那西肽提取工藝研究

閔江，婁燕，劉正光，王丹丹，趙才兵，梁景樂,2*

(1.山東勝利生物工程有限公司 山東濟(jì)寧 272000；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 北京 100095）

那西肽（Nosiheptide），又稱諾西肽，是由活躍鏈霉菌（Streptomyces actuosus）產(chǎn)生的，與Thiostrepton、Siomycin、Sporangiomycin、Thiopeptin、Althiomycin、Taitomycin 等 組 成 了一大類富含硫的多肽類抗生素，既能作為飼料添加劑，明顯促進(jìn)雞、豬的生長(zhǎng)，低濃度時(shí)可抑菌，高濃度時(shí)能殺菌，還具有抗病毒活性。

那西肽純品為黃色針狀晶體，屬于脂溶性抗生素，主要存在于菌體細(xì)胞內(nèi)，最有效的提取方法是有機(jī)溶劑萃取。韓正枝等發(fā)明了一種亞臨界水提取菌絲體中那西肽的方法，發(fā)酵液進(jìn)行過濾、亞臨界水進(jìn)行萃取，提取率達(dá)到93%以上，并未提及粗品含量。張春穎采用有機(jī)溶劑法、樹脂分離、乙醇和水混合沉淀提取分離得到那西肽粗品，并進(jìn)一步采用離子交換層析法分離純化，提取率不低于85.1%，生物效價(jià)不低于750U/mg。徐天華等以那西肽菌絲體為原料，采用四氫呋喃為提取溶劑，用中性氧化鋁進(jìn)行初步純化，經(jīng)高速逆流色譜純化，得到含量不低于95%的那西肽產(chǎn)品，回收率為86%。徐天華等采用大孔吸附樹脂對(duì)那西肽提取工藝進(jìn)行研究，比較8 種大孔吸附樹脂對(duì)那西肽粗品所含雜質(zhì)的吸附能力，經(jīng)混合樹脂純化后的那西肽產(chǎn)品為淡黃色粉末，純度最高可以達(dá)到99%。本文對(duì)那西肽提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在簡(jiǎn)化提取工藝路線，保證產(chǎn)品質(zhì)量，降低提取成本，提出切實(shí)可行的工業(yè)化生產(chǎn)方案。

1 材料與方法

1.1 原料

那西肽發(fā)酵液與那西肽對(duì)照品由山東勝利生物工程有限公司提供。

1.2 主要試劑

甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；四氫呋喃（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；丙酮（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二氯甲烷（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DMF（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC，J.T.Baker）；硫酸鋁（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 主要儀器

液相色譜儀Agilentl200（Agilent 公司，美國）；FW-100 型萬能粉碎機(jī)（上海楚定分析儀器有限公司）；JA31002 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限司）；KDM 型調(diào)熱電熱套（山東鄄城光明儀器有限公司）；Heidolph 4000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（海道夫，德國）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（鄭州長(zhǎng)盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；xutemp 型低溫恒溫液浴循環(huán)兩用槽（杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 那西肽干菌絲體制備將那西肽產(chǎn)生菌接入種子罐中，種子罐溫度為25～29℃，pH 6.8～7.2，經(jīng)過逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，按發(fā)酵罐體積20%的接種量接入發(fā)酵罐中，按發(fā)酵液與空氣的體積比為1:0.5～1:2 通氣，控制溫度為25～29℃進(jìn)行有氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中控制pH 6.8～7.2，發(fā)酵周期為240～260h，得那西肽發(fā)酵液；

向那西肽發(fā)酵液中加入絮凝劑硫酸鋁，攪拌60min，硫酸鋁加入量占那西肽發(fā)酵液體積總量的0.5%，得預(yù)處理后的那西肽發(fā)酵液，減壓過濾，真空干燥，得到那西肽干菌絲體；

1.4.2 那西肽提取工藝

1.4.3 那西肽效價(jià)的檢測(cè)

1）對(duì)照品溶液的制備。取那西肽對(duì)照品適量（約相當(dāng)于那西肽12.5mg），置25mL 容量瓶中，加適量DMF 使溶解，稀釋至刻度，制成儲(chǔ)備液。精密量取5mL 儲(chǔ)備液至50mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成約含0.05mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2）供試品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取那西肽菌絲體0.5g，置于50mL 棕色容量瓶中，加入0.05mol/L 磷酸緩沖液5mL，適量DMF，超聲處理20min，冷卻至室溫后，用DMF 定容。準(zhǔn)確移取此溶液1mL 置于10mL 容量瓶中，用甲醇定容，過濾，制得供試品溶液。

圖1 那西肽提取工藝流程圖

精確稱量那西肽純品0.05g，放入100mL 容量瓶中加入適量DMF 使溶解，稀釋至刻度，制成儲(chǔ)備液。精密量取5mL 儲(chǔ)備液至50mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成供試品溶液。

精確量取那西肽浸提液1mL，放入100mL 容量瓶中加入DMF 至刻度，制成儲(chǔ)備液。精密量取5mL 儲(chǔ)備液至50mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成供試品溶液。

3）色譜條件。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.025%磷酸水溶液（50:50）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為241nm，流速1mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 那西肽在不同溶劑中溶解能力

取適量那西肽菌絲體，在25℃條件下分別用四氫呋喃、90%四氫呋喃溶液、DMF、DMF：0.05mol/L 磷酸緩沖液=9:1、二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇=8:2、60%乙醇溶液、丙酮、液相檢測(cè)流動(dòng)相（乙腈：0.025%磷酸溶液=1:1）浸提。利用液相色譜檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見表1。可以看出，90%四氫呋喃溶液浸提那西肽菌絲體效果較好，優(yōu)于其他溶劑；并發(fā)現(xiàn)有水存在時(shí)，浸提效果優(yōu)于純?nèi)軇?，為進(jìn)一步考察不同濃度四氫呋喃、乙醇、丙酮的浸提效果，取適量那西肽菌絲體，在25℃條件下分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的四氫呋喃溶液、乙醇溶液、丙酮溶液浸提。利用液相色譜檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見表2、表3、表4。可以看出，70%四氫呋喃溶液浸提效果最好，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)70%四氫呋喃溶液濃縮時(shí)較慢，存在那西肽降解情況，綜合考慮，選用80%四氫呋喃溶液作為浸提溶劑。

表1 不同溶劑中那西肽溶解度

表2 不同濃度四氫呋喃溶液中那西肽溶解度

表3 不同濃度乙醇溶液中那西肽溶解度

表4 不同濃度丙酮溶液中那西肽溶解度

2.2 浸提pH 的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道那西肽在酸性及堿性條件下易水解，本文也進(jìn)行驗(yàn)證，取適量浸提液（pH 約為5.6），分別用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至2.5、4、6.5、7.0、8.0，結(jié)果顯示，浸提液效價(jià)有明顯降低，因此浸提時(shí)pH 不需調(diào)節(jié)。

表5 不同pH下70%甲醇溶液中那西肽溶解度

2.3 浸提溫度的選擇

取適量那西肽菌絲體，分別在25、35 和45℃條件下用80%四氫呋喃溶液一次浸提；檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見表6?？梢钥闯?，溫度越高，浸提效果較好。鑒于那西肽穩(wěn)定性較差，四氫呋喃沸點(diǎn)及閃點(diǎn)較低，不適宜加熱等因素，確定25℃（室溫）為浸提溫度。

表6 不同溫度下四氫呋喃溶液中那西肽溶解度

2.4 浸提時(shí)間的選擇

取適量那西肽菌絲體，在25℃條件下用80%四氫呋喃溶液浸提；分別在0.5、1 和2h 取樣檢測(cè)浸提液效價(jià)，結(jié)果見表7?？紤]到時(shí)間成本與浸提率，浸提時(shí)間可以選用1h。

表7 不同浸提時(shí)間下四氫呋喃溶液中那西肽溶解度

2.5 浸提料液比選擇

在25℃條件下，比較不同料液比（m/v）對(duì)浸提率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。考慮到溶劑套用情況、菌渣殘留、生產(chǎn)設(shè)備承受能力等情況，確定一次浸提料液比為1:7，二次浸提料液比為1:4。

表8 不同料液比對(duì)浸提率的影響

2.6 重結(jié)晶溶劑用量選擇

濃縮液降溫析出粗精粉含量約75%左右，需要四氫呋喃攪拌洗滌，考察了不同四氫呋喃用量（vm）洗滌粗精粉的效果，結(jié)果顯示（表9），四氫呋喃用量（vm）可控制在1.0左右。

表9 不同用量四氫呋喃對(duì)那西肽粗精粉質(zhì)量影響

3 結(jié)論

通過對(duì)浸提溶劑、浸提pH、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比、重結(jié)晶溶劑用量等單因素研究，確定了那西肽提取的最佳工藝：浸提溶劑為80%四氫呋喃溶液，浸提pH 為7.0，浸提溫度為25℃；兩次浸提時(shí)間都為1h；一次浸提料液比為1:7，二次浸提料液比為1:4；四氫呋喃用量（vm）為1.0 左右，可獲得含量高達(dá)95%的那西肽純品。相比較現(xiàn)有的大孔樹脂吸附、色譜提取、混合溶劑提取等那西肽的分離純化方法，此工藝的操作簡(jiǎn)單易行，只使用一種溶劑，對(duì)設(shè)備要求較低，另外此工藝穩(wěn)定可行，所用的溶劑均可回收利用，對(duì)環(huán)境污染較小，為工業(yè)化生產(chǎn)那西肽純品奠定基礎(chǔ)。