活檢取材部位和方法對(duì)公民逝世后器官捐獻(xiàn)供腎組織病理學(xué)評(píng)估的影響

陳劍霖，郭暉（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，器官移植教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030）

隨著2015 年我國(guó)全面進(jìn)入公民逝世后器官捐獻(xiàn)（donation after citizen's death，DCD）時(shí)代以及隨后擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供腎（extended criteria donor，ECD）被逐漸接納使用［1-3］，供器官的病理組織學(xué)評(píng)估結(jié)果對(duì)供器官取舍的選擇起到至關(guān)重要的作用。在病理評(píng)估中對(duì)供器官進(jìn)行取材是第一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，取材的質(zhì)量決定病理醫(yī)生是否能對(duì)供器官進(jìn)行精準(zhǔn)的評(píng)估［4］。但是目前對(duì)于取材部位和取材方式對(duì)供器官評(píng)估影響的研究較少，針對(duì)供器官取材操作的指南和規(guī)范也尚未出臺(tái)。雖然各個(gè)移植中心的獲取團(tuán)隊(duì)對(duì)于活檢標(biāo)本獲取有各自的方式，但是對(duì)于很多穿刺操作的細(xì)節(jié)目前還沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行具體探究。因此我們利用本中心經(jīng)評(píng)估后棄用腎臟，針對(duì)腎臟不同部位取材并模擬評(píng)估，探究不同取材部位對(duì)DCD 供腎評(píng)估結(jié)果的影響。通過(guò)與供器官獲取時(shí)評(píng)估結(jié)果對(duì)比，尋找現(xiàn)有方法獲取的穿刺組織可能存在的問(wèn)題。該項(xiàng)研究可為今后供器官活檢取材操作的指南和規(guī)范的制定提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象：收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所在2019 — 2022 年10 例經(jīng)評(píng)估后棄用的腎臟標(biāo)本。

1.2方法

1.2.1活檢取材：將棄用腎臟經(jīng)充分解剖剝離腎周脂肪及纖維組織后，將棄用腎臟沿中軸剖開(kāi)并在被膜表面于腎臟上級(jí)，中部和下級(jí)分別選擇2 個(gè)活檢取材位點(diǎn)，用手術(shù)尖刀在皮質(zhì)部按前述定位點(diǎn)分別切取邊長(zhǎng)約5 mm，厚度約3 mm 的正方形塊狀腎活檢標(biāo)本。活檢標(biāo)本及時(shí)置于Bouin’s 固定液中。

1.2.2常規(guī)石蠟切片：將組織按如下步驟處理。Bouin’s 固定液12 h，75%乙醇2 h，85%乙醇2 h，95%乙醇2 h，無(wú)水乙醇3 h，二甲苯Ⅰ 40 min，二甲苯Ⅱ 40 min，浸蠟2 h。浸蠟后將組織包埋，然后進(jìn)行2 μm 厚度石蠟切片。

1.2.3染色方法：制片完成后執(zhí)行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.3制片結(jié)果分析

1.3.1解剖標(biāo)本活檢評(píng)估：本科室移植病理學(xué)醫(yī)師模擬供器官評(píng)估，統(tǒng)計(jì)標(biāo)本中腎小球數(shù)量及硬化率、小動(dòng)脈數(shù)量、小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚數(shù)量及其比例和小動(dòng)脈透明樣變數(shù)量及其比例，并根據(jù)Banff 評(píng)分、Remuzzi 評(píng)分、Maryland 評(píng)分以及Pirani 評(píng)分對(duì)組織進(jìn)行模擬評(píng)估［5-8］。最后將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.2解剖標(biāo)本與穿刺標(biāo)本評(píng)估結(jié)果的比較：將上述解剖標(biāo)本活檢評(píng)估的結(jié)果與供腎獲取時(shí)穿刺標(biāo)本評(píng)估的結(jié)果對(duì)比并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.3單位面積下解剖標(biāo)本與穿刺標(biāo)本的腎小球與小動(dòng)脈數(shù)量的比較：通過(guò)統(tǒng)計(jì)取材標(biāo)本及供器官獲取評(píng)估時(shí)穿刺標(biāo)本的面積，按如下方法計(jì)算每平方厘米標(biāo)本中腎小球和小動(dòng)脈獲得率。

單位面積腎小球獲得率＝腎小球數(shù)量×（1/標(biāo)本面積）

單位面積小動(dòng)脈獲得率＝小動(dòng)脈數(shù)量×（1/標(biāo)本面積）

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：結(jié)果采用Excel 軟件對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較的分析方式采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 供者資料：本研究中，10 例棄用供腎來(lái)自6 例不同的供者，具體資料如表1 所示。其中男性供者4 例，女性供者2 例。供者平均年齡為47.2（38 ～63）歲，平均BMI 為24.1（17.6 ～30.9）。供者高血壓病史1 例，糖尿病病史1 例。死亡原因腦出血5 例，缺血缺氧性腦病1 例。供者捐獻(xiàn)前行心肺復(fù)蘇術(shù)2 例。

表1 供者一般資料

2.2 不同部位取材標(biāo)本的組織病理學(xué)形態(tài)比較：不同取材部位標(biāo)本的HE 染色結(jié)果如圖1 所示。我們發(fā)現(xiàn)從棄腎3 個(gè)不同部位取材的切片中均存在一定程度的腎小球硬化、小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚以及小動(dòng)脈透明樣變的病變，病變范圍及表現(xiàn)較為一致。其中小動(dòng)脈病變程度普遍較重。另外3 個(gè)不同部位取材切片的腎組織間質(zhì)均表現(xiàn)出局灶性纖維組織增生，同時(shí)3 個(gè)不同部位取材切片中腎小管上皮細(xì)胞均存在脫落壞死的情況。

圖1 不同取材部位腎臟病理組織形態(tài)學(xué)比較（HE ×100）

2.3 不同部位取材標(biāo)本評(píng)估結(jié)果的比較：為了探究棄用腎臟不同取材部位的具體病變程度的差異，我們對(duì)其進(jìn)行量化比較，結(jié)果如圖2 所示。從圖中我們發(fā)現(xiàn)從腎臟不同部位獲取的標(biāo)本中可觀察到的腎小球數(shù)量、小動(dòng)脈數(shù)量及其相對(duì)應(yīng)的病變組織的數(shù)量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模擬供腎評(píng)估對(duì)不同部位標(biāo)本進(jìn)行評(píng)分發(fā)現(xiàn)不同取材部位標(biāo)本的Banff 評(píng)分、Remuzzi 評(píng)分、Maryland 評(píng)分和Pirani 評(píng)分均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明從不同部位對(duì)腎臟進(jìn)行取材活檢對(duì)評(píng)估結(jié)果沒(méi)有顯著影響。

圖2 棄用腎臟不同部位取材標(biāo)本腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量以及慢性病變程度及不同評(píng)分系統(tǒng)中分?jǐn)?shù)的比較

2.4 解剖標(biāo)本與穿刺標(biāo)本評(píng)估結(jié)果的比較：進(jìn)一步探究了解剖標(biāo)本與對(duì)應(yīng)的供腎獲取時(shí)穿刺標(biāo)本評(píng)估結(jié)果的差異，結(jié)果如圖3 所示。在組織固有結(jié)構(gòu)數(shù)量方面，解剖標(biāo)本中腎小球數(shù)量為（42.9±25.4）個(gè)，小動(dòng)脈數(shù)量為（21.9±13.8）個(gè)，穿刺標(biāo)本中腎小球數(shù)量為（13±3.8）個(gè)，小動(dòng)脈數(shù)量為（9.4±3.8）個(gè)，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩種活檢標(biāo)本中腎小球硬化數(shù)量、小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚數(shù)量以及小動(dòng)脈透明樣變數(shù)量沒(méi)有顯著差異。在病變范圍表現(xiàn)方面，解剖標(biāo)本中腎小球硬化率為25%±23.2%，小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚比例為46.5%±22.8%，小動(dòng)脈透明樣變比例為59.3%±16.4%，而穿刺標(biāo)本中腎小球硬化率為42%±8.8%，小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚比例為68%±27%，小動(dòng)脈透明樣變比例為86%±17.4%，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。僅Banff 評(píng)分中穿刺標(biāo)本的腎小球硬化評(píng)分為（2.2±0.4）分，解剖標(biāo)本腎小球硬化評(píng)分為（1.6±0.9）分，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其他項(xiàng)評(píng)分中兩者均不存在差異。該結(jié)果說(shuō)明穿刺標(biāo)本在評(píng)估供腎病變范圍方面可能高于供腎實(shí)際情況，但是在評(píng)分方面穿刺標(biāo)本結(jié)果基本可以反映腎臟真實(shí)慢性病變情況。

圖3 腎臟解剖標(biāo)本與對(duì)應(yīng)穿刺標(biāo)本腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量以及慢性病變比例及不同評(píng)分系統(tǒng)中分?jǐn)?shù)的比較

2.5 解剖標(biāo)本和穿刺標(biāo)本在單位面積下腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量的比較：由于解剖標(biāo)本面積大于穿刺標(biāo)本，所以解剖標(biāo)本中腎小球和小動(dòng)脈的數(shù)量多于穿刺標(biāo)本。因此為了消除因面積而產(chǎn)生的差異，我們計(jì)算單位面積（1 cm2）下，兩種標(biāo)本的腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量，結(jié)果如圖4 所示。通過(guò)計(jì)算我們發(fā)現(xiàn)每個(gè)單位面積中穿刺標(biāo)本的腎小球數(shù)量小于解剖標(biāo)本，數(shù)量分別為（199.3±50.7）個(gè)/cm2和（240.6±57.4）個(gè)/cm2。但是穿刺標(biāo)本的小動(dòng)脈數(shù)量大于解剖標(biāo)本，數(shù)量分別為（153.5±76.9）個(gè)/cm2和（114.9±43.7）個(gè)/cm2。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 腎臟解剖標(biāo)本與對(duì)應(yīng)穿刺標(biāo)本在單位面積下腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量的比較

3 討 論

在供器官的選擇過(guò)程中，組織病理學(xué)評(píng)估結(jié)果具有非常重要的指導(dǎo)意義。目前相關(guān)的供器官評(píng)估評(píng)分系統(tǒng)多達(dá)15 種［9-11］。雖然目前還沒(méi)有最佳的供腎評(píng)分系統(tǒng)［12］，但是一致的觀點(diǎn)是病理醫(yī)生需要從活檢標(biāo)本中觀察到足夠數(shù)量的腎臟固有結(jié)構(gòu)才能使用相關(guān)評(píng)分系統(tǒng)。然而由于目前對(duì)于取材方法尚未有明確的操作規(guī)范和指南，導(dǎo)致現(xiàn)在供器官的病理組織活檢取材量非常有限［13］，并且活檢往往存在采樣誤差［14-16］。Haas 等［17］的研究表明目前在評(píng)估動(dòng)脈纖維內(nèi)膜增厚及動(dòng)脈硬化時(shí)結(jié)果往往不可靠，并且腎小球硬化率和間質(zhì)纖維化的趨勢(shì)容易被高估。而目前關(guān)于供器官獲取時(shí)取材部位和方式的研究較少。因此，本研究旨在探究取材部位和方式對(duì)供器官病理組織學(xué)評(píng)估的影響。

首先為了探究不同部位取材對(duì)供器官組織病理學(xué)評(píng)估的影響，我們利用本中心經(jīng)評(píng)估后棄用腎臟，分別針對(duì)腎臟不同位置進(jìn)行活檢取材并通過(guò)模擬評(píng)估的方式統(tǒng)計(jì)活檢結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)不同部位取材的標(biāo)本中可觀察到的腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量沒(méi)有差異，對(duì)活檢標(biāo)本模擬供腎評(píng)估后發(fā)現(xiàn)上述標(biāo)本在Banff 各項(xiàng)評(píng)分、Remuzzi 評(píng)分、Maryland 評(píng)分以及Pirani 評(píng)分中均沒(méi)有顯著性差異。我們的研究表明，腎臟不同部位的固有結(jié)構(gòu)數(shù)量相對(duì)較為平均，并且腎臟慢性改變?cè)谀I皮質(zhì)區(qū)域的表現(xiàn)較為均一，較少出現(xiàn)慢性局灶性病變。

因?yàn)榻馄蕵?biāo)本取材范圍較大，更能反映供腎真實(shí)的病理改變，所以我們比較解剖標(biāo)本與獲取時(shí)穿刺標(biāo)本的差異。結(jié)果表明雖然穿刺標(biāo)本在腎小球和小動(dòng)脈病變范圍上大于解剖標(biāo)本，但是在供腎評(píng)分方面僅在Banff 評(píng)分的腎小球硬化評(píng)分一項(xiàng)中，穿刺標(biāo)本得分高于解剖標(biāo)本，其他評(píng)分結(jié)果兩者均不存在差異。一直以來(lái)對(duì)于穿刺活檢標(biāo)本是否可以真實(shí)反映腎臟病變情況的爭(zhēng)論始終較大，Oberholzer等［18］認(rèn)為穿刺活檢標(biāo)本足以準(zhǔn)確分析腎臟腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化程度，但是Girolami 等［13］利用棄用腎臟做對(duì)比實(shí)驗(yàn)后認(rèn)為活檢結(jié)果不能代替整個(gè)器官病變程度，活檢標(biāo)本可能會(huì)高估腎臟病變的程度。我們的結(jié)果更傾向于穿刺標(biāo)本可以反映供腎真實(shí)質(zhì)量。雖然穿刺標(biāo)本腎小球硬化率、小動(dòng)脈內(nèi)膜增厚和透明樣本比例高于解剖標(biāo)本，但是2 種標(biāo)本的評(píng)分沒(méi)有差異，而穿刺標(biāo)本中腎小球和小動(dòng)脈病變比例高可能與穿刺標(biāo)本中可觀察到的腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量較少有關(guān)。這一結(jié)果也與Muruve 等［19］的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

由于穿刺標(biāo)本面積小于解剖標(biāo)本，所以兩者腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量并沒(méi)有可比性。因此我們計(jì)算單位面積下2 種標(biāo)本的腎小球和小動(dòng)脈數(shù)量。有趣的是，穿刺標(biāo)本在單位面積下腎小球數(shù)量少于解剖標(biāo)本，但是小動(dòng)脈數(shù)量高于解剖標(biāo)本。腎實(shí)質(zhì)可以分為皮質(zhì)和髓質(zhì)，皮質(zhì)位于腎實(shí)質(zhì)淺層，其中85%的腎單位位于皮質(zhì)區(qū)域［20］。根據(jù)血流方向，腎動(dòng)脈分為5 級(jí)，其中位于腎實(shí)質(zhì)淺層的血管主要是血供末梢的入球小動(dòng)脈，該段動(dòng)脈易收到供者年齡等因素的影響［21］，因此，最佳的穿刺效果是穿刺針獲取的標(biāo)本主要為腎皮質(zhì)及皮髓質(zhì)交接區(qū)域，此時(shí)可以觀察到更多的腎小球和更多供腎深部的小血管分支。我們的結(jié)果說(shuō)明在取材時(shí)，穿刺針進(jìn)針角度往往過(guò)大，穿刺深度過(guò)深，導(dǎo)致一部分穿刺針獲取的標(biāo)本為髓質(zhì)部分，所以在穿刺標(biāo)本中觀察到更少的腎小球和更多的小動(dòng)脈。因此，該結(jié)果也提示今后在進(jìn)行穿刺取材時(shí)應(yīng)適當(dāng)減小進(jìn)針角度。

本實(shí)驗(yàn)中，我們探究了不同部位取材對(duì)供腎評(píng)估的影響以及目前穿刺活檢取材的問(wèn)題。但是由于研究標(biāo)本量較少，今后還需要擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行進(jìn)一步研究，另外今后也可以通過(guò)計(jì)算明確最佳穿刺角度，從而為醫(yī)生取材提供數(shù)據(jù)參考。