復方中草藥對豬附紅細胞體病的體外藥效研究

于水

（撫順市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊 遼寧撫順 113000）

1 附紅細胞體病

附紅細胞體病是附紅細胞體在動物血液中附著在紅細胞的表面或游離在血漿中，引起的一種人獸共患的傳染病。這種疾病在現(xiàn)在的世界環(huán)境都處處可見。近年來，人們通常使用廣譜抗生素來進行豬附紅細胞體病的防治，但治療效果并不佳，并具有一定的毒副作用，對廣大生豬養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟利益造成嚴重損失?？紤]到西藥的副作用，本次研究的就是相對安全的中草藥，因為中草藥對身體傷害小，人體吸收后會排出，即使殘留在身體里的藥物也基本沒有毒副作用。所以現(xiàn)在中草藥對防止和控制疾病的感染等狀況起到了很大的作用。

1.1 附紅細胞體病的致病機理

附紅細胞體病是由紅細胞凝集素作為媒介導致機體產(chǎn)生的溶血性貧血，或者由自身免疫力拮抗導致的自身免疫性引起的溶血性貧血，該病在急性發(fā)病期的貧血機制尚不完全清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，附紅細胞體會影響動物體的免疫功能，免疫功能的降低可以繼發(fā)其他多種疾病的感染。由附紅細胞體感染的動物，其臨床特征有時無明顯變化，感染后導致的免疫力下降，或在應激狀態(tài)下，感染率會上升，當感染程度達到一定量時，會造成附紅細胞體感染。被附紅細胞體感染后，在顯微鏡下可以觀察到細胞膜表面有很多突起，細胞膜的韌性就會變低，容易破碎，就會使隱蔽的抗原發(fā)生變化，導致被自身的免疫系統(tǒng)攻擊。

1.2 附紅細胞體病的臨床癥狀

高熱、貧血、黃疽等癥狀是豬附紅細胞體的主要臨床癥狀，當然對于不同的動物癥狀也有所不同。豬感染以后會在3～20d 發(fā)病，大概一周左右較為常見，有些報道說“時間短則幾天長則幾年，重癥者導致死亡”。附紅細胞體可以感染任何階段的豬，癥狀也有所不同，不過都會有些影響。最容易感染該病的是斷奶仔豬，閹割后幾周的仔豬極易感染。仔豬一般感染該病后發(fā)病很急，體溫迅速升高，最高可達到42℃；精神萎靡不振，食欲也隨之下降，嚴重導致食欲廢絕；另外呼吸系統(tǒng)也受影響，出現(xiàn)呼吸困難的現(xiàn)象；有的會出現(xiàn)黃疽；免疫系統(tǒng)機能下降，可見淋巴結(jié)腫大等癥狀。

1.3 附紅細胞體病的病理變化

附紅細胞體病的家畜通常出現(xiàn)發(fā)病發(fā)熱癥狀，在病畜身上采集血液，采集的血液表面會有一層血膜，血膜上會有明顯的凝血現(xiàn)象出現(xiàn)，觀察血液的顏色，如果血液偏暗，就說明該病可以引起動物貧血。這時可以測出血液中的血糖、血紅蛋白等變少，膽紅素葡萄糖梭基轉(zhuǎn)移酶的濃度也會馬上上升。把一頭死于急性病的豬進行剖檢，可以觀察到血液不是正常的黏稠狀，很稀薄，長時間放置沒有凝血現(xiàn)象或者血液凝固比正常時間長，皮膚和薄膜會出現(xiàn)發(fā)白的情況，嚴重的會出現(xiàn)黃染，淋巴結(jié)有不同程度的腫脹，肌肉膠樣浸潤；肝臟和脾臟質(zhì)地變松軟并且腫大。心臟外膜肉眼可見一些有小的出血點。脂肪也會出現(xiàn)黃染的情況，但是不明顯。肺水腫，腎臟也會有明顯的腫脹，而且變脆，皮、髓質(zhì)邊界不明顯，可以看到邊界有出血點；結(jié)腸、直腸薄膜上有潰瘍，如綠豆大小。骨髓液和腦脊液量增多。

2 材料與方法

2.1 材料

1）試驗藥材。藥材常山購買于亳州市真源堂藥業(yè)有限公司，駱駝蓬子、狼毒均購買于河北安國市冷背藥材有限公司。

2）主要試劑。化學分析純鹽酸，無水乙醇，氯仿，氨水，均來自遼東學院農(nóng)學院。

3）試驗儀器。主要儀器包括恒溫水浴鍋（HH-S1），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52），光學顯微鏡（CW0980T），電熱恒溫干燥箱（DHG202-0A）等。

4）豬附紅細胞體的陽性血液。從豬場選取有附紅細胞體傳染病癥狀的豬20 頭，例如病畜會有典型貧血、黃疸等癥狀出現(xiàn)，在病畜頸部取血20 份，每份約2mL，并在血液中加入抗凝血劑，以防止血凝。

2.2 方法

1）豬附紅細胞體陽性血液的檢驗與判斷方法。制備陽性血液涂片20 份，通過直接血液涂片鏡檢的方法，確認是否感染附紅細胞體，如果在鏡下有連續(xù)三個視野均發(fā)現(xiàn)有附紅細胞體感染的紅細胞，則判定該樣品為附紅細胞體陽性，并通過以上三個視野的陽性紅細胞計數(shù)計算感染率。公式如下：感染率=∑每個視野的陽性紅細胞數(shù)量/（200× 3）× 100%。

2）藥物提取物的制備。分別準確稱出駱駝篷子、狼毒、常山三種中草藥各50g，把駱駝篷子加入750mL 的85%的酒精中，再放于水浴鍋中進行蒸餾，共蒸餾三次，提取水浴鍋中蒸餾的產(chǎn)物；取駱駝蓬子50g，加入750mL 的85%乙醇，置于70℃恒溫水浴鍋中，蒸餾三次，取其提取物，并與乙醇合并，在一邊放置12h，之后進行過濾，收集烘干物。常山50g 也放進水浴鍋中提取3 次，每次用200mL 的乙醇之后過濾，收集烘干物質(zhì)。把狼毒50g 放入水浴鍋中蒸餾，之后過濾收集干物質(zhì)。將以上三種過濾后的干物質(zhì)收集，分別研磨成粉末。

3）體外藥敏實驗。將以上實驗所提取的駱駝蓬子、狼毒、常山、三種藥物的粉末，分別把它們配成4、2、1 和0.5mg/mL 的溶液，進行以下藥敏試驗。

然后取載玻片16 塊，分為4 組，每組分4 塊，A 組三塊的載玻片上放入豬附紅細胞的陽性血液，附紅細胞的陽性血液必須是在80%以上20μL，之后加入上面配置好的高中低四個劑量的駱駝孟子提取液，然后依次滴加以上配好的駱駝蓬子提取物藥液20μL，就是A 組的第一個加4mg/mL、第二個加2mg/mL、第三個加1mg/mL、第四個加0.5mg/mL，觀察其藥物不同濃度對附紅細胞的影響。B 組加入狼山的高中低四個濃度的溶液。C 組與以上駱駝篷子和狼山一樣。讓其混合后分別為常山和狼毒提取物藥液，滴加方法和用量與第一組相同。均勻混合后立刻放在油鏡下觀察紅細胞的狀態(tài)，觀察紅細胞表面是否附著在附紅體，從而判斷附紅細胞是否對此藥物敏感。D 組為對照組，不添加任何藥物，只加入0.9%的生理鹽水，以及感染率在80%以上的附紅細胞溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 豬附紅細胞體的陽性血液的觀察結(jié)果

1）由血滴片所判定出的結(jié)果是紅細胞沒有原來的立體規(guī)則形狀，變成現(xiàn)在的細胞邊緣不整齊，出現(xiàn)星芒或不規(guī)則的多邊形形狀。

2）血涂片判定出結(jié)果是紅細胞沒有原來立體的規(guī)則形狀，變成現(xiàn)在的細胞邊緣不整齊，甚至出現(xiàn)星芒狀或者是不規(guī)則的多邊形狀等。附紅體在紅細胞膜表面上多是單個的或者成團的存在，在油鏡下慢慢晃動載玻片，可以發(fā)現(xiàn)附紅體有一點折光度。在顯微鏡下觀察到紅細胞被感染的狀態(tài)，經(jīng)計算，感染率在80%以上的血涂片有九份，感染率在65%左右的有三份，感染率在20%的有兩份，血涂片全部感染，因此判斷出為陽性。

3）PCR 方法所判定出的結(jié)果也是陽性的，結(jié)果與前面兩種方法鏡檢結(jié)果相同。

3.2 體外藥敏的實驗結(jié)果

如表1 所示，通過藥敏實驗結(jié)果可以看出，不同劑量組的駱駝篷子、常山、狼毒這三種藥物的混合提取物，對附紅細胞體的作用也有所不同。而在下面幾組中看見，在高劑量的中草藥加入1min后，在顯微鏡下就可以看見附紅細胞從紅細胞的表面脫落；2min可見從紅細胞上脫落的附紅細胞體失去活性，不擺動；5min 后可以觀察到紅細胞恢復正常狀態(tài)，在同一視野計算附紅細胞體感染率為零。在中劑量的中草藥加入后5min，在顯微鏡下看見大部分的紅細胞都已經(jīng)恢復正常狀態(tài)，但還有一些紅細胞上還附著附紅細胞，在同一鏡下計算紅細胞的感染幾率為15%～30%。

表1 三種中草藥提取物對豬附紅細胞體體外藥敏試驗結(jié)果

4 結(jié)論

結(jié)果表明：草藥提取物的中高劑量組較敏感，低劑量組不敏感。