一種木麻黃莖腐病病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性測定

朱清亮，李增平，張 宇

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

木麻黃（Casuarina equisetifolia）是屬于雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）、木麻黃科（Casuarinaceae）、木麻黃屬（Casuarina）的一類綠化常綠喬木，在中國廣東、廣西、海南等省區(qū)均有栽培。由于木麻黃具有速生、抗風(fēng)、固沙、耐鹽、耐干旱、耐瘠薄等特點(diǎn)，故成為我國南方濱海防風(fēng)固沙不可缺少的一類優(yōu)良樹種[1]。海南省于1955年開始建設(shè)包括木麻黃林在內(nèi)的沿海防護(hù)林。目前，海南全境木麻黃純林與混交林總面積超過5萬hm2，分布在?？?、儋州、文昌、萬寧等沿海12個(gè)市縣的73個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)[2]。木麻黃海防林的建設(shè)在抵御臺風(fēng)，保持水土，改善自然生態(tài)，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)建設(shè)上均發(fā)揮了舉足輕重的作用[3]。據(jù)報(bào)道，木麻黃病害目前總計(jì)有14種，分為非侵染性病害、細(xì)菌性病害、真菌性病害與其他病害。其中非侵染性病害中的衰退病與細(xì)菌性病害中的青枯病為主要病害，其余均為真菌性病害[4]。海南沿海種植多年的木麻黃海防林，由于其莖干易受到臺風(fēng)、害蟲的危害，造成大量傷口，故易被病原木腐真菌侵染定殖而發(fā)生真菌性根腐和莖腐，甚至部分重病株整株死亡[5]。在木麻黃靈芝病害方面，陳禮浪與吳如慧[6-8]分別鑒定木麻黃紅根病和莖腐病病原菌為熱帶靈芝(Ganoderma tropicum)與二孢假芝（Amauroderma subresinosum）并進(jìn)行了生物學(xué)特性測定；單金雪[9]發(fā)現(xiàn)南方靈芝（Ganoderma australe）能引起木麻黃莖腐病并完成了其生物學(xué)特性研究。筆者在海南省昌江縣棋子灣海濱木麻黃林中發(fā)現(xiàn)獨(dú)體木麻黃活樹上有一種靈芝菌引起的莖腐病，田間發(fā)病率2%，重病株整株枯死，此靈芝菌的擔(dān)子果有明顯的同心環(huán)紋與漆樣光澤，與報(bào)道的熱帶靈芝和南方靈芝均不相同，而且經(jīng)初步鏡檢發(fā)現(xiàn)其擔(dān)孢子形態(tài)也不同于熱帶靈芝等已知種，推測可能為狹長孢靈芝（Ganoderma boninensePat.）。狹長孢靈芝是一類在油棕上引起嚴(yán)重破壞性莖基腐病的重要靈芝病原菌[10]，近年來在海南與臺灣的檳榔上也有發(fā)現(xiàn)[11]。程樂樂等[7]和陳禮浪等[12]在調(diào)查海南棕櫚科植物木腐菌時(shí)曾在檳榔活樹、椰子和木麻黃死樹上發(fā)現(xiàn)狹長孢靈芝。目前，還未見狹長孢靈芝引起的木麻黃活立木莖腐病的詳細(xì)報(bào)道。本研究從木麻黃活樹莖基部進(jìn)行取樣，對病害靈芝菌樣本進(jìn)行病原菌分離、鑒定和致病性測定，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究此類病菌及生產(chǎn)上莖腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣本樣本于 2018 年 1 月采自海南省昌江縣昌化鎮(zhèn)棋子灣發(fā)病木麻黃活立木，擔(dān)子果編號為HNCJ201801001。用保鮮袋包裝樣本并帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、Richard、燕麥 (OMA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）、玉米(CMA)培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[13]的方法，木麻黃莖干煎汁培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[14]的方法，木屑培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[15]的方法。

1.3 試 劑 與 實(shí) 驗(yàn) 器 材OMEGA FungalDNA Kit購自美國 OMEGA 公司， DL2000 DNAMarker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。2xSanTaq-Mix購自生工生物股份有限公司。攝影生物顯微鏡為日本Olympus BX-51。PCR 產(chǎn)物測序與相關(guān)引物的合成由鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。引物序列見表1。

表 1 用于擴(kuò)增 ITS與 LSU基因的引物序列

1.4 菌株的分離采用組織分離法，在新鮮擔(dān)子果表面用含70%酒精的醫(yī)用無菌棉擦拭、消毒，再用無菌的手術(shù)刀切去表層，切取5 mm×5 mm的內(nèi)層菌肉放到PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后，對生長出來的形態(tài)符合的菌株進(jìn)行純化，將獲得的編號為HNCJ201801001菌株轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基于28 ℃黑暗條件下擴(kuò)繁，保存和備用。

1.5 接種體的制備從長有 HNCJ201801001 菌株的PDA培養(yǎng)基上切取1 cm×1 cm的菌絲塊，放置在高壓蒸汽滅菌后的木屑培養(yǎng)基中，透明膠帶封口后在黑暗常溫狀態(tài)下培養(yǎng)21 d，當(dāng)整個(gè)培養(yǎng)基表面布滿菌絲，可用于致病性測定。對照組采用接入空白PDA培養(yǎng)基塊的木屑培養(yǎng)基，其他條件與處理方式均與處理組接種體相同。

1.6 致病性測定對待接種木麻黃幼樹的莖基部用70%酒精進(jìn)行消毒，再用手術(shù)刀削開表皮將制備好的接種體貼在切口上，在下方用無菌水潤濕過的棉花保濕，最后用保鮮袋與膠帶進(jìn)行固定。處理組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，對照組使用空白木屑培養(yǎng)基。完成后定期澆水，定期觀察苗木長勢并拍照。

1.7 擔(dān)子果誘導(dǎo)將木屑培養(yǎng)基裝滿 300 mL 組培瓶并滅菌，挑取分離到的菌株放入組培瓶中28 ℃黑暗培養(yǎng)，待組培瓶表面長滿菌絲時(shí)開蓋，放入盛有無菌水的玻璃瓶中進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔10 d觀察靈芝長勢并拍照。

1.8 病原菌鑒定(1)形態(tài)鑒定：參考《中國真菌志》[18]與《中國大型真菌》[19]等文獻(xiàn)，對擔(dān)子果進(jìn)行宏觀形態(tài)鑒定。切取擔(dān)子果內(nèi)部組織，制片，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，測量并拍照。(2)分子鑒定：參考邢佳慧[20]、袁濱[21]、OGHENEKARO[22]文獻(xiàn)，選用并合成用于擴(kuò)增ITS基因與LSU基因的引物。對純化后的HNCJ201801001菌株在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，5 d后收集菌絲體，使用 OMEGA Fungal DNA Kit 提取其總 DNA。用合成的2對引物擴(kuò)增ITS與LSU基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測和純化回收后送往公司測序。將獲得的測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對并提交NCBI。

在GenBank上搜尋靈芝與其他屬中同時(shí)含有ITS與LSU基因的菌株，下載其ITS與LSU序列并用 Sequence Matrix軟件進(jìn)行拼接，用MEGA7.0對包含HNCJ201801001在內(nèi)的所有序列通過NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.9 生物學(xué)特性測定將 HNCJ201801001 菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，然后在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，接種到各組的培養(yǎng)基上，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。每組除所研究變量外，其他培養(yǎng)條件組均統(tǒng)一設(shè)為 28 ℃，24 h黑暗，PDA培養(yǎng)基。5 d后使用十字交叉法測量菌落直徑。試驗(yàn)組條件設(shè)置：

（1）溫度：設(shè)置 15、20、25、28、30、32、35、37，40 ℃ 共 9 個(gè)處理組。

（2）光照：設(shè)置 24 h 黑暗、24 h 光照、12 h 光暗交替3個(gè)處理組。

（3）pH值：用NaOH與HCl將培養(yǎng)基pH依次調(diào)節(jié)到2～10，共9個(gè)處理組。

（4）培養(yǎng)基：設(shè)置 PDA、PSA、Ricards、燕麥(OMA)、玉米(CMA)和木麻黃莖干煎汁培養(yǎng)基6個(gè)處理組。

研究取得的數(shù)據(jù)用Excel軟件統(tǒng)計(jì)記錄，分析并生成圖表。使用SAS8.1軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，木麻黃活樹受侵染后，葉片失綠無光澤，繼而發(fā)黃脫落，部分小枝條枯死，樹冠稀疏，生長不良，重病植株在3～5 a內(nèi)整株枯死?？梢杂^察到紅褐色或漆黑色、有柄和無柄的擔(dān)子果在病樹的下部莖干上和地面附近的莖基部長出，產(chǎn)生擔(dān)孢子的擔(dān)子果表覆蓋1層土褐色的擔(dān)孢子粉，擔(dān)子果上表面有明顯的細(xì)密同心環(huán)紋與漆樣光澤（圖1-A，B，C，D，E）。病樹莖基部木質(zhì)部組織白腐，病株在田間發(fā)病率為2%左右。田間發(fā)病植株的地上部分癥狀與熱帶靈芝(G.tropicum)引起的紅根病、南方靈芝(G.australe)和二孢假芝（Amauroderma subresinosum）引起的莖腐病癥狀相似，均會呈現(xiàn)樹冠稀疏、生長不良等的相同癥狀，主要區(qū)別在于病樹莖干基部生長出的病菌擔(dān)子果形態(tài)不同[7-9]。

圖1 木麻黃莖腐病田間發(fā)病癥狀

2.2 致病性測定接種 60 d 后，檢查 HNCJ2018-01001菌株對木麻黃樹接種部位的侵染的情況，發(fā)現(xiàn)木麻黃接種處長出白色菌絲，病原菌已經(jīng)成功侵染植株。120 d后，組織白色腐朽，木麻黃頂部枝葉開始發(fā)黃。5個(gè)月后，接種的木麻黃幼樹樹冠稀疏，生長發(fā)育不良，8個(gè)月后整株枯死，與田間癥狀基本一致，對照組無明顯變化。在病株接種部位再分離得到相同的菌株，顯示所分離的HNCJ201801001菌株為木麻黃莖腐病的致病菌。將HNCJ201801001菌株接入裝滿木屑培養(yǎng)基的350 mL組培瓶中，30 d后菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)基，120 d后長出與病原樣本的形態(tài)相一致的擔(dān)子果（圖2-A，B，C，D）。

圖2 木麻黃莖腐病病原菌的致病性測定

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察（1）菌落特征：菌株生長呈圓形，5 d內(nèi)可以生長至直徑8 cm。菌絲純白色，菌絲濃密，平伏生長，無氣味，老化后轉(zhuǎn)為淡黃色，邊緣整齊（圖3-A）。（2）擔(dān)子果：擔(dān)子果一年生，有柄或無柄，新鮮擔(dān)子果菌肉呈軟木栓質(zhì)，干燥后轉(zhuǎn)為木質(zhì)。菌蓋扇形，表面基部中央凸起或疊生一至多個(gè)小扇形擔(dān)子果，具有漆狀光澤，自基部向外有明顯的放射狀皺紋和致密的環(huán)紋，幼小子實(shí)體淺黃色，成熟后表面從橙色到淡紅褐色，老化后為非常暗褐色，大多數(shù)漆黑色；菌蓋邊緣薄或厚鈍，邊緣厚0.2～0.7 cm，幼時(shí)奶油色，隨著擔(dān)子果成熟與老化逐漸變?yōu)辄S褐色與紫褐色；下表面的近基部呈灰褐色，靠菌蓋邊緣處漸呈灰白色。擔(dān)子果大小為（14～18）cm×（9～12）cm，基部厚 2～5 cm，柄粗1.8～2.7 cm，柄長 5.5～6.8 cm；菌肉不分層，呈褐色，接近菌管處為深褐色，擔(dān)子果中存在有黑色殼質(zhì)層結(jié)構(gòu)[18]（圖3-B，C，D）。

圖3 木麻黃靈芝莖腐病病原菌形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)

（3）顯微特征：從自然寄主上生長的擔(dān)子果上切取菌組織和挑取擔(dān)孢子粉進(jìn)行鏡檢。菌絲三體型，骨架菌絲厚壁實(shí)心，呈樹枝狀，直徑3～5 μm。纏繞菌絲無色，厚壁，直徑1～2 μm。生殖菌絲透明薄壁，直徑4～7 μm。擔(dān)孢子為狹長的卵圓形，部分頂端平截，雙層壁，外壁平滑，無色透明，內(nèi)壁有小刺，淺黃褐色，部分有油滴。大小為（8.9 ～11.7）μm×（4.2 ～ 5.5）μm，平均長為 10.15 μm，平均寬為 5.01 μm，長寬比Q=1.679 ～ 2.373（圖3-E，F(xiàn)）。

2.3.2 分 子 鑒 定測 序 結(jié) 果 顯 示 菌 株 HNCJ-201801001 的 rDNA-ITS 序列為 609 bp（序列號：OK643485.1），LSU 序列為 590 bp（序列號：OK64-3883.1）。將2種基因拼接后與1.8中獲得的序列進(jìn)行聯(lián)合建樹（表2）。結(jié)果表明，HNCJ201801001菌株與狹長孢靈芝遺傳距離最小聚為一類（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)分析結(jié)果，將引起海南昌江木麻黃莖腐病的病原靈芝菌鑒定為狹長孢靈芝（Ganoderma boninensePat.）。

圖4 HNCJ201801001菌株與靈芝屬相關(guān)種基于ITS與LSU基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 生物學(xué)特性測定

2.4.1 不同溫度對木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響在不同溫度下，HNCJ201801001菌株生長情況差異顯著。HNCJ201801001菌株在15～35 ℃的溫度條件下均可生長，適宜生長溫度為 25～32 ℃，其中28 ℃時(shí)生長最好。37 ℃時(shí)病原菌完全停止生長，由此可得該病菌最適生長溫度為 28 ℃（圖5）。

圖5 不同溫度對木麻黃莖腐病病原菌 HNCJ201801001菌絲生長的影響

2.4.2 不同光照條件對木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響HNCJ201801001菌株在3種光照情況下的菌落直徑有一定差異。在24 h光照條件下，HNCJ201801001菌株菌絲生長最慢，邊緣透明稀薄，長勢最弱。在12 h光暗交替條件下，HNCJ201801001菌株菌絲生長較慢，邊緣厚度不均勻。在24 h黑暗狀態(tài)下菌落生長最快，菌落生長均勻，邊緣整齊，厚度最厚（圖6）。

圖6 不同光照對木麻黃莖腐病病原菌 HNCJ201801001菌絲生長的影響

2.4.3 不同pH值對木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響HNCJ201801001菌株在pH 3～8之間均可以正常生長，pH 4～7時(shí)生長得比較快。pH從2到5時(shí)，菌株生長速度隨pH升高而加快。pH從5到9時(shí)，菌株生長速度隨pH升高而減慢，最適生長pH為5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弱酸性環(huán)境相比中性與堿性環(huán)境更適合該致病菌株的生長（圖7）。

圖7 不同 pH 對木麻黃莖腐病病原菌 HNCJ201801001 菌絲生長的影響

表 2 用于分子鑒定的菌株及其ITS與LSU基因登錄號

2.4.4 不同培養(yǎng)基對木麻黃狹長孢靈芝莖腐病病原菌生長的影響HNCJ201801001菌株在6種培養(yǎng)基上均可以生長。不同處理組菌落的生長速率與狀況有明顯差異，其中，PDA與PSA培養(yǎng)基上的菌落菌絲層厚，生長最快；木麻黃莖干煎汁與燕麥培養(yǎng)基(CMA)上的菌落生長直徑較大，但菌絲層薄于PDA與PSA培養(yǎng)基；在玉米(OMA)培養(yǎng)基上的菌落生長較慢, 菌絲層較稀?。辉赗ichards培養(yǎng)基上的菌落菌絲層接近透明，呈不規(guī)則多邊形，生長最慢，長勢極差（表3）。

表 3 不同培養(yǎng)基培對木麻黃莖腐病病原菌HNCJ201801001菌絲生長的影響

3 討 論

靈芝是靈芝屬（Ganoderma）真菌的總稱，目前世界范圍內(nèi)靈芝屬有131個(gè)種，其中中國有23個(gè)種[23]。靈芝是一類重要的藥用真菌，在中國作為滋補(bǔ)強(qiáng)壯的名貴藥材，已有超過2 000 a的藥用歷史。靈芝屬真菌均為木腐菌，其中的部分種類會引起樹木的根腐病或莖基腐病，導(dǎo)致樹木枯死，如靈芝 (Ganoderma lucidum)、橡膠樹靈芝 (G.pseudoferreum) 、有柄樹舌 (G.applanatum)和熱帶靈芝(G.tropicum)等。NAIDU 等[24]于 1966 年報(bào)道靈芝菌寄主植物有19科36屬48種，是一類重要的林木病原木腐菌。狹長孢靈芝(G.boninense)在馬來西亞與印度尼西亞等國家是油棕(Elaeis guineensis)莖基腐病的主要病原菌，油棕被感染后引起莖基腐病并導(dǎo)致整株死亡，造成經(jīng)濟(jì)的損失超過5億美元[25]。狹長孢靈芝在我國的分布以海南省為主[23]。目前，國內(nèi)外對狹長孢靈芝的相關(guān)報(bào)道主要集中在化學(xué)成分、病害防治和基因組等幾個(gè)方面[26-28]，尚未出現(xiàn)關(guān)于狹長孢靈芝引起木麻黃活立木莖腐病的研究報(bào)道。

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，確定了引起海南昌江木麻黃活立木莖腐病的病原菌為狹長孢靈芝。生物學(xué)特性測定結(jié)果顯示，25～32 ℃均較適合該病原菌生長，其最適生長溫度為28 ℃，最適pH為5；光照影響菌絲生長，病原菌在完全黑暗狀態(tài)下生長速率最快；狹長孢靈芝適宜在PDA與PSA培養(yǎng)基上生長。程樂樂等[12]研究了引起海南陵水檳榔莖腐病的狹長孢靈芝，其適宜生長溫度為 26～30 ℃，最適生長溫度為 28 ℃，最適pH為5～6，光照抑制菌絲生長，最優(yōu)碳源為蔗糖，與本研究結(jié)果基本一致，但陵水檳榔狹長孢靈芝在34 ℃以上不生長，而木麻黃狹長孢靈芝菌株在35 ℃依然可以生長，這可能是由于地區(qū)環(huán)境條件與寄主物種不同導(dǎo)致。筆者在田間調(diào)查時(shí)于?？诠鹆盅蟆⒊芜~橋頭、昌江濕地公園、萬寧烏場等地海濱多年生長的木麻黃活樹和死樹莖基部均發(fā)現(xiàn)生長有狹長孢靈芝的擔(dān)子果，田間發(fā)病率約2%。

目前，國內(nèi)有不少由靈芝屬病原菌引起木麻黃莖腐或根腐病的報(bào)道。陳禮浪等[6]發(fā)現(xiàn)熱帶靈芝能導(dǎo)致木麻黃紅根?。粎侨缁鄣萚8]與單金雪等[9]分別報(bào)道二孢假芝與南方靈芝是引起木麻黃莖腐病病原菌。

與本研究中的狹長孢靈芝相比，熱帶靈芝新鮮擔(dān)子果同樣具有漆狀光澤，菌肉褐色，但其表面由中央到邊緣為紅褐色、紫紅色逐漸變淺至黃白至白色。熱帶靈芝主要導(dǎo)致紅根病，在田間癥狀上會表現(xiàn)出病根表面粘泥沙的特點(diǎn)，且水洗后可見棗紅色革質(zhì)菌膜。二孢假芝與南方靈芝均會導(dǎo)致木麻黃基部莖干組織白腐，但南方靈芝無光澤，擔(dān)子果多為土褐色，菌肉肉桂色，有黑色殼質(zhì)層，而二孢假芝表面有一定光澤，表面紅褐色或紫褐色，多數(shù)有同心環(huán)帶，但其菌肉一般為白色或淺黃色。本研究中的狹長孢靈芝，擔(dān)子果上表面紅褐色，有漆狀光澤，與南方靈芝特征不同。菌蓋邊緣為橘黃色，靠近中部變?yōu)榧t或暗紫色，有明顯的同心環(huán)紋和放射狀突起縱脊，可與熱帶靈芝相區(qū)分。菌肉為褐色，長有黑色殼質(zhì)層，區(qū)別于二孢假芝。狹長孢靈芝同樣也能導(dǎo)致木麻黃活樹莖干組織白腐。靈芝屬中多種木腐真菌均可以導(dǎo)致木麻黃莖腐或根腐病的發(fā)生。