基于芯片篩選螺原體感染中華絨螯蟹血細(xì)胞的免疫microRNAs

歐江濤， 蔣啟程， 周刻焱， 柳 巧， 欒筱琪， 王資生， 張啟煥

(鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224051)

中華絨螯蟹()俗稱河蟹，是我國(guó)特有的優(yōu)質(zhì)淡水蝦蟹養(yǎng)殖品種之一，也是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹種，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。隨著中華絨螯蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化大規(guī)模高速發(fā)展，導(dǎo)致水體環(huán)境狀況急速惡化，病害頻發(fā)且愈發(fā)嚴(yán)重。其中，由螺原體引起的“顫抖病”在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中發(fā)生較為廣泛。中華絨螯蟹作為無(wú)脊椎動(dòng)物主要依賴其先天免疫(包括細(xì)胞和體液免疫)發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。目前，對(duì)于中華絨螯蟹細(xì)菌感染研究報(bào)道較多，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹應(yīng)對(duì)副溶血性弧菌()、金黃色葡萄球菌()和嗜水氣單胞菌()等細(xì)菌侵染的免疫反應(yīng)中，整合素(EsIntegrin)、C型凝集素(EsCTL1和EsCTL2)、L型凝集素(ERGIC-53和VIP36)等可作為識(shí)別受體參與宿主免疫防御；其中，、、等基因是重要的免疫調(diào)控因子，發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能。而關(guān)于它的分子調(diào)控機(jī)制，至今仍是研究熱點(diǎn)。

河蟹螺原體()屬于柔膜體綱(Mollicutes)蟲(chóng)原體目(Entomoplasmatales)螺原體科(Spiroplasmataceae)螺原體屬()。螺原體是上世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)，可廣泛寄生于無(wú)脊椎動(dòng)物中具有嚴(yán)重致病性的一類獨(dú)特微生物，其定植于宿主體內(nèi)，在長(zhǎng)期與宿主共存過(guò)程中，相互構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)不同精細(xì)調(diào)控細(xì)菌基因表達(dá)，以適應(yīng)不同的生存環(huán)境，并對(duì)不同宿主發(fā)揮毒性作用。螺原體為中華絨螯蟹的主要病原體之一，被侵染后死亡率可達(dá)100%，近年中華絨螯蟹螺原體致使中華絨螯蟹、南美白對(duì)蝦()、日本沼蝦()和克氏原螯蝦()等甲殼經(jīng)濟(jì)動(dòng)物暴發(fā)疫病發(fā)生大面積死亡，對(duì)我國(guó)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。中華絨螯蟹螺原體通過(guò)鰓或外殼感染河蟹，并在1～5 d內(nèi)增殖于其靶細(xì)胞-血淋巴細(xì)胞，5～10 d擴(kuò)散至全身器官及結(jié)締組織，最后在 10～15 d引起中華絨螯蟹附肢顫抖直至死亡。

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA分子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，它通過(guò)與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其長(zhǎng)度為19～25 nt，miRNA雖不能直接編碼蛋白質(zhì)，但miRNA在不同基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中具有重要作用。第一條miRNA被Lee等發(fā)現(xiàn)后，對(duì)于miRNA的研究引起了廣泛關(guān)注，miRNA在各種生命活動(dòng)中起重要調(diào)控作用，如生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、免疫代謝等。目前，miRNA研究方法主要有基因芯片、RNA-seq、Northern blotting和莖環(huán)qRT-PCR等。其中，微流體芯片高通量可靠檢測(cè)miRNAs的存在和差異表達(dá)情況，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物研究中已廣泛應(yīng)用。

當(dāng)前，利用微流體芯片技術(shù)系統(tǒng)鑒定與分析中華絨螯蟹螺原體感染血細(xì)胞的miRNA及其表達(dá)情況，至今仍未見(jiàn)報(bào)道。前期，筆者所在實(shí)驗(yàn)室以正常和感染螺原體中華絨螯蟹血細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，初步預(yù)測(cè)了血細(xì)胞免疫相關(guān)的miRNA。本研究在前期基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建中華絨螯蟹miRNA的特異微流體芯片，進(jìn)一步系統(tǒng)鑒定血細(xì)胞免疫相關(guān)miRNA并檢測(cè)其表達(dá)情況，對(duì)差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和功能聚類與通路分析，相關(guān)研究結(jié)果將為中華絨螯蟹該疫病的免疫防控和抗病育種提供分子信息。

1 材料與方法

1.1 螺原體感染中華絨螯蟹血細(xì)胞的樣品準(zhǔn)備

中華絨螯蟹購(gòu)于江蘇省南京市某養(yǎng)殖戶，(100±10) g共100只，在試驗(yàn)前放置于10 L帶有循環(huán)水、紫外滅菌、充氧及控溫系統(tǒng)(26～28 ℃)中培育，通過(guò)PCR技術(shù)及負(fù)染技術(shù)證實(shí)研究所用中華絨螯蟹為螺原體陰性。試驗(yàn)所用螺原體分離自患螺原體病的中華絨螯蟹，R2培養(yǎng)基中培育 48 h 備用。

2012年6月在南京師范大學(xué)將中華絨螯蟹分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，各50只，培養(yǎng)20 d備用；對(duì)照組注射100 μL R2培養(yǎng)基，試驗(yàn)組注射100 μL含螺原體(培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期)R2培養(yǎng)基。飼養(yǎng)溫度保持 28 ℃，間歇性供氧。抽取血液，采用Trizol提取法從血細(xì)胞中提取RNA，并對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.2 中華絨螯蟹微流體芯片構(gòu)建及差異表達(dá)檢測(cè)

由表1可知，基于miRBase中收錄的中華絨螯蟹、淡水枝角水蚤()、日本對(duì)蝦()、克氏原螯蝦()4種動(dòng)物共897條成熟miRNA序列作為本研究探針。采用Cy3染料標(biāo)記RNA樣品，可通過(guò)檢測(cè)分析Cy3的熒光強(qiáng)度來(lái)尋找2組樣品差異表達(dá)的miRNAs。

在總RNA質(zhì)檢通過(guò)后，進(jìn)入芯片試驗(yàn)階段，由LC Science參與完成。使用Array-Pro圖像分析軟件進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。首先，減除背景值，再使用LOWESS過(guò)濾進(jìn)行信號(hào)歸一化。衡量雜交結(jié)果可靠性的標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)值<0.5；(2)探針信號(hào)值大于3倍背景值與標(biāo)準(zhǔn)偏差的和。滿足以上2點(diǎn)為表達(dá)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

表1 中華絨螯蟹微流體芯片探針

1.3 差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)及其GO和KEGG功能富集分析

通過(guò)微流體芯片檢測(cè)，可獲得正常和感染螺原體中華絨螯蟹共同表達(dá)miRNA及兩者差異表達(dá)miRNA。為了解2組中華絨螯蟹差異miRNA功能，選用分析軟件“miRanda，PITA和TargetScan”進(jìn)行預(yù)測(cè)差異顯著miRNA的所有靶基因，結(jié)合三者預(yù)測(cè)結(jié)果，取交集，獲取共有靶基因。根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能分析，根據(jù)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行Pathway分類，而得到Path way分類。

1.4 莖環(huán)RT-qPCR驗(yàn)證

設(shè)計(jì)莖環(huán)引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR試驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)PCR程序?yàn)椋?2 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。RT-qPCR程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min 95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s 60 ℃ 15 s，39次循環(huán)。每個(gè)樣品均為3復(fù)孔，-為內(nèi)參基因，miRNA差異表達(dá)水平用2-ΔΔ方法計(jì)算。采用Primer 5.0 (ABI)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，共設(shè)計(jì)9對(duì)引物，引物序列見(jiàn)表2。

表2 miRNA的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹血細(xì)胞miRNA的芯片鑒定與表達(dá)分析

試驗(yàn)組和對(duì)照組各使用3張芯片進(jìn)行檢測(cè)，每張芯片都設(shè)計(jì)多重質(zhì)控探針，保證了樣品標(biāo)記和雜交試驗(yàn)的質(zhì)量控制。對(duì)于正常和感染中華絨螯蟹血細(xì)胞中不同miRNA，根據(jù)芯片所產(chǎn)生的不同反應(yīng)信號(hào)，通過(guò)分析這些芯片雜交信號(hào)值，選取Signal>200及<0.05為分析基準(zhǔn)，數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行-Test和Cluster分析。由圖1可知，6張芯片總共鑒定出中華絨螯蟹血細(xì)胞miRNA為303個(gè)，試驗(yàn)組和對(duì)照組共表達(dá)miRNA有48個(gè)，其中，有27個(gè)表達(dá)miRNA差異顯著(<0.05)，6個(gè)表達(dá)miRNA差異極顯著(<0.01)；在這些差異表達(dá)的miRNA中，12個(gè)miRNA顯著下調(diào)，15個(gè)miRNA顯著上調(diào)(<0.05)。

2.2 差異miRNA的靶基因預(yù)測(cè)、GO注釋和Pathway分類

由表3可知，通過(guò)利用3款分析軟件“miRanda、PITA和TargetScan”對(duì)差異顯著的27個(gè)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)合三者數(shù)據(jù)取交集，共得78個(gè)靶基因，預(yù)測(cè)靶基因大多數(shù)為各種蛋白和酶的基因，參與調(diào)節(jié)各種生命活動(dòng)，尤其是在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用的proPO、ALF-2、Peroxinectin、Relish免疫因子等。

表3 miRNA的預(yù)測(cè)靶基因

由圖2-A可知，對(duì)預(yù)測(cè)到的78個(gè)靶基因進(jìn)行GO注釋，共有116個(gè)GO通路被注釋，明顯富集于24個(gè)GO，包括：蛋白水解、cAMP生物合成和鈣離子結(jié)合等；由圖2-B可知，通過(guò)KEGG注釋，發(fā)現(xiàn)63個(gè)通路被注釋，14個(gè)主要通路，包括：嘌呤代謝、趨化因子信號(hào)通路和GnRH信號(hào)通路等。

2.3 莖環(huán)RT-qPCR試驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證微流體芯片的檢測(cè)結(jié)果，由圖3可知，隨機(jī)選取PC-esi-137-3p、PC-esi-14-5p、PC-esi-140-5p、PC-esi-229-3p、PC-esi-262-3p、PC-esi-33-3p、PC-esi-394-5p、PC-esi-433-5p、PC-esi-69-3p這9個(gè)明顯差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，利用莖環(huán)RT-qPCR法檢測(cè)miRNA的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明，這9個(gè)miRNA表達(dá)水平均上調(diào)，與微流體芯片結(jié)果一致。

3 討論

miRNA通過(guò)與靶標(biāo)基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)，抑制mRNA表達(dá)或直接裂解mRNA，調(diào)控各種生理和病理作用。miRNA也是至今研究最廣泛的一類非編碼RNA，已被證明在調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。因此，鑒定和篩選免疫相關(guān)的miRNA，解析其在宿主與病原體中的相互關(guān)系，將在疾病防控和抗病育種中發(fā)揮重要作用。在miRNA研究中，微流體芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，微流體芯片技術(shù)是高通量、特異性和敏感性強(qiáng)的一種基因鑒定和差異檢測(cè)方法，在動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫應(yīng)答等方面運(yùn)用較多。李升等選用不同月齡香豬的肝臟組織RNA，與微流體芯片雜交，結(jié)果表明不同月齡肝臟miRNA的表達(dá)水平存在差異。關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物研究，何耀東等利用微流體芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在注射自噬誘導(dǎo)劑后對(duì)蝦血淋巴中有15個(gè)miRNA明顯上調(diào)，17個(gè)miRNA明顯下調(diào)，表明相關(guān)差異表達(dá)miRNA在白斑綜合癥病毒(WSSV)侵染對(duì)蝦的過(guò)程中發(fā)揮作用?，F(xiàn)今，微流體芯片技術(shù)，因其具有微量化、快速、高通量等特點(diǎn)，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用到癌癥、微生物和營(yíng)養(yǎng)等多個(gè)領(lǐng)域研究中。隨著微流體芯片的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用，將極大促進(jìn)功能性調(diào)控miRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定，為進(jìn)一步研究免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

中華絨螯蟹屬于無(wú)脊椎動(dòng)物，完全依賴先天免疫(包括細(xì)胞和體液免疫)，而缺乏適應(yīng)性免疫來(lái)抵御細(xì)菌和病毒等。甲殼動(dòng)物血細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞，在宿主的先天免疫活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，包括識(shí)別、吞噬、黑化、細(xì)胞毒性和細(xì)胞間信號(hào)傳遞等。因此，識(shí)別和鑒定參與先天免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子(如非編碼RNA和轉(zhuǎn)錄因子)至關(guān)重要。前期研究通過(guò)對(duì)正常和感染螺原體的血細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序分析，結(jié)合生物信息學(xué)分析，共鑒定出735個(gè)miRNA；在被螺原體侵染后，本研究發(fā)現(xiàn)228個(gè)miRNA表達(dá)量存在明顯差異，133個(gè)miRNA顯著上調(diào)，95個(gè)miRNA顯著下調(diào)。在此基礎(chǔ)上，本研究選擇微流體芯片和莖環(huán)RT-qPCR技術(shù)，對(duì)細(xì)胞免疫相關(guān)miRNAs進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選鑒定與驗(yàn)證。由于μParaflo?微流體芯片相比于傳統(tǒng)點(diǎn)樣芯片具有更可靠、準(zhǔn)確和靈活特點(diǎn)，本研究利用該技術(shù)鑒定出中華絨螯蟹血細(xì)胞miRNA共303個(gè)；健康組和試驗(yàn)組共表達(dá)miRNA有48個(gè)，其中，差異顯著miRNA為27個(gè)(占比56.25%)；差異極顯著miRNA為6個(gè)(占比12.50%)。隨機(jī)選擇9個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行莖環(huán)RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致，說(shuō)明芯片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

近年，隨著測(cè)序成本的下降和技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNA在蝦蟹免疫調(diào)控中發(fā)揮作用的研究已較為廣泛。Ou等研究發(fā)現(xiàn)，pcl-miR-34、pcl-miR-7、PN-pcl-let-7、pcl-miR-1和pcl-miR-2b在克氏原螯蝦應(yīng)對(duì)螺原體侵染過(guò)程中發(fā)揮著積極作用，且在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中高度保守。Bao等研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-589-5p在凡納濱對(duì)蝦可調(diào)節(jié)抗WSSV免疫應(yīng)答中血藍(lán)蛋白的表達(dá)。Soo等發(fā)現(xiàn)，bta-miR-4286、dre-miR-107b 在斑節(jié)對(duì)蝦()應(yīng)對(duì)副溶血弧菌侵染過(guò)程中與對(duì)肌蛋白基因表達(dá)、鈣濃度有調(diào)控作用。本研究通過(guò)利用3款分析軟件“miRanda、PITA和TargetScan”對(duì)差異顯著的27 個(gè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，取三者交集，共得到78個(gè)靶基因，涉及多個(gè)重要免疫通路，其中，()、()、和等多個(gè)靶基因是參與免疫調(diào)控的重要免疫因子。

酚氧化酶(proPO)系統(tǒng)是無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫的重要組成部分之一，過(guò)氧化物酶可與proPO相關(guān)的細(xì)胞黏附因子相互作用來(lái)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。免疫缺陷同系物(immune deficiency homolog，IMD)信號(hào)通路是調(diào)節(jié)甲殼動(dòng)物固有免疫的主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而Relish是IMD信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，Bai等發(fā)現(xiàn)，Relish參與了中華絨螯蟹對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的免疫防御過(guò)程；Zhang等發(fā)現(xiàn)，Relish在克氏原螯蝦中能誘導(dǎo)基因的表達(dá)；絲裂原激活的蛋白激酶途徑(MAPK)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白來(lái)發(fā)揮調(diào)控功能，如細(xì)胞分化、凋亡、增殖和免疫反應(yīng)。筆者所在課題組前期運(yùn)用RNA-seq測(cè)序技術(shù)，結(jié)合本研究的微流體芯片技術(shù)，全面分析了正常和感染螺原體的中華絨螯蟹血細(xì)胞mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示，許多免疫相關(guān)miRNA及其靶基因均表達(dá)顯著差異。它們參與了一些典型免疫相關(guān)途徑，包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑、VEGF信號(hào)途徑、Wnt信號(hào)途徑、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、MAPK信號(hào)途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑和溶酶體途徑。

本研究同時(shí)通過(guò)對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行了GO和KEGG功能分析，共注釋到116個(gè)GO通路和63個(gè)KEGG通路，主要集中于宿主的多種酶活性、代謝和免疫通路等，包括細(xì)胞免疫涉及的包囊、結(jié)節(jié)形成和吞噬作用，與體液免疫涉及的酚氧化酶激活系統(tǒng)(proPO系統(tǒng))、凝血級(jí)聯(lián)和抗菌肽(AMP)的合成等。以上研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入研究中華絨螯蟹免疫機(jī)制提供科學(xué)理論依據(jù)，為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物蝦蟹該疫病的綜合防控奠定基礎(chǔ)。