貝塞爾光束在生物醫(yī)學(xué)顯微成像技術(shù)中的應(yīng)用（特邀）

陳雪利，王鑫宇，閆天宇，曾琦，徐欣怡，謝暉

（西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院西安市跨尺度生命信息智能感知與調(diào)控重點實驗室，西安710126）

0 引言

自從DURNIN J 于1987年將“無衍射光束”引入光學(xué)領(lǐng)域以來，無衍射光束在理論和實驗上都得到了深入的研究［1-2］。無衍射光束包括一系列光束，其中最常見的為貝塞爾光束和艾里光束。無衍射光束在傳輸過程中不發(fā)生衍射和擴(kuò)散，可以在較長的距離上保持其緊密聚焦特性。除此之外，無衍射光束還具有自重構(gòu)特性［3-6］，這是指遇到散射粒子等障礙物后可在其后重新形成無衍射光束。無衍射光束在成像、微操控、非線性光學(xué)等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，本文將重點關(guān)注無衍射光束中的貝塞爾光束。

WEN W 等比較了貝塞爾-高斯光束與艾里光束在相同條件下的相似性演化，發(fā)現(xiàn)貝塞爾-高斯光束具有更強(qiáng)的自重構(gòu)能力，比艾里光束更穩(wěn)定［7］。貝塞爾光束的這兩個特性能夠提供高斯光束無法比擬的優(yōu)勢，無衍射特性能夠為成像獲取更大的景深，這在高速多光子熒光顯微成像、多光子三維顯微成像、三維區(qū)域的二維投影成像、大尺度光片熒光顯微成像等方面取得了廣泛的應(yīng)用；而自重構(gòu)特性則滿足了各種成像手段在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的散射介質(zhì)中增大成像深度的需求。本文將介紹幾種實驗室常用的貝塞爾光束的產(chǎn)生方法，并按照成像方式總結(jié)貝塞爾光束的應(yīng)用。

1 貝塞爾光束簡介

貝塞爾函數(shù)是亥姆霍茲方程的精確解，而貝塞爾光束數(shù)學(xué)上可用貝塞爾函數(shù)來表示。經(jīng)典貝塞爾光束是一種無衍射光束，具有特殊的景深、自恢復(fù)和相對于散射極限的波束寬度等顯著特征。理想的貝塞爾光束可以認(rèn)為是無限多個等振幅的平面子波，沿傳播方向z相干迭加而成，在柱坐標(biāo)下電場可以表示為

式中，Jn(·)表示n階貝塞爾函數(shù)，kr和kz分別表示徑向和軸向波矢，A0為常數(shù)，r、φ、z分別為徑向、方位角和軸向坐標(biāo)分量。貝塞爾光束的橫向電場分布由貝塞爾函數(shù)描述，與傳播方向z無關(guān)。在實驗室很難構(gòu)建一個真正的貝塞爾光束，一個完美的貝塞爾光束是由一個無界的聚焦錐形波前產(chǎn)生，它在橫向上有無限多的旁瓣，并且具有無限的能量［2］。0 階和1 階貝塞爾光束的光場如圖1（a）、1（b）所示，圖1（c）是在自由空間傳輸?shù)? 階貝塞爾光束軸向能量分布。通過實驗的方法可以生成非常好的近似貝塞爾光束，它至少在某些區(qū)域具有理想貝塞爾光束的所有特性。對于有限能量的光束生成的貝塞爾光束每個環(huán)的能量會隨著環(huán)數(shù)量的增加而降低，隨著環(huán)數(shù)的增加，中心光斑的能量也會降低。實驗室常用的無衍射光束生成方法包括以下幾種。

圖1 貝塞爾光束強(qiáng)度分布Fig.1 Schematic diagram of Bessel beam generation method

1.1 環(huán)縫法

環(huán)縫法是貝塞爾光束的第一個實驗室實現(xiàn)方法，它利用貝塞爾光束的數(shù)學(xué)形式，即圓環(huán)的傅里葉變換產(chǎn)生［2］，如圖2（a）所示，在焦距為f的透鏡焦平面上放置圓形環(huán)縫，當(dāng)光束垂直入射時，就能在透鏡后方錐形區(qū)域內(nèi)形成零階貝塞爾光束。這種方法雖然可以成功的生成貝塞爾光束，但是環(huán)形掩模的存在擋掉了大部分的入射光，導(dǎo)致這一方法轉(zhuǎn)化效率很低，不適用于需要高強(qiáng)度光束的應(yīng)用。

圖2 貝塞爾光束生成方法示意圖Fig.2 Schematic diagram of Bessel beam generation method

1.2 軸棱錐法

一個軸棱錐是產(chǎn)生貝塞爾光束最便捷和經(jīng)濟(jì)的方法，軸棱錐通過折射入射光束產(chǎn)生干涉圖案［8-9］，如圖2（b）所示，當(dāng)照明高斯光束的腰圍尺寸遠(yuǎn)小于軸棱錐的硬孔徑時，幾乎整個輸入都會轉(zhuǎn)換為貝塞爾光束，這種方法效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于環(huán)縫法。通常情況下，入射光束是高斯光束，此時在軸棱鏡后產(chǎn)生的光束稱為高斯貝塞爾光束，其強(qiáng)度分布為

式中，r和z是徑向和縱向坐標(biāo)，I0和ω0是入射高斯光束的強(qiáng)度和束腰直徑，k是波矢，n是軸棱錐材料的折射率，α是楔角。中心波瓣的寬度由貝塞爾函數(shù)的第一個零點來確定

式中，a是常數(shù)。貝塞爾光束的近似瑞利距離可以表示為

式中，D是孔徑，df是中心波瓣的直徑，λ是激光波長。在此將式（3）獲得的df代入式（4），可以得到瑞利距離

因此，軸棱錐的楔角最終決定了貝塞爾光束中心波瓣的束腰寬度和傳輸長度，較小的角度對應(yīng)于較寬的波瓣和較長的“無衍射”傳播距離。軸棱錐使用時需要入射光與軸棱錐之間精確對準(zhǔn)，否則會導(dǎo)致光束不均勻。使用軸棱錐型計算全息圖，例如衍射螺旋軸棱錐，可以從照明高斯光束直接生成高階貝塞爾光束。除此之外還有組合軸棱錐生成貝塞爾光束的方法［10］，使用軸棱錐加透鏡組成光束轉(zhuǎn)化模塊也是目前實驗室常用的光束轉(zhuǎn)化方法。

1.3 基于空間光調(diào)制器的方法

空間光調(diào)制器（Spatial Light Modulator，SLM）是一種可以改變輸入光束相位和強(qiáng)度的數(shù)字設(shè)備。因為能夠生成任意光束特征和全息圖，所以在加工和成像應(yīng)用廣泛而且很受歡迎。人們可以很容易地在SLM中產(chǎn)生與衍射軸錐相對應(yīng)的相位圖案，因此，SLM 能夠生成具有用戶定義的楔角的貝塞爾光束［11］。盡管提供了最廣泛的強(qiáng)度分布，但這些設(shè)備往往具有相對較低的損傷閾值。

1.4 基于光纖的方法

光纖是產(chǎn)生貝塞爾光束或環(huán)形光束的有效替代物。利用光纖產(chǎn)生貝塞爾光束有很多方法，包括化學(xué)蝕刻或者適當(dāng)?shù)膾伖庠诠饫w尖端制造軸棱錐等方法［12］，其主要優(yōu)勢在于不使用自由空間元件，有利于集成在小型系統(tǒng)中。

1.5 基于超表面的方法

超表面是一種厚度小于波長的人工層狀材料，可以認(rèn)為是一種低維度的超材料，其容易實現(xiàn)且具有超出傳統(tǒng)平面超輕成型能力。通常由具有空間變化的幾何參數(shù)和亞波長分離的平面光學(xué)諧振器陣列組成，通過與光的相互作用，空間變化的光學(xué)響應(yīng)功能可以允許人們隨意地構(gòu)造光學(xué)波前［13］。

總結(jié)上述方法，基于光纖、基于超表面和軸棱錐法產(chǎn)生貝塞爾光束都有高精度的加工需求，基于環(huán)縫的方法對入射光能量利用率低，空間光調(diào)制器存在損傷閾值。相比之下軸棱錐結(jié)構(gòu)簡單，產(chǎn)生的貝塞爾光束穩(wěn)定性好，是目前用來產(chǎn)生貝塞爾光束最普遍的方法。除此之外生成貝塞爾光束的方法還有計算機(jī)全息圖法［14］、球差透鏡法［15］、諧振腔法［16］等。

在自由空間中，貝塞爾光束的平面波分量在傳播方向z上不會明顯失相，因此強(qiáng)度分布不會改變，而在散射介質(zhì)中傳輸時散射體將光場相位改變或能量吸收之后，光束依然能夠在之后恢復(fù)其初始的強(qiáng)度分布，這一現(xiàn)象稱為光束的自重構(gòu)特性。如圖3 所示光束在傳輸過程中被散射介質(zhì)（圖中陰影位置）阻擋，光束經(jīng)過一段傳輸后恢復(fù)到了初始的相位分布。2010年，F(xiàn)AHRBACH F O 等在三種折射介質(zhì)（包括玻璃球和人體皮膚）中驗證了光束的自重建特性，展示了具有自重構(gòu)光束（Microscopy with Self-Reconstructing Beams，MISERB）的顯微鏡原型，并表明全息形狀的掃描貝塞爾光束不僅減少了散射偽影，同時提高了混沌介質(zhì)中的圖像質(zhì)量和穿透深度［17］。在此研究基礎(chǔ)上FAHRBACH F O 采用空間光調(diào)制器結(jié)合線掃描光片顯微鏡，構(gòu)建了可用于標(biāo)準(zhǔn)倒置顯微鏡的附加模塊，通過對比不同光束照射的相同樣品區(qū)域的圖像，精確評估光束形狀和圖像質(zhì)量之間的相互關(guān)系。通過對各種散射介質(zhì)的測量，證明了貝塞爾光束通過非均勻介質(zhì)的優(yōu)越傳輸能力［18］。之后的文獻(xiàn)大量報道了貝塞爾光束在生物醫(yī)學(xué)顯微成像中的應(yīng)用。在此我們將對相關(guān)工作進(jìn)行綜述。

圖3 貝塞爾光束的自重構(gòu)特性Fig.3 Self-reconstructing properties of Bessel beams

2 在多光子熒光顯微成像技術(shù)中的應(yīng)用

多光子熒光顯微成像技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)顯微成像領(lǐng)域重要的、進(jìn)行體積成像常用的成像方式，廣義上講包括基于單光子效應(yīng)的共聚焦熒光顯微成像、雙光子熒光顯微成像、三光子熒光顯微成像。利用貝塞爾光束的無衍射特性，可以實現(xiàn)擴(kuò)展景深的多光子熒光顯微成像，在此基礎(chǔ)上還可以改變探測方式實現(xiàn)快速成像；利用貝塞爾光束的自重構(gòu)特性，可以激發(fā)更深層組織中的信號，實現(xiàn)大深度成像；貝塞爾光束具有更細(xì)的聚焦中心束，基于此可提升熒光顯微成像的橫向分辨率。貝塞爾光束的旁瓣會造成非成像區(qū)域的照明和激發(fā)，這會降低圖像信噪比，但是多光子熒光顯微成像技術(shù)在光子數(shù)大于1 時主要利用非線性光學(xué)效應(yīng)，對單位面積的激發(fā)光強(qiáng)度有一定的需求，這就能夠在一定的程度上避免在基于貝塞爾光束的多光子顯微鏡中旁瓣效應(yīng)的影響［19-20］，除此之外，本文還將討論其他解決貝塞爾旁瓣問題的方案。

2.1 基于無衍射特性的擴(kuò)展景深成像

熒光顯微成像技術(shù)的景深取決于聚焦激發(fā)光束的瑞利距離。瑞利距離是通過計算聚焦激光場面積加倍的距離來表征高斯激光束的擴(kuò)展和發(fā)散，表示為

式中，λ為激光波長，ω0為光束束腰直徑。當(dāng)使用高數(shù)值孔徑顯微鏡物鏡時，光束的束腰直徑很小，聚焦光束的瑞利距離范圍只有幾個微米，而無衍射貝塞爾光束則可以保持光場橫向尺寸不變的情況下有較長的聚焦距離。

將貝塞爾光束與多光子顯微成像技術(shù)相結(jié)合，可以拓展激發(fā)光束的聚焦體積，實現(xiàn)基于多光子熒光效應(yīng)的快速體積成像，如圖4 所示。例如，YANG Y L 等報道了一種雙光子激光掃描立體顯微鏡［21］，將貝塞爾光束集成于傳統(tǒng)雙光子熒光顯微鏡，利用貝塞爾光束拓展景深實現(xiàn)快速體積成像。系統(tǒng)通過獲取具有視差的兩個視角的圖像實現(xiàn)深度的感知，因此只需要從不同角度掃描兩幅圖像，體積成像速度大大提高。系統(tǒng)獲取的體積圖像能夠在三維監(jiān)視器上實時立體顯示，對于稀疏且特征豐富的樣本能夠利用立體匹配算法恢復(fù)深度信息。LU R 等基于軸錐實現(xiàn)了貝塞爾光束模塊，并輕松集成到現(xiàn)有的雙光子熒光顯微鏡中［22］，簡單地沿光軸平移其中一個中繼透鏡，即可連續(xù)調(diào)整貝塞爾聚焦的軸向長度，使用該模塊可同時監(jiān)測斑馬魚幼體中延伸超過60 μm 深度的脊髓投射神經(jīng)元的活動，體積率為50 Hz，且成像體積的軸向范圍可調(diào)。CHEN W等報道了使用自適應(yīng)光學(xué)像差矯正的貝塞爾光束聚焦雙光子熒光顯微鏡［23］，通過開發(fā)的自適應(yīng)光學(xué)方法，在物鏡焦平面上矯正貝塞爾光束聚焦的畸變波前，使系統(tǒng)恢復(fù)到衍射極限的成像性能，在深度成像上實現(xiàn)高時間分辨率和高空間分辨率。系統(tǒng)應(yīng)用于500 μm 深度的斑馬魚幼體和小鼠大腦體積成像，在體突觸結(jié)構(gòu)和功能測量的靈敏度和分辨率有了顯著提高。RODRIGUEZ C 等將貝塞爾光束的焦深軸向擴(kuò)展能力應(yīng)用到三光子熒光顯微成像技術(shù)中［20］，使用基于軸棱錐的模塊生成不同數(shù)值孔徑和軸向長度的貝塞爾光束，并將此體積成像工具應(yīng)用于小鼠腦切片成像和活體小鼠腦成像。利用貝塞爾光束的無衍射特性實現(xiàn)擴(kuò)展景深的多光子熒光顯微成像的典型結(jié)果如圖4（a）所示。

圖4 貝塞爾光束在多光子熒光顯微成像技術(shù)中的典型應(yīng)用結(jié)果Fig.4 Representative results of applying Bessel beam to multiphoton fluorescence microscopy

2.2 基于自重構(gòu)特性的大深度成像

貝塞爾光束的另一個重要特點是遇到障礙物后的自重構(gòu)特性，基于該特性能夠保障聚焦光束在散射介質(zhì)深處的傳輸和激發(fā)有效信號。ZHENG J J 等在角譜法框架下通過分塊衍射傳輸模型模擬了雙光子激發(fā)熒光體積成像過程，驗證了貝塞爾光束的自重構(gòu)特性能夠穿透散射介質(zhì)，同時可以在單個光柵掃描中成像感興趣的體積，同時雙光子的非線性效應(yīng)能夠有效消除貝塞爾光束旁瓣產(chǎn)生的偽信號［19］。利用貝塞爾光束的自重構(gòu)特性，研究者們實現(xiàn)了大深度的多光子熒光顯微成像。例如，PURNAPATRA S B 等使用特殊設(shè)計的物鏡，生成了具有大穿透深度的類貝塞爾無衍射光束，在單光子熒光顯微成像中系統(tǒng)穿透深度達(dá)到了650 μm［24］。雙軸共焦（Dual-Axis Confocal，DAC）顯微鏡通過離軸和低數(shù)值孔徑的照明和收集方式獲取更好空間濾波和光學(xué)切片性能，要求光束在焦點處精確相交。當(dāng)用于具有折射不均勻性的生物組織時，由于光束折射和畸變會導(dǎo)致空間分辨率下降，而CHEN Y等報道了基于貝塞爾光束的DAC 顯微鏡相比高斯光束DAC 顯微鏡在微觀組織異質(zhì)性方面成像的分辨率退化更小［25］，成像系統(tǒng)如圖5 所示。

圖5 基于貝塞爾光束的雙軸共焦顯微鏡示意圖［25］Fig.5 Schematic of Bessel beams based dual-axis confocal microscope［25］

CHEN B Y 等報道了結(jié)合貝塞爾光的三光子熒光顯微鏡將小鼠大腦的高分辨率無創(chuàng)功能成像深度擴(kuò)展到1.0 mm 以上［26］。ANTONACCI G 等證明了貝塞爾光束在混沌介質(zhì)中的三維成像能力［27］。在該研究中，無衍射自愈三維單色光斑能夠深入樣品體積，抵抗混濁環(huán)境中的偏轉(zhuǎn)，并提供與高斯光束相當(dāng)?shù)妮S向分辨率；與衍射受限光束相比，由貝塞爾光束相干混合形成的光場，即使在混濁的牛奶溶液中，其無畸變穿透能力也增加了十倍以上；在熒光成像方案中，與衍射受限光束相比，圖像對比度增加了十倍，即使經(jīng)過四個瑞利長度，空間分辨率也保持不變［27］。利用貝塞爾光束的自重構(gòu)特性實現(xiàn)大深度的多光子熒光顯微成像的典型結(jié)果如圖4（b）所示。

2.3 基于更細(xì)聚焦光束的高分辨率成像

在相同的聚焦條件下，貝塞爾光束的中心瓣直徑要比高斯光束細(xì)，這就為提升系統(tǒng)空間分辨率帶來了機(jī)會。2013年，SNOEYINK C 等首先報道了基于貝塞爾光束的顯微鏡（Bessel Beam Microscopy，BBM），貝塞爾光束由置于光路中的軸棱錐產(chǎn)生，BBM 系統(tǒng)產(chǎn)生的點擴(kuò)散函數(shù)（Point Spread Function，PSF）峰值可以變窄，從而將基礎(chǔ)顯微鏡的分辨率提高38%［28］。此外，通過結(jié)合三維定位，光束整形，共焦檢測等方法可進(jìn)一步提升分辨率。CHAKRABORTY C 等使用貝塞爾光束顯微鏡在應(yīng)用相關(guān)光子計數(shù)下實現(xiàn)了低于10 nm 的定位精度［29］。HE H 等報道了通過使用多階貝塞爾光束增強(qiáng)了體積雙光子熒光顯微鏡在擴(kuò)展景深上的分辨率［30］。在該研究中，雙光子熒光顯微鏡中的等效掃描光束為細(xì)針狀光束，由針狀0 階光束與稻草狀1 階貝塞爾光束相減而產(chǎn)生；與0 階貝塞爾光束相比，其橫向分辨率提高了28.6%，并能夠在56 μm 的軸向深度上保持［30］。

SHEPPARD C 等將貝塞爾光束應(yīng)用到圖像掃描顯微鏡，用于提升該顯微鏡的空間分辨率［31］。圖像掃描顯微鏡基于共焦顯微技術(shù)，利用探測器陣列代替共焦針孔，圖像通過像素重新分配重建。陣列探測器能夠獲取大部分的熒光，在提升圖像信噪比的同時會使圖像分辨率變差。使用貝塞爾光束照明和小陣列探測器的圖像掃描顯微鏡，與傳統(tǒng)熒光顯微鏡相比，橫向分辨率（點擴(kuò)散函數(shù)的寬度）可以提高1.78 倍。該研究還探討了貝塞爾光束在雙光子或三光子熒光圖像掃描顯微鏡中的作用，圖像掃描顯微鏡的光學(xué)切片效應(yīng)與多光子顯微鏡的結(jié)合減少了樣品表面的背景，從而增加了穿透深度。在貝塞爾光束的加持下，雙光子圖像掃描顯微鏡的分辨率比非聚焦雙光子熒光顯微鏡的分辨率高1.85 倍，點擴(kuò)散函數(shù)的峰值提高2.84 倍；三光子圖像掃描顯微鏡的分辨率提高了2.10 倍，點擴(kuò)散函數(shù)的峰值是非聚焦三光子熒光的3.77 倍；基于貝塞爾光束的雙光子圖像掃描顯微鏡的分辨率比標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡的分辨率提高了2.13 倍。結(jié)合圖像掃描模式和貝塞爾光束，雙光子或三光子熒光顯微成像的軸向分辨率和光學(xué)切片能力也得到了改善［31］。利用貝塞爾光束的更細(xì)中心瓣直徑特性實現(xiàn)高分辨率的多光子熒光顯微成像的典型結(jié)果如圖4（c）所示。

2.4 貝塞爾光束旁瓣影響的消除

將貝塞爾光束應(yīng)用于多光子熒光顯微鏡時，主要依靠光束整形實現(xiàn)貝塞爾光束旁瓣的抑制，包括滴水法［32］和基于高階貝塞爾函數(shù)相減的方法［33］。HUA X 等采用滴水法可有效地抑制貝塞爾光束旁瓣，與傳統(tǒng)寬場顯微鏡相比，主瓣的分辨率提高了四到五倍，成像景深提高了四到五倍［32］。HE H 等通過強(qiáng)度和形狀匹配，以高階貝塞爾光束作為0 階的背景，在模擬和實驗中研究了不同聚焦條件下貝塞爾光束旁瓣引入的成像背景強(qiáng)度，通過相減的方式在50 μm 厚的小鼠腦切片上展示了旁瓣消除的性能，神經(jīng)元的對比度提高了2.7 dB。這種背景消除技術(shù)為提高雙光子熒光體積成像對比度提供了一種簡單而通用的工具，在追求更好橫向分辨率的高數(shù)值孔徑情況下尤其重要［33］。利用高階貝塞爾函數(shù)相減的方法消除旁瓣影響的典型結(jié)果如圖4（d）所示。

3 在光片熒光顯微成像技術(shù)中的應(yīng)用

點掃描來獲取樣本三維高分辨率信息的成像方式會限制成像速度，同時成像過程中照明光束穿過樣本的整個厚度，會對樣本造成嚴(yán)重的光毒性，對熒光團(tuán)造成光漂白，這使得多光子熒光顯微成像技術(shù)不適用于大樣本的高速成像。光片熒光顯微鏡將照明和探測光路垂直方向設(shè)置，是具有低光毒性的有效切片成像方式，成像時使用線掃描和面掃描也使其具備高速成像的條件。目前光片顯微成像技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞成像、腦成像、發(fā)育生物學(xué)成像。

光片熒光顯微成像中，激發(fā)光片在檢測目標(biāo)光軸方向需要足夠薄以確保消除離焦激發(fā)，而在橫向尺寸上又要求它能足夠長，可以提供更大的成像視野。這對于傳統(tǒng)基于高斯光束的光片熒光顯微鏡來說是相互矛盾的，較薄的高斯光束傳播的距離較短；對于厚度接近波長衍射極限的二維高斯光束光片，其傳播長度小于幾個波長。貝塞爾光束作為具有自重構(gòu)特性的無衍射光束，在光片熒光顯微成像中發(fā)揮出了巨大的優(yōu)勢。兩種光片的應(yīng)用對比如圖6 所示，圖像顯示了用于大視場成像的高斯光片和貝塞爾光片［34］?；谪惾麪柟馐墓馄瑹晒怙@微成像技術(shù)在生物顯微成像領(lǐng)域發(fā)揮出巨大的優(yōu)勢，但是貝塞爾光束具有很強(qiáng)的旁瓣效應(yīng)，旁瓣照明會從相鄰組織產(chǎn)生不利的生物熒光。通過抑制旁瓣的激發(fā)能夠提升圖像信噪比，有些情況下還能提升軸向分辨率。

圖6 貝塞爾光片與高斯光片的對比［34］Fig.6 Comparison of Bessel beam and Gaussian beam-based light-sheet［34］

3.1 具有更大視場的貝塞爾光片

許多應(yīng)用領(lǐng)域迫切需要具有大視場的光片。在發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，LUNA-PALACIOS Y Y 等介紹了貝塞爾光束用于大視場成像的優(yōu)點和高斯光束用于多色成像的缺點［34］。多重貝塞爾激勵可以最大限度地減小由于光束色度散焦而導(dǎo)致的景深失配效應(yīng)，并減輕由多重高斯光束產(chǎn)生的模糊干擾，它還提供了一個具有各向均勻的軸向分辨率和更大有效視場上的光學(xué)切片。對大孢鏈霉菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動力學(xué)研究證明了這種優(yōu)勢［34］，典型成像結(jié)果如圖7（a）所示，圖中對比基于高斯光束的數(shù)字掃描光片顯微鏡，基于貝塞爾光束的數(shù)字掃描光片顯微鏡能夠覆蓋更大的視野并且在整個成像視野內(nèi)保持了與高斯光束相當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)軸向分辨率；在使用高倍物鏡情況下（圖7（a）第二行），高斯光束衍射會導(dǎo)致光片扭曲而貝塞爾光束則弱化了這一問題。LIU Chi 等報道了基于貝塞爾光束的病理切片全切片成像系統(tǒng)，使用貝塞爾光束激發(fā)，擴(kuò)展的焦深不僅可以一次成像獲取全軸向信息，而且還可以緩解樣品對準(zhǔn)的要求［35］。在雙光子激發(fā)的光片顯微鏡中，TAKANEZAW S 等設(shè)計了一個軸棱錐和兩個透鏡組成的照明光學(xué)系統(tǒng)，能夠修改光束形狀從而拉伸貝塞爾光束的傳輸長度［36］。在10×物鏡下，該方法能夠獲得束腰小于4 μm，長度在600～1 000 μm 的光片，該方法不影響檢測物鏡聚焦深度內(nèi)的激發(fā)限制?；诖讼到y(tǒng)對青鳉魚胚胎高速、長期的成像觀測展示了該雙光子光片系統(tǒng)在多細(xì)胞生物大視野、快速和長期方面廣泛的應(yīng)用前景。

圖7 貝塞爾光束在光片熒光顯微成像技術(shù)中的典型應(yīng)用結(jié)果Fig.7 Representative results of applying Bessel beam to light-sheet fluorescence microscopy

3.2 具有更高分辨率的貝塞爾光片

想要獲得更高的分辨率，則需要更薄的光片。已有研究將貝塞爾光束與選擇性照明、結(jié)構(gòu)光照明等方法相結(jié)合，用于光片熒光顯微鏡的分辨率提升。2011年，PLANCHON T A 等報道了用于活細(xì)胞成像的三維各向同性選擇性照明顯微鏡，其將貝塞爾光束與結(jié)構(gòu)光照明和雙光子激發(fā)相結(jié)合，創(chuàng)建出了厚度小于0.5 μm 的光片，能夠以0.3 μm 的三維各向同性分辨率、200 幀每秒的速度進(jìn)行亞細(xì)胞成像［37］。GAO L 等報道了通過將掃描貝塞爾光束產(chǎn)生的超薄平面光與結(jié)構(gòu)光照明超分辨率顯微鏡相結(jié)合，使其超越衍射極限，實現(xiàn)了在多個時間點對厚或密集熒光活體樣品進(jìn)行快速三維動力學(xué)研究；以此為基礎(chǔ)證明了有絲分裂期間染色體的活體核型分析，并確定了成纖維細(xì)胞背側(cè)和腹側(cè)表面肌動蛋白細(xì)胞骨架的不同動力學(xué)特性。與共聚焦熒光顯微鏡相比，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速成像，降低了光損傷，提高了深度對比度和分辨率［38-39］。圖7（b）對比了貝塞爾光束光片顯微成像（7（b）左圖）與貝塞爾光束3D 超分辨結(jié)構(gòu)光照明顯微成像（7（b）右圖）對固定LLC-PK1 細(xì)胞中微管的成像結(jié)果，貝塞爾光束3D 超分辨結(jié)構(gòu)光照明顯微成像具有更好的信噪比，同時得到的圖像中微管的厚度和強(qiáng)度也更加均勻［38］。ZHAO T 等展示了一種使用線形光束和環(huán)形濾波器生成任意顏色的超薄貝塞爾光片的方法，利用這項穩(wěn)健且經(jīng)濟(jì)高效的技術(shù)，獲得了橫向分辨率250 nm 和軸向分辨率400 nm 的生物樣品雙色三維圖像，以及1 Hz 時間分辨率下20 μm 大小活體樣品的高速三維體積成像［40］。KOBELE L 等報道了通過結(jié)合相位整形、熒光團(tuán)切換和熒光動態(tài)阻斷三個物理概念，使有效光片變薄，從而提高光片熒光顯微鏡的分辨率和對比度的方法［41］。

3.3 用于更大穿透深度的貝塞爾光片

2012年，F(xiàn)AHRBACH F O 等報道了在厚介質(zhì)（如細(xì)胞團(tuán)、胚胎、皮膚、腦組織和植物）中，具有自重構(gòu)特性的貝塞爾光片在深層組織的成像能力：基于共焦線檢測原理，相比于高斯光片，貝塞爾光片不僅具有穿透深度，在軸向分辨率上也有一倍的提升［42］。圖7（c）是在共焦線檢測模式下，分別使用高斯光片和貝塞爾光片照明獲得的果蠅卵室的熒光圖像，使用貝塞爾光片獲得了更好的對比度，在高穿透深度下，能夠顯示出更多的細(xì)節(jié)。2013年，研究人員報道了一種分段貝塞爾光片，通過阻擋相反的部分來產(chǎn)生光束的角譜。結(jié)合共焦線檢測，光片的光學(xué)切片性能可與照明光束的景深分離。實驗結(jié)果證明分段貝塞爾光片表現(xiàn)出良好的自重建能力和穿透深度，在腫瘤多細(xì)胞球體成像中提升了對比度，這對于在光片熒光顯微鏡中研究大型強(qiáng)散射樣品非常有利［43］。除此之外，還有在單物鏡傾斜光片雙光子掃描顯微鏡中使用貝塞爾光束改善光片受散射的限制［44］以及流式細(xì)胞儀中通過貝塞爾光片增強(qiáng)光子密度和橫截面積［45］的報道。

3.4 貝塞爾光片旁瓣干擾的消除

在貝塞爾光片熒光顯微鏡中，也有很多學(xué)者研究貝塞爾光束的旁瓣干擾消除問題。目前的解決方法可以分為從照明光束改進(jìn)和從探測方式改進(jìn)兩個方面，具體包含以下幾種方式。

在照明光束改進(jìn)方面，通過使用激發(fā)光束整形方法［46］，在強(qiáng)散射介質(zhì)中使用受激發(fā)射損耗抑制來自環(huán)形系統(tǒng)的熒光［47］，使用互補(bǔ)光束重復(fù)掃描法［48-50］，以及結(jié)合深度學(xué)習(xí)方法提升圖像質(zhì)量的互補(bǔ)光束相減法［51］。BAI Chen 等報道了互補(bǔ)光束相減（Complementary Beam Subtraction，CBS）方法，通過對貝塞爾光束和互補(bǔ)光束進(jìn)行雙掃描后相減，減少失焦背景，提高光片熒光顯微鏡的軸向分辨率［50-51］。在雙重掃描和減法操作期間，為了解決系統(tǒng)不穩(wěn)定導(dǎo)致的模糊和噪聲導(dǎo)致的圖像質(zhì)量顯著降低問題，研究人員提出了一種壓縮盲反卷積和去噪方法，基于微球和模式生物的實驗驗證了該方法的有效性，與CBS 光片法相比，該方法的軸向和橫向分辨率分別提高了約1.81 倍和2.22 倍，平均信噪比提高了約3 dB［50］。同一時期，一種基于深度學(xué)習(xí)的光片熒光顯微成像方法被提出，該方法通過單次掃描可以直接從傳統(tǒng)的貝塞爾光片重建高質(zhì)量圖像，在確保圖像質(zhì)量的同時圖像重建速度提升了約100 倍。因此，該方法通過減少掃描行為和重建時間，可以顯著提高系統(tǒng)的實用性［51］。

在探測方式改進(jìn)方面，主要有共焦探測方法［52］，以及掃描同步探測方法［53］。DEAN K M 等報道了使用二維活性像素陣列與掃描光片同步，以有效抑制失焦熒光。由于其光束掃描幾何形狀，該技術(shù)被稱為軸向掃描光學(xué)薄片顯微鏡（Axially Swept Light Sheet Microscopy，ASLM），能夠在216 μm×216 μm×100 μm 的體積實現(xiàn)390 nm 的各向同性分辨率［53］。圖7（d）是該系統(tǒng)對膠原嵌入的RPE-1 細(xì)胞群的微管和波形蛋白長期同步雙激發(fā)雙發(fā)射體積成像的結(jié)果，證明了該系統(tǒng)在復(fù)雜三維微環(huán)境中對遷移細(xì)胞的同時雙色、高對比度和高動態(tài)范圍延時成像能力。

此外，還有結(jié)合多個策略進(jìn)行貝塞爾光片旁瓣干擾的消除，例如結(jié)合受激輻射耗盡［54］、雙光子激發(fā)［55］、人工智能生成超透鏡等方法也能取得良好的效果［56］。DENG S H 等利用貝塞爾光束將受激輻射損耗與數(shù)字掃描光片顯微鏡集成，可實現(xiàn)快速、高分辨率和大視場成像。由于空心高斯耗盡光束在焦平面周圍軸向分布受限的優(yōu)點，貝塞爾激發(fā)模式外圍的熒光信號被受激輻射耗盡，實現(xiàn)了具有抑制旁瓣的超分辨光片，結(jié)果表明使用貝塞爾光束作為激發(fā)光和空心高斯光束作為耗盡光可以提高系統(tǒng)的軸向分辨率和圖像對比度［54］。

4 在相干拉曼顯微成像技術(shù)中的應(yīng)用

拉曼光譜技術(shù)以光子的非彈性散射為基礎(chǔ)，具有非侵入、非標(biāo)記、指紋譜等優(yōu)點，作為一種分析工具被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域。基于自發(fā)拉曼效應(yīng)的拉曼顯微成像技術(shù)，由于自發(fā)拉曼散射效應(yīng)的微弱性，受限于成像速度而在生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用中的進(jìn)展緩慢。近年來基于非線性光學(xué)效應(yīng)的相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）與受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）顯微成像技術(shù)已帶來重要的突破，顯著提升了拉曼信號的強(qiáng)度以及無標(biāo)記成像的速度。然而，高斯光束有限的焦深限制了其在這一方面的發(fā)展，而貝塞爾光束應(yīng)用在這些領(lǐng)域也已經(jīng)取得了不錯的成果

4.1 基于貝塞爾光束的相干反斯托克斯拉曼散射顯微成像技術(shù)

相干反斯托克斯拉曼散射顯微鏡是一種基于非線性光學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)微弱拉曼信號的無標(biāo)記顯微成像技術(shù)，相比于信號微弱的自發(fā)拉曼散射，當(dāng)泵浦光和斯托克斯光間的能量差恰好等于分子振動能級時其信號強(qiáng)度可增強(qiáng)3～5 個數(shù)量級，從而實現(xiàn)活細(xì)胞和組織的無標(biāo)記快速成像。目前實驗室的CARS 成像系統(tǒng)多采用高斯光束作為泵浦和斯托克斯激發(fā)源，受限于具有緊聚焦特性的高斯光束，其成像軸向分辨率和成像焦深具有一定的限制。

2015年，HEUKE S 等報道了基于貝塞爾光束的相干反斯托克斯拉曼散射顯微鏡，使用貝塞爾光束可提升CARS 顯微鏡的橫向分辨率，數(shù)值模擬結(jié)果顯示橫向分辨率提升了1.33 倍；在傳統(tǒng)的高斯光束CARS 顯微鏡中增加軸棱錐和透鏡組，實現(xiàn)了貝塞爾光束的轉(zhuǎn)化，證明了分辨率改進(jìn)效果［57］。利用貝塞爾光束提升CARS 顯微鏡橫向分辨率的典型結(jié)果如圖8（a）所示。此外，該團(tuán)隊還報道了用于多層軸向樣本成像的貝塞爾光束CARS 顯微成像系統(tǒng)。在該項研究中，研究人員提出了一種僅使用無源光學(xué)元件產(chǎn)生貝塞爾光束來激發(fā)產(chǎn)生CARS 信號的實驗實現(xiàn)方案，結(jié)果表明結(jié)合CARS 過程非線性與折疊式照明幾何結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了從均勻樣品到兩倍于泵浦電場波的空間采樣頻率的連續(xù)相位匹配，最后根據(jù)數(shù)值模擬的反斯托克斯遠(yuǎn)場輻射模式的模量和相位，證明了重建軸向分層樣品的目標(biāo)［58］。2018年，MASIA F 等報道了一種融合稀疏采樣和貝塞爾光束的高光譜CARS 顯微鏡，能夠?qū)崿F(xiàn)高內(nèi)涵、高通量、無標(biāo)記的定量化學(xué)成像。在這項工作中，將化學(xué)特異性高光譜相干反斯托克斯拉曼散射顯微鏡與稀疏采樣、貝塞爾光束照明相結(jié)合，展示了一個具有巨大應(yīng)用潛力的無標(biāo)記成像平臺［59］。

圖8 貝塞爾光束在相干拉曼顯微成像技術(shù)中的典型應(yīng)用結(jié)果Fig.8 Representative results of applying Bessel beam to coherent Raman microscopy

4.2 基于貝塞爾光束的受激拉曼散射顯微成像技術(shù)

受激拉曼散射顯微成像技術(shù)具有對特定化學(xué)鍵的無創(chuàng)成像能力，近年來越來越多地應(yīng)用于生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。相較CARS，SRS 無非共振背景影響、不需要相位匹配條件，逐漸發(fā)展成為實時檢測生物樣品研究代謝小分子的重要工具。傳統(tǒng)的SRS 顯微鏡使用兩個脈沖高斯光束，可提供高橫向和軸向空間分辨率。由于高斯光束的緊密聚焦特性，導(dǎo)致SRS 顯微鏡很難用于散射組織中深層目標(biāo)的檢測成像?；谪惾麪柟馐腟RS 顯微鏡可以在一定程度上解決這一問題。

2017年，CHEN Xueli 等報道了可用于三維樣本無標(biāo)記容積化學(xué)成像的基于貝塞爾光束的受激拉曼投影（Stimulated Raman Projection，SRP）顯微鏡，能夠?qū)崿F(xiàn)對三維體積樣本的容積化學(xué)成像，從而全面了解三維復(fù)雜分子組分信息。SRP 顯微鏡通過二維橫向掃描快速定量三維體積中的化學(xué)組分。此外，結(jié)合SRP 和樣品旋轉(zhuǎn)斷層策略，建立了SRP 斷層掃描顯微鏡，它可以以光學(xué)分辨的空間分辨率、比基于高斯光束的切片掃描成像技術(shù)更高的速度獲取體積樣本化學(xué)組分的三維空間分布［60］。隨后該課題組基于稀疏采樣策略對投影斷層成像的重建算法進(jìn)行了加速，提出了基于稀疏采樣原理的迭代重建方法和基于深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)的稀疏重建算法，可將投影斷層重建所需的投影圖像數(shù)量分別從180 降低到30 和10 個以內(nèi)，從而SRP 斷層掃描成像的速度提升1 個數(shù)量級以上［61-62］。利用貝塞爾光束實現(xiàn)SRP 斷層掃描成像的典型結(jié)果如圖8（b）所示。

貝塞爾光束的自重構(gòu)特性使其在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)顯微成像中具有抗散射的能力和應(yīng)用潛力。為了探討貝塞爾光束的自重構(gòu)特性應(yīng)用于散射介質(zhì)中組分的受激拉曼散射顯微成像的情況，CHEN Xueli 等分別在2020、2021年仿真驗證了基于自重構(gòu)貝塞爾光束的受激拉曼散射顯微成像在散射介質(zhì)中信號產(chǎn)生和傳輸?shù)膬?yōu)勢［63-64］。在該項研究中，使用光束傳輸方法結(jié)合SRS 信號激發(fā)模型模擬了貝塞爾光束的傳輸以及受激拉曼散射信號的產(chǎn)生和自重構(gòu)能力，設(shè)計系列仿真實驗研究添加散射粒子的大小、位置、數(shù)量和分布對SRS 信號產(chǎn)生的影響。此外，搭建的基于貝塞爾光束的SRS 顯微鏡進(jìn)行了初步的實驗探索，結(jié)果表明SRS 信號可以在散射介質(zhì)中的一定深度內(nèi)產(chǎn)生或恢復(fù)，并且這種信號受散射參數(shù)的影響很大［63］。在此基礎(chǔ)上，又通過折射率湍流的分形模型生成散射組織，模擬含有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的生物組織；通過在不同建模參數(shù)組織中傳輸和激發(fā)SRS 信號對比，顯示盡管建模參數(shù)對SRS 信號的產(chǎn)生影響很大，但基于貝塞爾光束的SRS 顯微成像技術(shù)可以在更深的散射組織中產(chǎn)生信號［64］。2022年，CHEN Xueli 等還將貝塞爾光束的自重構(gòu)特性應(yīng)用于散射介質(zhì)中組分的拉曼光譜檢測，利用貝塞爾光束的自重構(gòu)特性搭建了貝塞爾光束拉曼光譜儀，能夠提供比傳統(tǒng)高斯光束更大的檢測深度和更好的線性定量能力，在在體藥物評估方面取得重大進(jìn)展［65］。

除了上述研究之外，GONG L 等在2021年提出了一種新的無需z軸掃描的受激拉曼散射斷層掃描成像技術(shù)（Stimulated Raman Scattering Tomography，SRST），它通過使用與貝塞爾光束相關(guān)的光學(xué)拍頻技術(shù)（Optical Beating Technique，OBT）來實現(xiàn)具有亞細(xì)胞分辨率、更深穿透能力的無標(biāo)記容積化學(xué)成像。與傳統(tǒng)的SRS 顯微鏡相比，使用具有自重構(gòu)特性的貝塞爾光束的SRST 在高散射聚合物珠體模型中的成像深度至少提高了兩倍。該研究還證明了SRST 對各種成像目標(biāo)（例如拉曼活性晶體、植物細(xì)胞和生物組織）進(jìn)行更深層的無標(biāo)記容積成像的能力，并且貝塞爾光束-OBT 融合技術(shù)在SRST 中的光學(xué)切片能力可很容易地擴(kuò)展到幾乎任何其他非線性光學(xué)成像模式，用于生物與醫(yī)學(xué)系統(tǒng)中的深層組織的三維顯微成像［66］。

5 其他方面應(yīng)用

除了以上報道，貝塞爾光束在其他成像方式中也有著廣泛的探索和應(yīng)用，包括光學(xué)相干顯微成像［67-70］、光學(xué)相干彈性成像［71］、光聲成像［72-73］、二次諧波成像［74］、三次諧波成像［75］、傅里葉復(fù)用熒光壽命層析成像［76-77］等技術(shù)領(lǐng)域。

光學(xué)相干顯微成像（Optical Coherence Microscopy，OCM）具有無創(chuàng)三維成像的獨特優(yōu)勢，無需外源性標(biāo)記即可用于生物樣品的研究。然而，在傳統(tǒng)基于高斯光束的成像系統(tǒng)中，這種技術(shù)的成像深度受到聚焦深度和高橫向分辨率之間權(quán)衡的限制，并且組織散射的光會隨著深度的增加逐漸降低光學(xué)相干斷層掃描圖像的對比度。多焦貝塞爾光束光學(xué)相干層析成像（Multifocal Bessel Beam Optical Coherence Tomography，MBOCT）結(jié)合了貝塞爾光束OCT 和多焦OCT 的優(yōu)點，提高了成像深度［67］。CHEN Y 等報道了在OCM 中使用準(zhǔn)貝塞爾光束將聚焦深度拓展到100 μm，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)OCM 的三倍，同時對球面像差的不敏感性增強(qiáng)了該OCM 系統(tǒng)在三維生物成像中的應(yīng)用能力［70］。在光學(xué)相干彈性成像方面，F(xiàn)ANG Q 等引入貝塞爾光束，將微內(nèi)窺鏡下的超高分辨率光學(xué)相干彈性成像系統(tǒng)的成像景深拓展了4 倍［71］。

在光聲成像方面，SHI J 等報道了光學(xué)分辨光聲顯微鏡（Optical Resolution Photoacoustic Microscopy，OR-PAM）在體積成像方面被高斯光束的短焦深限制［72］，而無衍射貝塞爾光束可以提供長焦深，雖然存在旁瓣偽影問題，但使用基于松弛效應(yīng)的非線性方法可以抑制光聲成像中的旁瓣。因此將貝塞爾光束引入到OR-PAM 中實現(xiàn)的貝塞爾光束OR-PAM 拓展了焦深，加快了體積成像的速度，在實驗中實現(xiàn)了1 mm 的焦深和7 μm 的橫向分辨率，并對碳纖維和紅細(xì)胞樣品進(jìn)行了體積成像［72］。JIANG Bowen 等研制了一種反射模式貝塞爾光束光聲顯微鏡（Bessel-Beam Photoacoustic Microscope，BB-PAM），提供擴(kuò)展景深，用于腦毛細(xì)血管的活體成像［73］。與高斯光束相比，貝塞爾光束的無衍射特性意味著PAM 的自由度更大。在該BB-PAM 系統(tǒng)中，采用軸棱錐和環(huán)形掩模產(chǎn)生貝塞爾光束，獲得的系統(tǒng)橫向分辨率為1.6 μm，自由度測量為483 μm，并通過碳纖維網(wǎng)絡(luò)的成像驗證了這一點；該BB-PAM 的自由度約為傳統(tǒng)高斯光束PAM 的7 倍。基于該BB-PAM 對開顱小鼠的腦血管進(jìn)行了成像，證明了其體內(nèi)成像能力優(yōu)于高斯光束PAM［73］。

6 結(jié)論

伴隨著激光技術(shù)的發(fā)展，貝塞爾光束在生物醫(yī)學(xué)顯微成像技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用不斷取得新的進(jìn)展。貝塞爾光束的無衍射特性滿足了在三維生物樣本成像中看的范圍更廣、看的更清楚、看的更快的需求，貝塞爾光束的自重構(gòu)特性滿足了在散射樣本中看的更深需求。雖然貝塞爾光束的應(yīng)用無法滿足所有的成像需求，但是單一維度的進(jìn)步也會為生物醫(yī)學(xué)顯微成像技術(shù)領(lǐng)域打開一扇新的大門。

本文重點關(guān)注了貝塞爾光束在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)顯微成像技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用，眾多的研究表明，利用貝塞爾光束的無衍射特性和自重構(gòu)特性，一定程度上解決了生物醫(yī)學(xué)光學(xué)顯微成像技術(shù)的三維顯微成像擴(kuò)展景深問題以及散射粒子對光學(xué)顯微成像的影響，證明了貝塞爾光束在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)顯微成像技術(shù)領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。然而，貝塞爾光束的應(yīng)用也有一定的局限性。例如，貝塞爾光束的應(yīng)用會帶來旁瓣干擾問題，尤其是在線性成像技術(shù)中更為明顯；但是隨著各種旁瓣消除手段的實現(xiàn)，又帶來了更高的分辨率和信噪比。貝塞爾光束由于其光束分布特性，即激光能量將平均分布于中心瓣和旁瓣，造成與相同總能量的高斯光束相比，其中心瓣聚焦能量偏低，這可能會限制其部分應(yīng)用；但是這個問題可以通過提高激光能量來解決，而激光能量的提升由于旁瓣對能量的分配并不會造成光損傷。此外，貝塞爾光束自加速特性的應(yīng)用也是一個值得研究的課題，已經(jīng)有關(guān)于不衰減自加速貝塞爾光束的報道［77］。隨著技術(shù)的成熟，貝塞爾光束的應(yīng)用一定能夠讓顯微鏡看的更快、看的更清楚、看的更長久，基于貝塞爾光束的光學(xué)顯微鏡將帶領(lǐng)科研工作者探索生物微觀世界的無盡奧秘。