%. 微波提取利用微波高強(qiáng)度穿透細(xì)胞壁的原理，促使細(xì)胞破裂，使大量活性成分溶出，具有加熱迅速、高效節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn).

關(guān)于杜仲葉多酚的提取研究較少，王翔等［38］采用超聲-微波輔助提取杜仲葉多酚，提取率達(dá)8.5%，比傳統(tǒng)提取方法提高了33.57%. 超聲微波聯(lián)用可以同時(shí)具有空化效果和微波高能功能，彌補(bǔ)兩者不足，避免高溫分解和破壞活性成分結(jié)構(gòu).

不同提取方法對(duì)杜仲葉多糖的影響較大［39-41］，超聲輔助提取效果較好，相比傳統(tǒng)水提法提取率提升了64.5%，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)提取工藝.

不同的提取方法對(duì)京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷提取率的影響差異性較大［42-44］，陳玉甫等［44］分別利用水提法、醇提法、酶解法提取杜仲葉桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷：水提法8.27 μg/g、酶解法22.42 μg/g、醇提法9.13 μg/g；京尼平苷酸：水提法36.63 μg/g、酶解法110.05 μg/g、醇提法47.4 μg/g，表明酶解法提取效果最佳.

綜上所述，超聲提取法有利于綠原酸、多酚、多糖的提取，微波法有利于總黃酮的提取，酶解法有利于京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷的提取. 因此選擇合適的提取條件、提取方法對(duì)提升目標(biāo)提取物的含量影響較大，加強(qiáng)提取工藝的優(yōu)化，避免活性成分的損失，為杜仲葉提取物功能食品的開發(fā)提供科學(xué)的理論指導(dǎo).

4 杜仲葉抗氧化作用機(jī)制與評(píng)價(jià)方法

4.1 抗氧化作用機(jī)制

由活性氧引發(fā)的自由基會(huì)使人體內(nèi)的脂質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)，這些自由基進(jìn)攻生物分子的不飽和位點(diǎn)，對(duì)有機(jī)分子產(chǎn)生一些不應(yīng)有的修飾和損傷，這些大分子有蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類物質(zhì)和核酸等. 根據(jù)杜仲葉抗氧化機(jī)理研究進(jìn)展歸納總結(jié)如下：

1）清除自由基. 研究表明杜仲葉提取物能夠有效清除自由基，如杜仲葉多糖在100 μg/mL時(shí)對(duì)ABTS+清除率達(dá)98.74%；

2）提升抗氧化酶活性，減少氧化應(yīng)激反應(yīng). 抗氧化酶構(gòu)成機(jī)體抗氧化防御體系包括超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）等，T-SOD能夠高效清除，抑制脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，GSH-Px能夠明顯清除H2O2、脂質(zhì)過氧化物，CAT 能夠加速機(jī)體內(nèi)H2O2分解. 研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物能夠降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，顯著提升小鼠肝臟抗氧化酶活性［45］.

3）阻斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng). 活性氧能夠影響細(xì)胞膜功能，使細(xì)胞膜不飽和脂肪酸氧化形成脂質(zhì)過氧化物，進(jìn)而影響機(jī)體正常的生理反應(yīng)，引起疲勞、肌肉酸軟等癥狀. 研究證明杜仲葉黃酮能夠有效抑制小鼠肝、心、腎等組織脂質(zhì)過氧化，減少M(fèi)DA生成，維持細(xì)胞膜完整性［46］.

4）減少DNA損傷. 正常情況下的DNA具有自我修復(fù)能力，以維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，但過多的自由基誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白、核酸、脂質(zhì)等遭受破壞. 研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉50%醇提物可顯著提升腦組織抗氧化能力，減少腦神經(jīng)DNA損傷，并提高GSH-Px和T-SOD活力［47］.

4.2 抗氧化評(píng)價(jià)方法

隨著天然抗氧化劑研究熱度的持續(xù)升溫，評(píng)價(jià)方法也發(fā)生著日新月異的改進(jìn)，目前關(guān)于杜仲葉抗氧化能力研究的評(píng)價(jià)方法主要分為化學(xué)測(cè)定法和細(xì)胞分析法，化學(xué)法主要包括清除自由基法、過氧化值法等，細(xì)胞分析法包括抗氧化酶活性測(cè)定法、脂質(zhì)過氧化法、DNA氧化損傷測(cè)定法等，詳見表2.

表2 杜仲葉主要抗氧化評(píng)價(jià)方法Tab.2 Main antioxidant evaluation methods of Eucommia ulmoides leaves

清除自由基法主要測(cè)定還原能力及對(duì)·OH、ABTS+、DPPH·、O2-等自由基清除能力. 李文娜等［10］結(jié)合還原能力、DPPH·、·OH、O2-、烷基自由基等體系比較杜仲葉綠原酸提取物、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和VC體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)杜仲葉綠原酸提取物清除以上自由基能力最強(qiáng)，且對(duì)紅細(xì)胞溶血有一定的抑制作用.

過氧化值法（peroxide value，PV）是評(píng)價(jià)油脂氧化程度的常用方法，鄭國(guó)棟等［47］通過超聲提取制備杜仲葉萃取物，發(fā)現(xiàn)其對(duì)油脂過氧化值和酸價(jià)的影響顯著優(yōu)于VE、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（Butylated hydroxytoluene，BHT）.

抗氧化酶活性測(cè)定法能夠直接體現(xiàn)機(jī)體的抗氧化能力，機(jī)體的抗氧化酶防御系統(tǒng)包括過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）等，SOD能夠歧化自由氧離子為H2O2和O2，CAT能夠催化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2，GSH-Px 可以清除H2O2和脂質(zhì)過氧化物，因此整個(gè)抗氧化體系相互保護(hù)，協(xié)同作用.

脂質(zhì)過氧化物法基于分光光度法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)不飽和雙鍵氧化為醛、酮等化合物的原理，賈征等［45］通過測(cè)定小鼠組織脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）含量反映細(xì)胞過氧化程度，發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮對(duì)脂質(zhì)過氧化有明顯抑制作用. 通過測(cè)定機(jī)體抗氧化酶活性能夠客觀直接反映機(jī)體清除自由基能力. 研究證明杜仲葉多糖能夠減少M(fèi)DA含量，提升T-SOD、GSH-Px活力.

DNA 氧化損傷測(cè)定法基于CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA 化學(xué)發(fā)光體系，能夠生成·OH，伴隨DNA 的氧化降解產(chǎn)生很強(qiáng)的發(fā)光反應(yīng)，采用此方法可以考察抗氧化劑對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用. 如杜仲葉50%醇提物對(duì)小鼠大腦DNA損傷保護(hù)作用最佳，可有效改善大腦損傷狀態(tài)［46］.

5 結(jié)論

近年來，關(guān)于探尋天然抗氧化劑新型原料的征程一直未間斷，天然抗氧化劑來源廣泛，無毒副作用，具有較強(qiáng)的自由基清除能力. 杜仲葉作為“藥食兩用試點(diǎn)物質(zhì)”有一定的先天優(yōu)勢(shì)，開發(fā)潛力巨大. 藥理研究表明杜仲葉提取物不僅具有明顯的抗氧化功能，還具有極高的藥用價(jià)值，因此以杜仲葉天然提取物代替合成抗氧化劑是今后藥品、保健食品、飲料等行業(yè)發(fā)展的一個(gè)熱點(diǎn)方向，能夠拓展杜仲單一藥用價(jià)值至功能性食品、飲料、化妝品等領(lǐng)域，加快杜仲資源的深入開發(fā)利用.

目前關(guān)于杜仲葉的研究大多集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，功能性食品開發(fā)方向的進(jìn)展較為緩慢，主要體現(xiàn)在產(chǎn)品單一、功效范圍狹窄、標(biāo)準(zhǔn)不完備等方面，另外，杜仲葉中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分如氨基酸，多糖、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等，適合開發(fā)營(yíng)養(yǎng)健康食品，杜仲葉中多種功效成分，結(jié)合中藥配伍理論，科學(xué)組合可以進(jìn)一步拓展其應(yīng)用功能和適用人群的范圍，有利于多功能食品的開發(fā)，應(yīng)加快杜仲葉天然抗氧化功能在油脂、堅(jiān)果、飲料等易氧化食品類別中的應(yīng)用步伐，杜仲葉抗氧化天然產(chǎn)物開發(fā)不足，其提取純化研究不能和工業(yè)化接軌，應(yīng)加強(qiáng)天然抗氧化成分提取、分離純化方面的研究，盡快實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，應(yīng)進(jìn)一步研究杜仲葉各活性成分.