不同種植地膽木根際的細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性

陳燕艷，徐詩濤，王德立，王 軍，周元元，侯祥文

（1.海南大學(xué) 園藝學(xué)院，?？?570228; 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所海南分所，?？?570311;3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，海口 570216）

膽 木 [Nauclea officinalis(Pierre ex Pitard)Merr.& Chun]，別名烏檀，是茜草科烏檀屬植物，根據(jù)文獻記載以枝、干、皮入藥，膽木化學(xué)成分主要包括生物堿[1]、萜類及酚酸類等[2]。膽木藥用價值受到了關(guān)注，目前已被開發(fā)成為浸膏糖漿[3]、飲片[4]、膠囊[5]和注射劑[6]等，在臨床醫(yī)學(xué)上用于抗炎鎮(zhèn)痛[7]、抑菌[8]和抗病毒[9]清熱解毒、消腫止痛[10]等。膽木為多年生喬木，野生膽木喜生長于高山近頂或半腰蔭蔽潮濕地帶的雜木林中[11]，在自然條件下生長緩慢，成藥年限長，藥用品質(zhì)不佳，而人工種植往往因缺少科學(xué)管理，受到病害的干擾而導(dǎo)致植株早衰，藥材產(chǎn)量不高。因此，有必要對膽木根系最直接的根際環(huán)境進行研究，特別是在根際發(fā)育過程中有可能對膽木根系造成病害或促進根系發(fā)育的細菌進行鑒定。

植物在應(yīng)對脅迫環(huán)境時根際微生物起到積極作用[12]，有益微生物能提升植物抗旱能力[13-14]進而提高植物在環(huán)境脅迫下的生存能力，但在根際有害微生物使植株發(fā)生病害（比如線蟲影響植物根系生理活性，進而影響根系水分和無機鹽攝取）時可導(dǎo)致植株死亡[15]。不同微生物種類、數(shù)量以及其優(yōu)勢生理類群對植物生長過程中土壤有效養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和吸收、植物病原菌的活性及其造成的病害均有一定影響[16]。微生物可幫助其寄生的植物抵御病害、增強抗逆性、同化和運輸養(yǎng)分[17]、促進生長等[18]，反過來植物凋落物和植物根際分泌物為根際土壤微生物提供營養(yǎng)。植物根系對根際微生物群落構(gòu)建也具有選擇性[19]，其對根際微生物群落的營養(yǎng)選擇與富集作用使得植物和微生物協(xié)同進化[20]，導(dǎo)致根際微生物群落組成結(jié)構(gòu)、群落豐度和多樣性產(chǎn)生差異。不僅如此，植物根際分泌物及植物凋落物在很大程度上影響著林下土壤的理化性質(zhì)。已有學(xué)者認為土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、群落豐度和多樣性構(gòu)建十分密切[21]。植物通過向土壤輸入凋落物和根際分泌物，以及其吸收土壤養(yǎng)分的形式等方式影響土壤的理化性質(zhì)[22]。植被類型、土壤有機質(zhì)、土壤元素、溫度、水分、pH值影響著根際微生物的群落結(jié)構(gòu)和微生物的多樣性[23]。土壤微生物是植物－土壤系統(tǒng)中比較活躍的組成成分；土壤微生物多樣性代表著微生物群落的穩(wěn)定性。根際微生物群落與土壤環(huán)境構(gòu)建的相互關(guān)系可為植物營養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性調(diào)控機制提供重要的理論依據(jù)[24]。高通量測序技術(shù)可快速對微生物進行有效鑒定，從而被廣泛應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域。本研究以五指山和瓊中不同種植區(qū)的膽木根際土為樣本，通過對其理化性質(zhì)進行分析比較，并基于Illumina HiSeq 高通量測序技術(shù)對樣本細菌多樣性進行比較分析，為后續(xù)開展不同種植區(qū)膽木促生根際細菌的分離篩選工作和為不同立地條件下膽木的質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣地狀況樣品 DM4、DM7、DM10、DM12和DM14分別采自海南省五指山市暢好鄉(xiāng)什哈村（東經(jīng) 109.29°，北緯 18.40°)、海南省瓊中黎族自治縣上安鄉(xiāng)長征八隊（東經(jīng) 109.50°，北緯 18.52°)、五指山市水滿鄉(xiāng) （東經(jīng) 109.29°，北緯 18.40°)、海南省瓊中自治縣貓尾村領(lǐng)頭十五隊（東經(jīng)109.56°，北緯19.05°)、海南省五指山市錦繡花園綠洲島大酒店旁（東經(jīng) 109.30°，北緯 18.45°)。樣地根際土的理化性質(zhì)含量見表1。

表 1 根際土的理化性質(zhì)

1.2 材料的采集采用“S”形混合采樣法，于各膽木種植地距離膽木樹干10～20 cm 處的根系比較發(fā)達的地方挖開，將粘附在根系的土壤抖落，剔除石塊和植物根系，取土，從每個種植地取9個點，每個樣地取土樣2 g，并混合均勻，分為3個平行裝入已滅菌的離心管，并迅速置于冰盒或液氮罐中保存運回，一部分用于細菌檢測，同時將其中一部分土壤帶回實驗室自然陰干，碾碎后過0.074 mm篩，用于pH值和有機質(zhì)等土壤指標的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品理化性質(zhì)的測定方法采用 NaHCO3-浸提-鉬銻抗比色法測定有效磷[25]；采用堿解擴散法測定堿解氮[26]；采用原子吸收分光光度計測定速效鉀[27]；采用重鉻酸鉀容量法測有機質(zhì)[28]；采用pH 計（DELTA 320)測定 pH[29]；土樣濕度和溫度使用土壤溫度濕度測試儀（特安斯TASI）測量。將土壤溫度濕度測試儀器開關(guān)打開，設(shè)置溫度和濕度的參數(shù)，將探針頭插入距離樹干30～50 cm處根系比較發(fā)達的地方，深度20 cm，待儀器數(shù)據(jù)穩(wěn)定后讀數(shù)，重復(fù)3次。經(jīng)緯度通過奧維定位儀獲得。

1.3.2 建庫與測序方法委托百邁客生物技術(shù)有限公司對不同種植區(qū)膽木根際土壤樣品的總DNA進行提取，并進行PCR、產(chǎn)物回收、樣品建庫及上機測序。操作步驟：根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性 30 s，50 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 個循環(huán)，再 72 ℃ 延伸 5 min，最后4 ℃保存。對擴增產(chǎn)物進行純化、定量和均一化，構(gòu)建樣品的cDNA 文庫，并進行文庫質(zhì)檢，合格的文庫采用雙端測序的方法對土壤細菌的16S rRNA V3+V4 區(qū)用 Illumina HiSeq 2500 進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理使用 R 軟件（VennDiagram) 進行細菌分類操作單元劃分和分類鑒定，使用Mothur軟件計算細菌物種豐度和多樣性。采用Excel、DPS數(shù)據(jù)分析和SPSS20.0軟件進行多重比較和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品測序質(zhì)量的評估15 份樣品平均序列長度在414～418 bp 之間。DM4、DM7、DM10、DM12和DM14組平均細菌分類操作單元個數(shù)分別為 1 084、870、1 109、997 和 1 012。5 組樣品共獲得1 223個細菌分類操作單元，用在97% 相似性水平下的聚類細菌分類操作單元 制作各樣品的稀釋曲線 (Rarefaction Curve)，可作為對各樣本測序量是否充分的判斷，曲線急劇上升表明測序量不足。由圖1可知，細菌曲線逐漸趨向平坦，說明測序數(shù)量合理，可進行數(shù)據(jù)分析。

圖1 不同種植地膽木根際土壤樣品稀釋曲線

2.2 不同膽木種植區(qū)土壤根際土的細菌結(jié)構(gòu)

2.2.1 不同膽木種植地土壤根際土在門水平上的細菌結(jié)構(gòu)由圖2可知，膽木根際土壤的優(yōu)勢細菌門為 Rokubacteria 、WPS-2、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes)、浮霉菌門（Planctomycetes)、厚壁菌門（Firmicutes)、疣微菌門（Verrucomicrobia)、綠彎菌門（Chloroflexi)、放線菌門（Actinobacteria)、變形菌門（Proteobacteria)、酸桿菌門（Acidobacteria）等10個細菌門。DM4、DM14第一優(yōu)勢菌門為變形菌門，其相對豐度分別為 34.81%、32.86%；MD7和DM12的第一優(yōu)勢菌門為放線菌門，其相對豐度分別為35.64%和33.65%；DM10第一優(yōu)勢菌門是酸桿菌門，相對豐度為27.6%；MD7和DM10的第二優(yōu)勢菌門為變形菌門，是DM4和DM14的第一優(yōu)勢菌門，其相對豐度分別為19.14%和26.43%；DM4、DM12和 DM14的第二優(yōu)勢菌門是酸桿菌門，也是DM10的第一優(yōu)勢菌門，其相對豐度分別22.62%、27.65%和25.39%。

圖2 不同種植區(qū)根際土在門水平上的細菌組成

2.2.2 不同膽木種植區(qū)土壤根際土在屬水平上的細菌結(jié)構(gòu)如圖3可知，5組樣品優(yōu)勢菌屬有芽孢桿菌屬（Bacillus）、酸桿菌屬（Acidobacter)、鏈霉菌屬（Streptomyces)、伯克氏菌屬（Burkholderia)、Gammaproteobacteria、熱酸菌屬（Acidothermus)、以及未確定的菌屬uncultured_bacterium_Subgroup_2、Candidatus_Udaeobacter、Candidatus_Koribacter和AD3。種植區(qū)為瓊中的DM7和DM12第一優(yōu)勢菌屬均為鏈霉菌屬，相對豐度分別為12.42%和14.83%。種植區(qū)為五指山的DM4和DM14第一優(yōu)勢菌屬是未確定的菌屬uncultured_bacterium_Subgroup_2，相對豐度分別14.46%和13.46%；種植區(qū)為五指山的DM10的第一優(yōu)勢菌屬為未確定菌屬Candidatus_Udaeobacter，相對豐度為11.82%，次優(yōu)勢菌屬是五指山的DM4和DM14的第一優(yōu)勢菌屬即uncultured_bacterium_Subgroup_2，相對豐度為7.79%；DM4和DM14的第二優(yōu)勢菌屬是酸桿菌屬，相對豐度分別為9.09%和7.92%；DM12的第二優(yōu)勢菌屬是伯克氏菌屬，其相對豐度為9.02%，DM7第二優(yōu)勢菌屬是芽孢桿菌屬，其相對豐度為9.01%。

圖3 不同種植區(qū)根際土在屬水平上的細菌組成

2.3 不同膽木種植地土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)、豐度與多樣性分析用Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度，用Shannon和Simpson指數(shù)衡量物種多樣性，指數(shù)值越大，說明樣品的物種豐度和多樣性越高。此外還統(tǒng)計了覆蓋率（Coverage），其數(shù)值越高，則樣本中物種被測出的概率越高。5個不同種植區(qū)的膽木根際土壤的細菌多樣性分析結(jié)果（表2）顯示，種植區(qū)為自五指山的DM4、DM10、DM14的物種豐度和多樣性均高于種植區(qū)為瓊中縣的DM7和DM12，其中5個種植區(qū)中的物種豐度和多樣性最高為五指山水滿鄉(xiāng)根際土壤DM10，最低為瓊中縣DM12樣品。

表 2 不同種植區(qū)膽木根際土細菌的多樣性

2.4 樣品相關(guān)性分析

2.4.1 主要細菌門的細菌豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性5個種植區(qū)膽木根際土壤理化性質(zhì)與根際細菌的主要菌門的相關(guān)性分析結(jié)果（表3）表明，濕度、溫度、pH值、有機質(zhì)含量、速效鉀含量、有效磷含量和堿解氮含量對根際土壤中大多數(shù)主要細菌門有影響。土壤濕度與放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）的細菌豐度呈極顯著負相關(guān)，與Rokubacteria細菌豐度呈極顯著正相關(guān)，與酸桿菌門（Acidobacteria)、綠彎菌門（Chloroflexi)、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的細菌豐度呈顯著正相關(guān)。溫度與疣微菌門（Verrucomicrobia）的細菌豐度呈極負相關(guān)，與厚壁菌門（Firmicutes）的細菌豐度呈顯著負相關(guān)，與放線菌門（Actinobacteria）的細菌豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。pH值與放線菌門（Actinobacteria）的細菌豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與Rokubacteria 的細菌豐度呈極負相關(guān)，與酸桿菌門（Acidobacteria)、綠彎菌門（Chloroflexi)、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的細菌豐度呈顯著負相關(guān)關(guān)系。有機質(zhì)、速效鉀、有效磷和堿解氮等的含量與厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的細菌豐度均呈顯著負相關(guān)關(guān)系，其中，速效鉀與厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的細菌豐度呈極顯著負相關(guān)，與浮霉菌門（Planctomycetes）的細菌豐度呈顯著正相關(guān)；速效鉀與厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的細菌豐度呈極顯著負相關(guān)，堿解氮與浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）的細菌豐度呈積極顯著正相關(guān)。所有土壤理化性質(zhì)測量指標與變形菌門（Proteobacteria）和WS-2的細菌豐度無顯著相關(guān)。

表 3 主要菌門的細菌豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

2.4.2 細菌群落的豐度、多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性由表4可知，濕度、溫度、pH、有機質(zhì)含量和速效鉀含量、有效磷含量和堿解氮含量對根際土壤中主要細菌的物種豐度和多樣性均有影響。濕度、有機質(zhì)含量和速效鉀含量對細菌物種豐度以及細菌多樣性均呈顯著正相關(guān)，其中，濕度和有機質(zhì)對細菌物種的豐度和多樣性均呈極顯著正相關(guān)。溫度、pH對細菌物種的豐度和多樣性呈顯著負相關(guān)，其中pH對細菌物種的豐度和多樣性呈極顯著負相關(guān)。此外，速效鉀含量和細菌物種豐度呈顯著正相關(guān)；堿解氮含量、有效磷含量和細菌多樣性呈顯著正相關(guān)。

表 4 細菌多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 根際土壤理化性質(zhì)與微生物差異的影響因素關(guān)于土壤理化性質(zhì)和微生物差異的研究，楊承棟等[30]認為在不同樹齡的土壤中，有機質(zhì)、速效鉀、有效磷、速效氮等的含量具有差異，從幼齡林至中齡林呈下降趨勢；從中齡林至成熟林土壤中有機質(zhì)和速效鉀的含量呈上升趨勢，有效磷和堿解氮的含量變化無明顯規(guī)律性，根際和非根際微生物的種類和數(shù)量均存在差異；并認為這與種植區(qū)有關(guān)，在不同的土壤母質(zhì)、土壤微生物和氣候類型的共同作用下，土壤有機質(zhì)的分解，土壤養(yǎng)分元素的有效性以及養(yǎng)分元素在土壤生成過程中的釋放和遷移導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的差異，適宜的土壤理化性質(zhì)提供給微生物良好的生活環(huán)境，相對不好的土壤環(huán)境微生物的數(shù)量和多樣性隨之減少。此外，土壤理化性質(zhì)和微生物的差異還有海拔高度的影響[31]，說明造成土壤理化性質(zhì)與微生物的差異的因素是復(fù)雜的，而不是單一的某個因素[32]。筆者在對5個膽木種植區(qū)的土壤理化性質(zhì)分析中發(fā)現(xiàn)，樣品間濕度無顯著差異，含水量都較高，保持在40%～55%；種植區(qū)瓊中的2組樣品的溫度和pH都高于種植區(qū)五指山的樣品；5組樣品的溫度均保持在26 ℃左右，pH均為酸性。筆者分析了5個膽木種植區(qū)的土壤理化性質(zhì)形成原因，認為各組樣品地處海南降水豐富的種植區(qū)，pH值偏酸性可能是由于降水多導(dǎo)致鹽基飽和度降低造成的。筆者在對5個膽木種植區(qū)的細菌分析中發(fā)現(xiàn)，5個種植區(qū)的細菌數(shù)量和多樣性有差異，五指山樣品的細菌數(shù)量和細菌多樣性相對于瓊中樣品更加豐富一些，而同個市縣的樣品間也存在差異。筆者認為這是因為5個種植區(qū)所處地理環(huán)境、氣候條件、海拔高度、土壤環(huán)境的差異造成的。

3.2 土壤理化性質(zhì)與細菌物種結(jié)構(gòu)、物種豐度和多樣性的關(guān)系在研究土壤理化性質(zhì)與人工林細菌多樣性時，丁新景等[33]認為含水量、堿解氮含量、有效磷含量、速效鉀含量和有機質(zhì)含量與根際土壤細菌多樣性相關(guān)關(guān)系顯著，pH與細菌多樣性指數(shù)無顯著相關(guān)關(guān)系。侯建偉等[34]在對花椒根區(qū)土壤細菌群落結(jié)構(gòu)研究中認為土壤pH、碳氮比、堿解氮、有效磷和速效鉀總共解釋了83.3%的群落變化。本研究中，5個不同的膽木種植區(qū)樣品的濕度、溫度、pH值、有機質(zhì)含量、速效鉀含量、有效磷含量和堿解氮含量對根際土壤中主要細菌物種的結(jié)構(gòu)豐度以及細菌多樣性均有影響；在10種優(yōu)勢門類細菌中，占絕對優(yōu)勢的菌門是變形菌門，但變形菌門類細菌未與土壤理化性質(zhì)指標呈顯著相關(guān)關(guān)系。宋春麗等[35]認為變形菌門為優(yōu)勢菌門可能與其生態(tài)位寬度較大、受環(huán)境影響較小有關(guān)。在本研究中，Rokubacteria 、芽單胞菌門、浮霉菌門、厚壁菌門、疣微菌門、綠彎菌門、放線菌門、變形菌門、酸桿菌門等細菌門與1～3種土壤理化性質(zhì)指標呈極顯著相關(guān)。本研究中變形菌門和酸桿菌門、放線菌門細菌的物種豐度高于其他細菌門的，這與PENG等[36]和ZHOU等[37]研究結(jié)果一致，而Rokubacteria 、芽單胞菌門、浮霉菌門、厚壁菌門、疣微菌門、綠彎菌門、變形菌門受到多種土壤環(huán)境因素限制，生長受到抑制，豐度較小[38]。在一定范圍內(nèi)pH值與酸桿菌門總豐度呈反比，酸桿菌門細菌在酸性土壤環(huán)境中豐度較高[39-40]，而隨著 pH 值的升高其生長受到抑制，豐度降低[41]，究其原因，可能是由于酸桿菌門細菌是嗜酸性細菌，酸性土壤環(huán)境有利于細菌的生理活動[42]。在特定的土壤環(huán)境里，變形菌門細菌和放線菌門細菌的豐度會隨著酸桿菌門細菌的豐度增多而下降[43]，但在本研究中是細菌的結(jié)構(gòu)豐度與其共同生活細菌種群類別相關(guān)；對細菌的物種豐度與多樣性的研究表明，土壤細菌多樣性與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)[44-46]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 個不同膽木種植區(qū)土壤的濕度、溫度、有機質(zhì)含量和速效鉀含量對細菌的物種豐度及多樣性呈顯著正相關(guān)，其中，濕度和有機質(zhì)含量對細菌的物種豐度和多樣性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；溫度和pH值對細菌的物種豐度和多樣性呈顯著負相關(guān)關(guān)系，其中pH值呈極顯著負相關(guān)。此外，速效鉀含量對ACE和Chao1指數(shù)，堿解氮含量對Cimpson和Shannon 指數(shù)，有效磷含量對Cimpson 指數(shù)均呈顯著正相關(guān)。

4 結(jié) 論

（1）五指山樣品 DM4、DM10和 DM14的平均細菌分類操作單元個數(shù)分別為 1 084、1 109和1 012，瓊中樣品DM7和DM12的平均細菌分類操作單元個數(shù)分別為870、997，五指山的平均細菌分類操作單元個數(shù)高于瓊中。

（2）五指山和瓊中5組樣品的優(yōu)勢菌門組成主要是Rokubacteria 、WPS-2、芽單胞菌門、浮霉菌門、厚壁菌門、疣微菌門、綠彎菌門、放線菌門、變形菌門、酸桿菌門等10個細菌門。

（3）五指山和瓊中5組樣品主要優(yōu)勢菌屬有芽孢桿菌屬、酸桿菌屬、鏈霉菌屬、伯克氏菌屬、Gammaproteobacteria、熱酸菌屬、及未確定的菌屬uncultured_bacterium_Subgroup_2、Candidatus_Udaeobacter、Candidatus_Koribacter和AD3等10個細菌屬。

（4）土壤的理化性質(zhì)影響細菌的優(yōu)勢菌門、相對豐度和多樣性，如土壤濕度與放線菌門和厚壁菌門的細菌豐度呈極顯著負相關(guān)，與Rokubacteria的細菌豐度呈極顯著正相關(guān)；濕度、有機質(zhì)含量和速效鉀含量對細菌物種豐度以及細菌多樣性呈顯著正相關(guān)。