郭丹風(fēng),張銘,張笑丹,于瀟,李豪,郭文治(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科,河南省消化器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450052)
肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。最新公布的數(shù)據(jù)顯示:肝癌的全球發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤第6 位和第4 位[2],83%的肝癌病例發(fā)生在處于經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型期的國家,其中中國的肝癌病例占全球的50%以上[3]。因此,提高肝癌治愈率、降低肝癌發(fā)病率及病死率是亟待解決的臨床問題。免疫狀態(tài)改變參與肝癌發(fā)生發(fā)展的過程[4]。尋找能夠通過調(diào)節(jié)肝癌腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的應(yīng)答狀態(tài)發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。
柳穿魚黃素(pectolinarigenin,Pec)屬于黃酮類化合物,可影響細(xì)胞增殖、凋亡、過敏反應(yīng)、抗感染等過程[5-8]。近年來關(guān)于柳穿魚黃素在腫瘤中的作用也得到了密切關(guān)注[9-10]。Wu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素通過抑制PI3K/AKT/mTOR/ERK 信號通路抑制HCC 增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外,柳穿魚黃素還可通過抑制ERK 信號通路抑制肝癌細(xì)胞耐藥株的增殖、侵襲和遷移[12]。已有研究多聚焦于柳穿魚黃素直接抑制肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用觀察,關(guān)于柳穿魚黃素對肝癌微環(huán)境中細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控作用尚未闡明。
本課題擬通過構(gòu)建肝癌荷瘤小鼠,給予柳穿魚黃素處理后,分析荷瘤小鼠體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞亞型的變化,并探討其對T 淋巴細(xì)胞功能的影響,為其作為肝癌治療的抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)。
1.1材料:Hepa 1-6 細(xì)胞株來自本實(shí)驗(yàn)室留存;柳穿魚黃素購自北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清購自美國Gibco 公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰酶及細(xì)胞凍存液均購自蘇州新賽美生物科技有限公司;TRIzol 總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司;2×SYBR Green qPCR 擴(kuò)增試劑盒購自美國Bimake 生物科技有限公司;Anti-CD16/CD32 抗體(Cat.14-0161-85)購自美國Invitrogen 公司。流式抗體Fixable viability dye(FVD)-PB450(Cat. 65-0863-14)購自美國Thermo公司。流式抗體anti-mouse CD3-FITC(Cat. 100203)及anti-mouse CD4-PECy7(Cat. 100422)購 自 美 國Biolegend 公司。流式抗體anti-mouse CD8a-PE(Cat.561095)購自美國BD bioscience 公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):Hepa 1-6 細(xì)胞為本中心留存。Hepa 1-6 細(xì)胞在含5 % CO2,37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期,細(xì)胞密度大于90%時(shí),進(jìn)行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化,當(dāng)多數(shù)細(xì)胞形態(tài)變圓時(shí),應(yīng)即加入3 倍體積的含10%胎牛血清的DMEM 液終止消化。低速離心后,吹打細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞懸液,按1 ∶3 進(jìn)行傳代。待培養(yǎng)細(xì)胞總量達(dá)到實(shí)驗(yàn)需求時(shí),收集細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)后,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml,按照每只小鼠100 μl 的劑量進(jìn)行皮下荷瘤接種。
1.2.2構(gòu)建皮下移植瘤模型:SPF 級C57BL/6N 雌鼠10 只,8 周齡,體重18 ~20 g,購買于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省消化器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF 級動物房,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,進(jìn)行荷瘤。皮下荷瘤鼠源肝癌細(xì)胞Hepa 1-6,3×105個(gè)/100 μl。荷瘤后,小鼠隨分為2 組,每組5 只。柳穿魚黃素處理組(Pec 組)小鼠經(jīng)腹腔注射給予Pec(使用劑量20 mg/kg),對照組(Ctrl 組)小鼠經(jīng)腹腔注射給予等量的生理鹽水。隔天給藥,連續(xù)給藥7 次。
每2 d 進(jìn)行小鼠體重稱量及腫瘤大小的測量。使用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的生長情況,記錄小鼠腫瘤長徑(a) 與垂直徑(b),根據(jù)公式a×b2/2 計(jì)算腫瘤體積,并繪制腫瘤體積增長曲線。荷瘤第21 d,獲取小鼠脾臟及腫瘤引流淋巴結(jié),流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的比例變化。剝離小鼠腫瘤,稱重后凍存于-80℃,提取RNA,利用 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測相關(guān)因子(IFN-γ、Granzyme B、CXCL10及CXCR3) 的表達(dá)情況。動物實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù):頸椎脫臼法處死2 組實(shí)驗(yàn)小鼠,取脾臟及腫瘤區(qū)域引流淋巴結(jié)(腫瘤側(cè)腋窩及腹股溝淋巴結(jié)),置于PBS 中。研磨后過濾,濾液離心1500 rpm×5 min。加入2 ml 紅細(xì)胞裂解液處理5 min,加3 倍體積PBS 進(jìn)行中和, 離心1500 rpm×5 min,細(xì)胞沉淀以PBS 重懸。每種樣本取1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表面染色。每管加1 μl anti-CD16/CD32 抗體,以封閉細(xì)胞表面Fc 受體,于4℃作用10 min。分別加入下列5 種熒光素標(biāo)記的流式抗體(終濃度均為1 μg/ml),包括Fixable viability dye (FVD)-PB450、anti-mouse CD3-FITC、anti-mouse CD4-PECy7、anti-mouse CD8a-PE,4℃避光孵育30 min。加2 ml 預(yù)冷PBS 中和染色,離心1500 rpm×5 min,重復(fù)2 次。棄上清,加200 μl PBS 重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 軟件進(jìn)行作圖分析。
1.2.4 免疫組化:新鮮腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定后送武漢賽維爾公司進(jìn)行免疫組化染色,檢測CD8 抗原表達(dá)情況。以Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)軟件分析單位面積內(nèi)CD8 陽性細(xì)胞數(shù)量。具體分析方法如下:每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少3 個(gè)200 倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野,保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),對3 個(gè)200 倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算組織面積,求出每平方毫米陽性細(xì)胞的數(shù)量。
1.2.5 RT-qPCR:Trizol 法提取組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green qPCR(Bimake)進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。本文中涉及的小鼠基因及相應(yīng)的引物序列如下(表1)。
表1 小鼠基因及相應(yīng)的引物序列
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用Graphpad prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t 檢驗(yàn)或者單因素方差分析(One-way ANOVA analysis)。P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 柳穿魚黃素有效抑制小鼠肝癌進(jìn)展:兩組小鼠體重變化曲線基本重合,說明實(shí)驗(yàn)使用的柳穿魚黃素劑量在安全范圍內(nèi),不影響小鼠的基本生理狀態(tài),見圖1A(P >0.05)。腫瘤體積增長曲線結(jié)果顯示Pec 組小鼠腫瘤體積明顯減?。≒ <0.05),見圖1B。荷瘤21 d 后完整剝除腫瘤組織進(jìn)行稱重,發(fā)現(xiàn)Pec 組小鼠腫瘤重量明顯減輕(P <0.05),見圖1C。以上結(jié)果證實(shí),柳穿魚黃素具有顯著抑制肝癌進(jìn)展的作用。
圖1 兩組小鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建情況
2.2 柳穿魚黃素處理后小鼠體內(nèi)CD8+T 淋巴細(xì)胞比例增加:流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比,Pec 組小鼠脾臟中,CD8+T 淋巴細(xì)胞比例顯著增加(P <0.05),而CD4+T 淋巴細(xì)胞比例減少(P <0.05),見圖2A、B。在荷瘤小鼠的腫瘤區(qū)域引流淋巴結(jié)中也得到一致結(jié)果,見圖2C、D。以上結(jié)果提示柳穿魚黃素可能調(diào)控肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞含量進(jìn)而影響肝癌進(jìn)程。
圖2 兩組小鼠體內(nèi)CD4+、CD8+ T 淋巴細(xì)胞比例情況
2.3 柳穿魚黃素處理后腫瘤組織中CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤增多:對荷瘤小鼠腫瘤組織的流式分析結(jié)果顯示,與Ctrl 組相比,Pec 組小鼠腫瘤組織內(nèi)CD45+CD8+T 淋巴細(xì)胞比例顯著增多(P <0.05),見圖3A、B。免疫組化結(jié)果同樣證實(shí)腫瘤組織內(nèi)提示CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量增加(P <0.05),見圖3C、3D。以上結(jié)果說明柳穿魚黃素可促進(jìn)肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤。
圖3 兩組小鼠腫瘤組織中CD8+ T 淋巴細(xì)胞含量
2.4 柳穿魚黃素處理增強(qiáng)CD8+T 淋巴細(xì)胞相關(guān)效應(yīng)分子的表達(dá)水平:RT-qPCR 結(jié)果顯示,在Pec組小鼠腫瘤組織中,IFN-γ、Granzyme B 的表達(dá)水平顯著高于對照組(P <0.05),見圖4A、4B。同時(shí),與CD8+T 淋巴細(xì)胞趨化密切相關(guān)的因子CXCL10 及受體CXCR3 表達(dá)水平同樣顯著升高(P <0.05),見圖4C、D。以上結(jié)果提示,柳穿魚黃素促進(jìn)肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 淋巴細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤,同時(shí)增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞效應(yīng)分子的分泌水平,進(jìn)而發(fā)揮抑制肝癌進(jìn)展的作用。
圖4 兩組小鼠腫瘤組織中各效應(yīng)分子的表達(dá)情況
肝癌是一種消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,因其易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā),肝癌患者預(yù)后較差[13-17]。目前,肝癌的治療主要包括外科手術(shù)、放化療、靶向免疫治療及中藥輔助治療等[18]。其中,靶向免疫治療是腫瘤治療和免疫學(xué)研究的熱點(diǎn),但是肝癌微環(huán)境存在的免疫抑制現(xiàn)象是導(dǎo)致肝癌免疫治療效果差的主要因素[19]。腫瘤免疫抑制微環(huán)境能極大程度的抑制機(jī)體抗腫瘤CD8+T 細(xì)胞的活化,從而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸[20]。而中藥因其具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖、抑制新生血管生成及抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)等多重作用,受到研究學(xué)者的關(guān)注[21]。因此,尋找能夠有效提高肝癌患者體內(nèi)抗腫瘤CD8+T 細(xì)胞浸潤及功能的方法,對提高肝癌免疫治療的效果具有重要意義。
柳穿魚黃素是一種從中藥中提取的天然黃酮類化合物,具有抗炎活性、抗病毒和抗腫瘤的作用[22-23]。在本研究中,我們使用了不影響小鼠正常生理狀態(tài)的安全劑量的柳穿魚黃素處理肝癌荷瘤小鼠后,小鼠腫瘤體積顯著減少,腫瘤重量明顯減輕,證實(shí)了其對肝癌的抗腫瘤作用。分析荷瘤小鼠外周脾臟及腫瘤區(qū)域的腋窩及腹股溝引流淋巴結(jié),我們發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素處理組小鼠體內(nèi)CD8+T 細(xì)胞比例升高。同時(shí),在腫瘤組織中流式分析和免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)浸潤C(jī)D8+T 細(xì)胞數(shù)目增多。以上結(jié)果說明柳穿魚黃素可增加肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 細(xì)胞的浸潤。
CD8+T 細(xì)胞活化后通過釋放具有殺傷作用的細(xì)胞因子包括IFN-γ、顆粒酶B 等發(fā)揮細(xì)胞毒作用[24]。同時(shí),趨化因子CXCL10 通過與其受體CXCR3 結(jié)合,可招募CD8+T 細(xì)胞進(jìn)入癌組織,直接殺傷腫瘤細(xì)胞,有效提高患者總生存率[25-26]。我們發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素處理后,腫瘤組織中IFN-γ、顆粒酶B 等細(xì)胞因子及與CD8+T 細(xì)胞趨化密切相關(guān)的趨化因子CXCL10 及其受體CXCR3 表達(dá)水平均顯著上升。
綜上所述,柳穿魚黃素可增加肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)CD8+T 細(xì)胞的浸潤,并增強(qiáng)其效應(yīng)因子IFN-γ的表達(dá)水平,進(jìn)而發(fā)揮抑制肝癌進(jìn)展的抗腫瘤作用。同時(shí),我們研究發(fā)現(xiàn),柳穿魚黃素處理后小鼠體內(nèi)CD4+T 細(xì)胞比例下降,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確。此外,除了T 淋巴細(xì)胞外,B 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞亞型也可以參與抗腫瘤免疫應(yīng)答過程,并影響IFN-γ 細(xì)胞因子的分泌。我們將在未來深入研究柳穿魚黃素與抗腫瘤免疫應(yīng)答過程密切相關(guān)的其他免疫細(xì)胞亞群,包括B淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞等的調(diào)控關(guān)系,全面分析柳穿魚黃素對免疫應(yīng)答過程中的免疫細(xì)胞功能的影響。