高效液相色譜法測定黃酒中苯甲酸含量的不確定度評定

苗 茜，張新中，彭 濤，劉笑笑

（蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，甘肅蘭州 730050）

黃酒以糯米、黍米等為原料，經(jīng)過蒸料，拌以麥曲或米曲，進(jìn)行糖化和發(fā)酵釀制而成[1]。黃酒以其濃郁的香氣、醇厚的風(fēng)味、豐富的氨基酸、有機(jī)酸和維生素而廣受消費(fèi)者喜愛。然而，一些商家選擇添加苯甲酸這一廣譜抗微生物試劑來達(dá)到減緩微生物繁殖、延長保存期限的目的[2]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定黃酒中不允許添加苯甲酸這一類防腐劑[3]。如果人們長期攝入過量的苯甲酸，會造成慢性苯中毒[4]，對人體造成嚴(yán)重?fù)p傷。通過黃酒中苯甲酸含量的不確定度的評定，分析不確定度來源，確定關(guān)鍵影響因素，不僅能夠保證黃酒中苯甲酸含量測定值的可靠性，也為提高實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測能力提供數(shù)據(jù)參考，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

樣品：市售黃酒一批（13%VOL）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：苯甲酸（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.50%）。

試劑：甲醇（默克化學(xué)試劑，色譜純）、乙酸銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑，分析純）。

儀器：高效液相色譜儀（島津LC-20A）；萬分之一電子天平（梅特勒，ME204）；渦旋振蕩器（IKA，vortex2）；超純水機(jī)（密理博，Milli-Q）；高速離心機(jī)（艾本德，5810R）；超聲提取儀（新芝，SB-800DT）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試樣樣品處理

精密稱取供試品（約2 g，精確至0.000 1 g）于50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，轉(zhuǎn)移至離心管中，3 900 r·min-1高速離心10 min，取上清液過0.22 μm水膜供液相色譜儀測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

苯甲酸儲備液配制：精密稱取對照品99.50%苯甲酸11.01 mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1.095 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

苯甲酸系列濃度溶液配制：準(zhǔn)確移取苯甲酸貯備液0 mL、0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL 和0.24 mL 于10 mL 容量瓶中，定容配制成0 μg·mL-1、1.095 μg·mL-1、2.190 μg·mL-1、4.380 μg·mL-1、8.760 μg·mL-1、17.520 μg·mL-1和26.280 μg·mL-1系列濃度溶液。

1.2.3 計算公式

樣品中苯甲酸含量按式（1）計算。

式中：X為計算得出的苯甲酸含量，mg·kg-1；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合出的樣品中苯甲酸含量，μg·mL-1；V為樣品定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g；F為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 樣品測定

稱取兩份黃酒樣品，稱樣量分別為2.119 1 g 和2.000 5 g，經(jīng)前處理后上液相色譜儀測定，通過色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中苯甲酸的濃度分別為1.541 μg·mL-1及1.740 μg·mL-1，求得樣品中苯甲酸的含量為0.036 36 g·kg-1和0.043 49 g·kg-1，苯甲酸含量平均值為0.039 92 g·kg-1。

2 不確定度來源分類與分析

根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2014）進(jìn)行分類，苯甲酸測定不確定度的來源主要有A類不確定度和B類不確定度。其中，測量結(jié)果重復(fù)性（n）屬于A 類不確定度；而樣品稱量（m）、樣品定容（V）、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制（s）、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（C）以及加標(biāo)回收率（rec）則屬于B 類不確定度[5-8]。

2.1 樣品稱量過程引入的不確定度urel(m)

（1）使用萬分之一天平（分辨率為0.1 mg）稱量0 ～50 g 時最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布，則不確定度：u1(d)==0.029mg，u1(m)== 0.29mg。

（2）供試品約5 g，取5 g 砝碼，重復(fù)稱重10 次，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 2 g，即1.2 mg。

樣品稱量的相對不確定度為urel(m)=

2.2 定容過程引入的不確定度urel(V)

（1）評定容量瓶配制溶液時的重復(fù)性帶來的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對50 mL A 級容量瓶定容并稱重10 次，根據(jù)重量數(shù)值求其標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.050 mL。

（2）標(biāo)定容量瓶帶來的標(biāo)準(zhǔn)偏差。50 mL A 級單標(biāo)線容量瓶允許誤差為±0.05 mL，按三角分布，則u1(r)== 0.021mL。

（3）由溫度效應(yīng)引入的不確定度。假設(shè)定容在（20±3）℃條件下進(jìn)行，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，u1(t)== 0.018mL。

樣品定容過程中引入的相對不確定度為

2.3 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(s)

2.3.1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量引入的不確定度

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量需使用分辨率為0.01 mg 的天平，當(dāng)稱樣量在0～5 g 時，允許誤差為±0.05 mg，按均勻分布，則不確定度為

（2）對照品稱樣量約10 mg，對10 mg 砝碼稱重10 次，根據(jù)10 次稱量值計算得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 012 g，即0.012 mg。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱重引入的相對不確定度為

2.3.3 配制苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液引入的不確定度

使用容量瓶（25 mL、10 mL）和單標(biāo)線移液管（5 mL、1 mL）來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（1）25 mL A 級容量瓶不確定度。容量瓶定容過程中允許誤差±0.03 mL，按三角分布，則u2(r)== 0.012mL。在（20±3）℃條件下進(jìn)行測量，則溫度引入的不確定度：

其實(shí)，這只是里根演說前測試麥克風(fēng)時的一句玩笑話。不過，當(dāng)這段言論傳至蘇聯(lián)后，蘇聯(lián)不僅發(fā)表公開聲明譴責(zé)里根，還一度向特種部隊司令部命令“進(jìn)入戰(zhàn)斗狀態(tài)”，美蘇險由此引發(fā)戰(zhàn)爭。

容量瓶重復(fù)性產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下。容量瓶中加水定容至刻度后稱重，重復(fù)10 次。根據(jù)測得重量值求得到其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 mL。

（2）10 mL A 級容量瓶不確定度。容量瓶定容過程中允許誤差±0.020 mL，按三角分布，則u3(r)== 0.008 2mL。在（20±3）℃條件下進(jìn)行測量，則溫度引入的不確定度：

容量瓶重復(fù)性產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下。容量瓶中加水定容至刻度后稱重，重復(fù)10 次。根據(jù)測得重量值求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.008 mL。

則標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）1 mL A 級單標(biāo)線移液管引入的不確定度。移液過程移液管允許誤差為±0.007 mL，按三角分布，則u1(y)== 0.002 9mL。在（20±3）℃條件下進(jìn)行測量，則溫度引入的不確定度：

移液管重復(fù)性產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下。移液管準(zhǔn)確移取純水后稱重，重復(fù)10 次。根據(jù)測得重量值求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 1 mL。

則標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（4）5 mL A 級單標(biāo)線移液管引入的不確定度。移液過程移液管允許誤差為±0.015 mL，按三角分布，則u2(y)== 0.006 1 mL。在（20±3）℃條件下進(jìn)行測量，則溫度引入的不確定度

移液管重復(fù)性產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下。移液管準(zhǔn)確移取純水后稱重，重復(fù)10 次。根據(jù)測得重量值求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 9 mL。

則標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（5）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中稀釋引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中，使用25 mL 和10 mL 容量瓶分別為2 次和6 次；5 mL 和1 mL 移液管分別為5次和6 次，則相對不確定度為

因此，標(biāo)準(zhǔn)使用溶液引入的不確定度

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線計算引入的不確定度urel(C)

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算公式為

本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=64 186.7X-2 803.74。

由表1 計算，可得標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度及響應(yīng)值如表1 所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度及響應(yīng)值

2.5 回收率引入的不確定度urel(rec)

由于樣品溶液不均勻或者實(shí)驗(yàn)過程造成樣品的污染等因素，不可能100%的加以回收，本方法的加標(biāo)回收率101%～103%，根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），b+=(103-100)%=3%，b-=(101-100)%=1%，則

2.6 重復(fù)測定6 次引入的不確定度urel(n)

表2 樣品獨(dú)立測定結(jié)果

2.7 總合成不確定度

表3 各組分相對不確定度

黃酒中苯甲酸含量為0.039 92 g·kg-1時，合成不確定度為0.039 92×0.042=0.001 7 g·kg-1，置信概率為95%時，k=2，擴(kuò)展相對不確定度為0.003 4 g·kg-1。即稱樣量約為5 g 時，苯甲酸測量結(jié)果為0.039 92 g·kg-1，擴(kuò)展不確定度為0.003 4 g·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

基于高效液相色譜技術(shù)測定黃酒中苯甲酸的含量，通過分析操作過程中每個環(huán)節(jié)引入不確定度，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合對結(jié)果的準(zhǔn)確性影響最大，苯甲酸加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法對結(jié)果影響較大。因此，在標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋混勻和樣品溶液轉(zhuǎn)移過程中不能有漏液和轉(zhuǎn)移不充分的情況，應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，注意細(xì)節(jié)操作，以保證回收率的穩(wěn)定。另外，應(yīng)選擇等級較高的標(biāo)準(zhǔn)品和量器（玻璃量器和移液器）來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度。測量時樣品濃度應(yīng)盡量在標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度中間區(qū)域，必要時可增加樣品的測定次數(shù)。通過分析和比較各個分量的相對不確定度，掌握影響真值的關(guān)鍵因素，不僅能有效提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，也為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。