右美托咪定對布比卡因脊髓神經(jīng)毒性的作用及相關(guān)機(jī)制*

韋麗玲，羅云鵬，賴 堅，趙 漾，周 剛，陳美云紫，余 悅，劉敬臣

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧 530021）

椎管內(nèi)麻醉廣泛應(yīng)用于臨床，尤其在基層醫(yī)院仍然是最主要的麻醉方式之一。但椎管內(nèi)麻醉已經(jīng)被證實具有潛在的神經(jīng)毒性[1]，比如短暫性神經(jīng)綜合征、馬尾神經(jīng)綜合征等[2-4]，雖然椎管內(nèi)麻醉并發(fā)癥發(fā)生率不高，然而一旦發(fā)生將救治困難。因此，探索椎管內(nèi)麻醉發(fā)生神經(jīng)毒性的機(jī)制具有重要意義。本課題組前期探索發(fā)現(xiàn)，局麻藥神經(jīng)毒性發(fā)生的機(jī)制可能與局麻藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[5-6]。右美托咪定是臨床麻醉中最見的麻醉藥物之一，近年來其器官保護(hù)作用是一個很重要的研究方向。相關(guān)文獻(xiàn)報道右美托咪定具有抑制大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡而起到腦保護(hù)作用[7-8]，而右美托咪定是否能通過抑制椎管內(nèi)神經(jīng)元的凋亡而起到神經(jīng)保護(hù)作用，目前尚缺乏相關(guān)報道。Pi3k/Akt 是細(xì)胞中一個經(jīng)典的信號通路，參與體內(nèi)細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡等，維持機(jī)體正常的免疫、代謝，是生命體不可缺少的重要通路之一[9]。以往研究表明右美托咪定可以通過激活Pi3k/Akt通路而起到抗凋亡的作用。因此本研究擬探索右美托咪定是否可以通過激活Pi3k/Akt 信號通路減少脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而減少布比卡因脊髓神經(jīng)毒性。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和實驗器材

PE-10 導(dǎo)管購自Smith Medical 公司（英國）；布比卡因（貨號：B5274）和右美托咪定鹽酸鹽（貨號SML0956）；YLS.A12A鼠尾光照測痛儀購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；GAPDH、Bax和Cleavedcaspase3抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Bcl-2 購自沈陽萬類科技有限公司；Akt、p-Akt、Pi3k、p-Pi3k 抗體均購自艾比馬特生物醫(yī)藥上海有限公司；488 熒光二抗購自Abcam 公司；RIPA 蛋白酶裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF、5×蛋白上樣緩沖液、BCA檢測試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自沈陽萬類科技有限公司；Odessey 紅外熒光掃膜儀器購自Licor公司。

1.2 實驗動物

SPF級成年雄性SD大鼠260～280 g購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK 桂2020-0004，實驗動物使用許可證號SYXK-桂2020-0004，對大鼠進(jìn)行分籠進(jìn)行飼養(yǎng)，水和食物充足，20～25℃恒溫環(huán)境，固定晝夜各12 h 交替循環(huán)周期。本動物實驗已經(jīng)獲得廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 動物分組以及干預(yù)方法

按隨機(jī)數(shù)字表法將24 只SPF 級SD 大鼠分為3組：生理鹽水組（S組）、布比卡因組（B組）、右美托咪定預(yù)處理組（D 組）。3 組SD 大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管后分別進(jìn)行以下處理：S 組鞘內(nèi)注射0.12 μL/g 的生理鹽水，連續(xù)3 次每次間隔90 min，B 組鞘內(nèi)注射0.12 μL/g的5%的布比卡因，連續(xù)3次每次間隔90 min，D組腹腔注射50 μg/kg的右美托咪定[1]，30 min后連續(xù)3 次鞘內(nèi)注射5%布比卡因每次間隔90 min。置管前，給藥后0 d、1 d、2 d、3 d 取材前分別測大鼠甩尾反應(yīng)潛伏期（TFL）和進(jìn)行運動功能評分（BBB）評分。給藥后3 d取大鼠脊髓腰膨大處組織。

1.4 蛛網(wǎng)膜下腔置管

采用改良Yasksh 法[10]給SD 大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管，預(yù)先用生理鹽水充滿PE-10導(dǎo)管，選取L5～L6腰椎間隙向頭部置管，置管長度為1.5～2.0 cm。置管時大鼠出現(xiàn)甩尾反應(yīng)和導(dǎo)管有生理鹽水溢出，表示置管成功。將PE-10 導(dǎo)管固定于背部肌肉，皮下埋管導(dǎo)管遠(yuǎn)端從頸部穿出，并固定于頸部皮膚，火燒封管。置管后單籠飼養(yǎng)3 d，鞘內(nèi)給10 μL 利多卡因，30 s內(nèi)出現(xiàn)雙下肢麻痹，且30 min內(nèi)恢復(fù)表明蛛網(wǎng)膜下腔置管成功。雙下肢出現(xiàn)運動功能受損者剔除出實驗。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 感覺功能和運動功能評價 大鼠TFL 評價大鼠感覺功能，分別在置管前測基礎(chǔ)值，給藥后0 d、1 d、2 d、3 d用鼠尾光照測痛儀測定并記錄大鼠甩尾反應(yīng)時間，測量3次，每次間隔5 min，取平均值。換算成最大抗輻射熱效應(yīng)百分比（%MPE），轉(zhuǎn)換公式=（實測值-基礎(chǔ)值）/（最大值-基礎(chǔ)值）×100%，防止鼠尾出現(xiàn)損傷，最大值為16.01 s。大鼠后肢BBB評分：0分是后肢運動功能消失，21分是后肢運動功能完全正常。為避免大鼠晝夜差異，測定時間固定于同一時間點進(jìn)行。

1.5.2 光鏡觀察脊髓蘇木精—伊紅（HE）病理改變 各組大鼠于給藥后3 d，采用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，后用4 ℃生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，取脊髓腰膨大處，迅速固定于4%多聚甲醛。腰膨大固定24 h后，石蠟包埋，切成4 μm 大小的連續(xù)厚片，進(jìn)行HE染色。

1.5.3 Western blotting檢測相關(guān)蛋白指標(biāo) 每組脊髓腰膨大凍存標(biāo)本加入RAPA、蛋白酶抑制劑、磷酸酶進(jìn)行勻漿，后置于冰上裂解30 min，13 000 r/min，15 min，吸取上清。用BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃水煮5 min。使用8%和12%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，使用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，BSA 封閉1 h，按一抗說明書指示進(jìn)行抗體稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，小鼠來源的一抗用二抗HRP標(biāo)記的山羊抗體室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光發(fā)暗室曝光顯影。兔來源的一抗采用熒光標(biāo)記的山羊抗體室溫孵育1 h，TBST洗膜，Odessey 紅外熒光掃膜儀器掃描所得PVDF 膜。掃描結(jié)果采用Image J 軟件分析條帶灰度值，以條帶灰度值來反應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)量的水平。

1.5.4 免疫熒光法 檢測Bax 和Bcl-2 在細(xì)胞中表達(dá)量，取各組預(yù)先制好的石蠟切片至于60 ℃烤箱烤片1～2 h，脫蠟后用檸檬酸鈉高壓抗原修復(fù)，PBS 洗片，3%的過氧化氫室溫孵育10 min，0.3%Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗片，5%驢血清室溫封閉30 min，Bax和Bcl-2一抗（1∶50）4 ℃孵育過夜，PBS洗片，羊抗兔488 熒光二抗（1∶800）室溫避光孵育1 h，PBS漂洗后DAPI染核室溫5 min，PBS洗片，滴加抗熒光淬滅劑蓋蓋玻片封片；于熒光顯微鏡下觀察拍照，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染色，代表整片所有細(xì)胞數(shù)，綠色熒光為Bax和Bcl-2陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25～P75）]表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組感覺功能比較

S 組，B 組，D 組在置管前%MEP 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B組和D 組在給藥后0 d、1 d、2 d、3 d%MEP均大于S組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。與B 組比較，D 組在給藥后的3 d%MEP 較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組感覺功能比較

表1 各組感覺功能比較

與S組比較，*P＜0.05；與B組相較，#P＜0.05。

2.2 各組大鼠不同時間點后肢BBB評分比較

S組、B組、D組給藥前BBB評分均為21分。與S 組比較，B 組、D 組在給藥后的0 d、1 d、2 d、3 d BBB評分較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組不同時間點大鼠BBB評分比較分,M（P25～P75）

2.3 各組脊髓病理組織HE染色的改變

光鏡下S組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，輪廓規(guī)則清晰，尼氏體豐富，核仁清晰，核膜完整。B組和D組神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度水腫、萎縮、數(shù)目減少，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、深染，溶解，核膜不完整。與B 組相較D 組損傷輕，神經(jīng)元的水腫、萎縮較輕，核仁相對清晰，核膜相對完整，損傷的神經(jīng)元個數(shù)較少，見圖1。

圖1 各組HE染色光鏡下脊髓組織損傷情況

2.4 各組脊髓組織蛋白的表達(dá)情況

與S組比較，B組和D組凋亡相關(guān)蛋白Cleavedcaspase3、Bax表達(dá)量增多，Bcl-2、p-Akt、p-Pi3k表達(dá)量下降（均P＜0.05）。與B 組比較，D 組Bcl-2、p-Pi3k、p-Akt表達(dá)量上升，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3 和Bax 表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組脊髓組織Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、Pi3k、p-Pi3k蛋白的表達(dá)情況

2.5 各組脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá)情況

各組脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2 均在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，B組和D組陽性表達(dá)量較多，S組較少；見圖3、圖4。

圖3 各組脊髓組織Bax蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá)情況

圖4 各組脊髓組織Bcl-2蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá)情況

3 討論

腰麻是將局麻藥注入蛛網(wǎng)膜下腔，阻滯神經(jīng)根使其相應(yīng)支配區(qū)域產(chǎn)生麻醉效果，局麻藥已經(jīng)被證實存在神經(jīng)毒性，臨床上出現(xiàn)局麻藥神經(jīng)毒性主要包括馬尾綜合征、短暫神經(jīng)綜合征等。在本研究中布比卡因處理的大鼠其感覺功能和運動功能受損，不能對熱刺激及時做出甩尾反應(yīng)，表現(xiàn)為BBB評分下降和TFL評分上升；HE染色神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元水腫明顯，神經(jīng)元周圍空泡增多。應(yīng)用右美托咪定預(yù)處理后的大鼠TFL 評分在第3 天后明顯下降，HE染色神經(jīng)元的水腫得到一定改善，神經(jīng)元周圍空泡減少。本實驗可以證實布比卡因存在脊髓神經(jīng)毒性，與本課題組前期研究結(jié)果一致，右美托咪定預(yù)處理后可以減輕布比卡因?qū)е碌募顾枭窠?jīng)毒性。布比卡因是臨床最常使用的局麻藥之一，有實驗證實布比卡因可以誘導(dǎo)各種類型的神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性。其中包括誘導(dǎo)小鼠背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元出現(xiàn)退變和神經(jīng)元凋亡[11]；通過t型鈣通道誘導(dǎo)SHSY5Y 細(xì)胞凋亡[12]，通過損害線粒體功能，從而增強(qiáng)谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬興奮性毒性[13]，通過增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)布比卡因處理的大鼠凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Bax表達(dá)量增多，抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量下降?？梢宰C實布比卡因誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡從而產(chǎn)生了神經(jīng)毒性。

凋亡作為脊髓神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一已經(jīng)得到證實，抑制凋亡具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。右美托咪定是高度選擇性α2受體激動劑，可以結(jié)合突觸前α2腎上腺素受體，激活交感反應(yīng)的負(fù)反饋回路，減少去甲腎上腺素的釋放，從而抑制交感反射和應(yīng)激反應(yīng)，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抗交感的作用[15]。有實驗表明右美托咪定可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞凋亡、焦亡等機(jī)制減輕創(chuàng)傷性腦損傷[16]、腦缺血再灌注損傷[17]、創(chuàng)傷性脊髓損傷[18]、脊髓缺血再灌注損傷[19]。在本實驗布比卡因脊髓神經(jīng)毒性模型中，應(yīng)用右美托咪定預(yù)處理后凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Bax表達(dá)量下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量上升。本實驗研究結(jié)果證實右美托咪定抑制脊髓神經(jīng)元凋亡減輕了布比卡因的神經(jīng)毒性從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，其神經(jīng)保護(hù)作用和上述研究結(jié)果一致。

Pi3k/Akt 信號通路已經(jīng)被證實和細(xì)胞生長、增殖、分化、生存、死亡密切相關(guān)。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，Pi3k）是一種異二聚體酶，是體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)分子，在接受外來信號刺激后活化，活化的Pi3k可以產(chǎn)生生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3 是活下游蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）的第二S 信使，蛋白激酶B 是一種進(jìn)化上保守的特異性蛋白激酶，被激活后蛋白激酶B可以下調(diào)Bad、Bax、caspase等促凋亡蛋白，在細(xì)胞存活和凋亡中發(fā)揮重要作用，是PI3K的重要靶點[20]。有實驗證實右美托咪定可以調(diào)控Pi3k/Akt信號通路抑制細(xì)胞凋亡[21]，本實驗也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，B組的p-Pi3k、p-Akt 水平下降，而D 組p-Pi3k、p-Akt水平上升，表明布比卡因促進(jìn)神經(jīng)元凋亡可能與抑制Pi3k/Akt 通路有關(guān)，而右美托咪定減少神經(jīng)元凋亡可能與激活Pi3k/Akt通路有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)布比卡因具有脊髓神經(jīng)毒性，其機(jī)制可能是布比卡因抑制Pi3k/Akt 信號通路誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元的凋亡。右美托咪定可以減輕布比卡因?qū)е碌募顾枭窠?jīng)毒性，其機(jī)制是激活的Pi3k/Akt信號通路抑制了脊髓神經(jīng)元的凋亡。本實驗通過建立布比卡因大鼠脊髓神經(jīng)毒性模型，為局麻藥布比卡因脊神經(jīng)毒性提供的新的治療思路。本實驗存在一定的局限性，布比卡因是如何抑制Pi3k/Akt信號誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元凋亡以及右美托咪定如何激活Pi3k/Akt信號抑制脊髓神經(jīng)元凋亡的仍需進(jìn)一步的探究。