宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的建立與評(píng)價(jià)*

梁 漫，龐博華，陽(yáng)長(zhǎng)永，王 鶴

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科二區(qū)，南寧 530021）

宮頸癌是最常見(jiàn)的女性生殖道惡性腫瘤，目前其發(fā)病率排在女性惡性腫瘤第4位[1]，并呈現(xiàn)出上升和年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響女性的生理及心理健康。宮頸癌病因研究一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前較為明確的是持續(xù)性的人類乳頭瘤病毒（HPV）感染是造成宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及宮頸癌的關(guān)鍵病因[2]。目前研究中，我國(guó)在不同地區(qū)和不同人群中的HPV16感染率基本上都是最高的。在中國(guó)大陸目前感染率排在前5 位HPV 亞型分別是HPV16、HPV52、HPV58、HPV53、HPV18[3]。女性陰道微生態(tài)由陰道的解剖結(jié)構(gòu)、微生態(tài)菌群、局部免疫系統(tǒng)及機(jī)體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能共同組成，是動(dòng)態(tài)平衡的微生態(tài)系統(tǒng)[4]。陰道局部能夠通過(guò)增強(qiáng)局部自身的抗腫瘤免疫功能，來(lái)延緩或者阻止腫瘤的發(fā)生，其不僅受到陰道微生態(tài)平衡的影響，也受其黏膜免疫防御系統(tǒng)、局部免疫細(xì)胞以及其分泌的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。本研究對(duì)單純HPV16、HPV18、HPV52、HPV58陽(yáng)性患者其陰道微生態(tài)、陰道灌洗白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-10免疫因子及CD4+或CD8+T 細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染相關(guān)的宮頸病變對(duì)對(duì)陰道微生態(tài)及局部免疫狀態(tài)的影響及分析相關(guān)的危險(xiǎn)因素，最終建立相關(guān)的CIN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行驗(yàn)證，為臨床改變陰道微環(huán)境及局部免疫狀態(tài)、降低CIN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及CIN 的早診早治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018 年6 月至2020 年6 月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科行宮頸癌篩查或因?qū)m頸病變就診的患者行HPV 檢測(cè)，最終選取單純HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 陽(yáng)性的患者共155 例，其中HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 陽(yáng)性患者分別為88 例、14 例、33 例和20 例，同期選取HPV 陰性患者71 例為陰性對(duì)照。以上患者均在初診時(shí)常規(guī)進(jìn)行陰道微生物檢測(cè)及陰道灌洗。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)高危型人乳頭狀瘤病毒（HR-HPV）檢測(cè)結(jié)果為單純HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 陽(yáng)性或HPV 陰性；（2）年齡18～72 歲；（3）既往有性生活史，非月經(jīng)期、非妊娠期及非哺乳期婦女；（4）月經(jīng)干凈超過(guò)3 d；（5）取材前3 d內(nèi)無(wú)性生活、無(wú)婦科檢査、無(wú)陰道沖洗及陰道內(nèi)用藥；（6）近1 個(gè)月無(wú)抗生素服用史；（7）未用免疫抑制劑或激活劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡小于18歲或大于72歲；（2）無(wú)性生活史；（3）處于月經(jīng)期、妊娠期、哺乳期；（4）取材前3 d 內(nèi)有性生活、婦科檢査、陰道沖洗及陰道內(nèi)用藥；（5）近1 個(gè)月有抗生素服用史；（6）使用免疫抑制劑或激活劑；（7）高血壓、糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤等病史者；（8）曾接受如淋巴結(jié)切除術(shù)、脾切除術(shù)等損害機(jī)體免疫功能的手術(shù)治療者；（9）曾接受化療、放療及免疫系統(tǒng)治療者。本研究已取得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 陰道微生態(tài)檢測(cè) 患者取膀胱截石位，利用不涂潤(rùn)滑劑的陰窺器暴露陰道，先用精密pH 試紙接觸陰道壁，30 s 后取出，與標(biāo)準(zhǔn)色板比較讀取pH值。檢測(cè)出陰道pH值；常規(guī)于陰道側(cè)壁中上1/3處取分泌物涂片，用于檢查霉菌、線索細(xì)胞、乳酸桿菌、滴蟲(chóng)等微生物。

1.2.2 陰道局部免疫因子及T細(xì)胞亞群的檢測(cè)

用一次性10 mL無(wú)菌注射器取5 mL生理鹽水，沖洗陰道后穹窿及宮頸部，回吸收集陰道灌洗液大約5 mL，存放于無(wú)菌離心管內(nèi)，離心10 min（2 000 bpm），收集上清液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)IL-2、IL-10、CD4+及CD8+的檢測(cè)，并在-20°C冰箱保存，避免反復(fù)凍融，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.2.3 HPV 檢測(cè) 采用HPV 檢測(cè)專用取樣工具在宮頸口處取樣并保存于樣品管內(nèi)，送往檢驗(yàn)中心檢驗(yàn)。

1.2.4 宮頸病變檢查 對(duì)以上患者選取經(jīng)病理學(xué)檢查或?qū)m頸液基脫落細(xì)胞學(xué)檢査確定宮頸病變程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件及R3.6.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。CIN 危險(xiǎn)因素應(yīng)用單因素及多因素向前逐步Logistic 回歸，應(yīng)用R3.6.2軟件中的rms建立預(yù)測(cè)模型并制作列線圖（nomogram）。通過(guò)受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評(píng)估預(yù)測(cè)模型的區(qū)分度；運(yùn)用校準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)（bootstrap 1 000 次抽樣）評(píng)估預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)概率與實(shí)際概率的一致性；臨床決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）評(píng)估預(yù)測(cè)模型的臨床適用性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 感染情況進(jìn)行分組的陰道微生態(tài)檢測(cè)結(jié)果

各組間陰道中pH≤4.5、乳酸桿菌、滴蟲(chóng)、霉菌、線索細(xì)胞比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染的陰道微生物狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果分析

2.2 根據(jù)HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 感染情況進(jìn)行分組的的陰道局部免疫因子及T細(xì)胞亞群分析

HPV16（+）組、HPV52（+）組中IL-2 水平低于HPV（-）組（P＜0.05）；HPV16（+）組中IL-10 水平高于HPV（-）組（P＜0.05）；HPV16（+）組IL-10 水平高于HPV58（+）組（P＜0.05）；HPV16（+）組、HPV58（+）組中CD4+低于HPV（-）組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染的陰道局部免疫狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果

表2 HPV16、HPV18、HPV52、HPV58感染的陰道局部免疫狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果

與HPV（-）組比較，aP＜0.05；與HPV16（+）組比較，bP＜0.05。

2.3 根據(jù)宮頸病變情況分組的陰道微生物狀態(tài)及HPV檢測(cè)結(jié)果

CIN 組HPV（+）檢出率高于慢性炎癥組（P＜0.05）。CIN組陰道pH（≤4.5）陽(yáng)性檢出率低于慢性炎癥組（P＜0.05）；CIN組乳酸桿菌、滴蟲(chóng)、線索細(xì)胞與慢性炎癥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 宮頸病變的陰道微生物狀態(tài)及HPV檢測(cè)結(jié)果

2.4 根據(jù)宮頸病變情況分組的陰道局部免疫檢測(cè)結(jié)果

CIN 組陰道局部免疫因子IL-2、CD4+、CD4+/CD8+比值低于慢性炎癥組，IL-10 高于慢性炎癥組（P＜0.05）；CIN 組CD8+與慢性炎癥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 宮頸病變的陰道局部免疫狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果

表4 宮頸病變的陰道局部免疫狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果

2.5 陰道微環(huán)境及陰道局部免疫狀態(tài)中導(dǎo)致CIN的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果

納入HPV、IL-2、IL-10、CD4+、CD4+/CD8+比值等構(gòu)建多因素Logistic回歸方程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV感染（P=0.000）、IL-2 降低（P=0.000）、IL-10 升高（P=0.001）、CD4+低表達(dá)（P=0.029）是CIN發(fā)生的危險(xiǎn)因素；而CD4+/CD8+比值對(duì)CIN 發(fā)生無(wú)明顯影響（P=0.881），見(jiàn)表5。

表5 CIN的多因素Logistic危險(xiǎn)因素分析結(jié)果

2.6 基于陰道微生態(tài)及局部免疫相關(guān)的CIN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的建立

通過(guò)多因素采用向前逐步Logistic 回歸，得出的具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的4 個(gè)預(yù)測(cè)因素HPV（+）、IL-2、IL-10、CD4+納入、建立并繪制CIN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，以列線圖模型呈現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 CIN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)列線圖模型

2.7 模型的預(yù)測(cè)性能評(píng)估

繪制ROC 曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2，ROC 曲線下面積（AUC）為0.920，95%CI（0.882～0.958）超過(guò)0.9，表明該模型對(duì)于CIN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)能力有較高準(zhǔn)確性。校準(zhǔn)曲線為斜率接近于1 的直線，表明CIN的實(shí)際發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)測(cè)的可能性之間有很好的相關(guān)性（圖3）。此外，霍斯莫—萊梅肖檢驗(yàn)擬合度（hosmer and lemeshow test）方法來(lái)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合優(yōu)度，當(dāng)P＞0.05，認(rèn)為當(dāng)前數(shù)據(jù)中的信息已經(jīng)被充分提取，模型擬合優(yōu)度較高，當(dāng)P＜0.05，則模型校準(zhǔn)度差，表明實(shí)際觀測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值之間存在一定差異。本模型Hosmer-Lemeshow 的檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.4831 也表明此次預(yù)測(cè)模型的擬合優(yōu)度較高，與理想模型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 列線圖模型的ROC曲線及AUC

圖3 列線圖模型的校準(zhǔn)曲線

2.8 模型的決策曲線分析

通過(guò)計(jì)算模型的凈效益，應(yīng)用決策曲線分析評(píng)估預(yù)測(cè)模型的臨床價(jià)值及臨床適用性（圖4）。從圖4 中可知，在閾值范圍內(nèi)（橫坐標(biāo)）該預(yù)測(cè)模型的凈獲益率曲線（紅線）均在兩條極端線（黑線和灰線）的上方，即表明該預(yù)測(cè)有較大的閾值以及較好的臨床適用性。因此，本決策曲線分析顯示：在相同閾概率（橫坐標(biāo)）下，使用當(dāng)前研究中的列線圖（紅線）來(lái)預(yù)測(cè)CIN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)要比極端曲線（黑線和灰線）策略更獲益。

圖4 列線圖預(yù)測(cè)CIN的臨床決策曲線

3 討論

本文通過(guò)研究目前感染率較高的HPV 亞型HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 對(duì)局部陰道微生態(tài)及局部陰道免疫狀態(tài)的相關(guān)性，建立CIN風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果顯示CIN組HPV（+）檢出率較慢性炎癥組高，多因素分析也證實(shí)HPV感染是CIN發(fā)生的危險(xiǎn)因素，目前認(rèn)為持續(xù)HPV感染是導(dǎo)致CIN及宮頸癌的關(guān)鍵病因。HPV通過(guò)感染、整合、癌變參與宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展[4]。與既往研究中認(rèn)為持續(xù)性HPV 感染是CIN 主要病因相一致[2]。

本研究中CIN 組陰道pH（≤4.5）陽(yáng)性檢出率低于與慢性炎癥組，說(shuō)明陰道pH 值的升高可能導(dǎo)致正常宮頸向CIN 轉(zhuǎn)變。Curty 等[6]研究表明，女性陰道中以乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌種能夠促進(jìn)HPV 的清除及減少宮頸病變的發(fā)生。另外，也有研究表明陰道，pH 值的升高是CIN 發(fā)生的危險(xiǎn)因素[7]。Norenhag等[8]的系統(tǒng)回顧和薈萃分析提示，陰道中的乳酸桿菌與HPV感染顯著相關(guān)。

本研究中結(jié)果顯示，HPV16（+）組、HPV52（+）組IL-2 水平低于HPV（-）組，HPV16（+）組、HPV58（+）組IL-10 水平高于HPV（-）組，HPV16（+）組IL-10 水平高于HPV58（+）組。Th2 細(xì)胞型因子如IL-4、IL-10 在腫瘤患者體內(nèi)處于優(yōu)勢(shì)地位，HPV 感染后導(dǎo)致宮頸組織向Th2細(xì)胞偏移發(fā)生偏移導(dǎo)致Th1/Th2失衡，使IL-2等Th1細(xì)胞型因子等合成減少，IL-4、IL-10 等Th2 細(xì)胞型因子合成增加［9］。本研究結(jié)果顯示，在HPV16、HPV18、HPV52、HPV58 這4 個(gè)亞型感染導(dǎo)致陰道局部Th1/Th2 免疫平衡也向Th2細(xì)胞偏移明顯。另外，本研究結(jié)果也表明，IL-2、IL-10是誘導(dǎo)宮頸病變的重要因子，在感染HPV 后，會(huì)出現(xiàn)免疫抑制的情況，表現(xiàn)為IL-2 水平降低，IL-10水平升高[10]，這與Westrich 等[11]研究相一致。本研究證實(shí)IL-2 降低、IL-10 升高是CIN 發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

本研究結(jié)果顯示，HPV16（+）組、HPV58（+）組中CD4+水平低于HPV（-）組；CIN 組陰道局部CD4+、CD4+/CD8+水平低于慢性炎癥組。這與唐清華等[12]報(bào)道的結(jié)果相一致。CD4+/CD8+作為T 細(xì)胞亞群，在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)以及維持機(jī)體免疫平衡方面具有重要作用。本研究中，HPV16、HPV58 感染主要表現(xiàn)為CD4+細(xì)胞的缺陷；而CIN組陰道局部CD4+、CD4+/CD8+水平低于慢性炎癥組，說(shuō)明CD4+的低表達(dá)及CD4+/CD8+的比例失衡，可導(dǎo)致宮頸免疫應(yīng)答的減弱，從而導(dǎo)致宮頸向CIN的轉(zhuǎn)化。同時(shí)本研究結(jié)果表明CD4+低表達(dá)是CIN 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

在臨床研究中，臨床預(yù)測(cè)模型是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的重要工具[13]。本研究建立了基于4 個(gè)預(yù)測(cè)因素HPV（+）、IL-2、IL-10、CD4+的CIN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型。對(duì)該模型的預(yù)測(cè)效能驗(yàn)證表明：列線圖的AUC=0.920，超過(guò)0.9，表明該模型對(duì)于CIN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)能力有較高準(zhǔn)確性；校準(zhǔn)曲線為斜率接近于1 的直線，表明實(shí)際CIN 發(fā)病率和預(yù)測(cè)的可能性之間有很好的相關(guān)性。本模型Hosmer-Lemeshow 的檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.4831 也表明此次預(yù)測(cè)模型的擬合優(yōu)度較高，和理想模型沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并且臨床決策曲線結(jié)果顯示，在相同閾概率下，使用當(dāng)前研究中的列線圖來(lái)預(yù)測(cè)CIN 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)要比極端曲線策略更獲益說(shuō)明該預(yù)測(cè)模型具有臨床適用性。以上驗(yàn)證表明，本文建立了一個(gè)預(yù)測(cè)效能良好的CIN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型。陳嫻等[14]研究中確定吸煙史、TCT、HPV、陰道鏡影像診斷、病變面積/宮頸面積預(yù)測(cè)因子建立CIN2+的列線圖預(yù)測(cè)模型具有良好的區(qū)分度與精確度。

綜上所述，本研究建立的CIN 預(yù)測(cè)模型具有良好的預(yù)測(cè)效能。但由于該模型是基于單中心、回顧性數(shù)據(jù)，并且僅做了內(nèi)部驗(yàn)證，缺乏外部的驗(yàn)證集及前瞻性數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，因此，本預(yù)測(cè)模型仍存在一定的局限性，未來(lái)應(yīng)開(kāi)展聯(lián)合多中心的前瞻性研究對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步評(píng)估其穩(wěn)定性并投入到臨床的工作中。